颗粒细胞在玻璃化冷冻中对卵母细胞的影响

目的 采用开放式拉细麦管(open pulled straws，OPS)法玻璃化冷冻技术，探讨卵丘颗粒细胞对未成熟卵母细胞冻融后存活率及其发育能力的影响。方法 小鼠生殖泡期卵丘-卵母细胞复合物(COC)或完全去颗粒细胞后的裸卵(DO)用OPS法玻璃化冻存，复苏后行体外成熟培养(IVM)；COC直接行IVM作为对照组。结果 COC及裸卵冻融后存活率(分别为69．49％、77．90％)、成熟率(分别为56．10％、56．74％)无显著性差异，但成熟率均显著低于对照组(82．28％)。结论 在未成熟卵的玻璃化冷冻中颗粒细胞对卵母细胞冻存无保护作用。     

不同冷冻载体对小鼠成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

目的:探讨玻璃化冷冻小鼠成熟减数第二次分裂中期(MⅡ期)卵母细胞的最佳冷冻载体及冷冻方法。方法:用乙二醇和蔗糖为玻璃化冷冻保护剂,将小鼠成熟MⅡ期卵母细胞分为冻融、暴露和对照组。冻融组分别采用普通麦管、封闭式拉细麦管(CPS)和开放式拉细麦管(OPS)作载体,采用玻璃化快速冷冻和快速复温的方法冻存小鼠成熟卵母细胞;暴露组卵母细胞仅暴露在冷冻和复苏液中,不进行冷冻;对照组卵母细胞不接触冷冻和复苏液。观察各组处理后卵子回收、受精、卵裂等情况。结果:冻融组普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞回收率分别为92.0%、92.3%和72.3%,OPS处理卵母细胞的回收率显著低于普通麦管和CPS处理的卵母细胞(P<0.001);普通麦管、CPS和OPS处理的卵母细胞复苏存活率分别为43.5%、72.2%和76.5%,CPS和OPS处理卵母细胞的复苏存活率显著高于普通麦管组处理的卵母细胞(P<0.001)。冻融、暴露和对照组的卵裂率分别为38.6%、69.2%和73.5%,冻融组显著低于暴露和对照组(P<0.001)。结论:CPS法在玻璃化冷冻保存成熟的卵母细胞方面有价值。     

叶酸在玻璃化冷冻中对小鼠卵母细胞的影响

目的探讨叶酸对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的影响。方法将卵母细胞随机分为新鲜组、玻璃化冷冻组、叶酸低、中、高剂量(50、100和200mg/L)组。比较各组卵母细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)含量、活性氧(ROS)水平以及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果低、中、高剂量的叶酸均可增加卵母细胞内GSH含量(F=23.814,P<0.01),降低卵母细胞内ROS水平(F=11.209,P<0.01),提高卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率(χ2=124.815、21.117、15.172和9.834,P<0.05)。结论叶酸对玻璃化冷冻卵母细胞具有保护作用,可能与其抗氧化作用相关。     

左卡尼汀对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞体外受精结局的影响

目的：研究左卡尼汀对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。方法：将卵母细胞分为新鲜组（存活卵数243个）,玻璃化冷冻组（解冻卵数282个）,左卡尼汀高、中、低剂量（2．0、1．0、0．5 g／L）组（解冻卵数分别为285、280和279个）。观察各组卵母细胞中GSH含量、ROS水平以及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率。结果：5组卵母细胞GSH含量、ROS 水平及卵母细胞存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均有统计学意义（ F ＝881．290、182．760及χ2＝113．361、21．560、16．660、9．667,P均＜0．05）。与新鲜卵母细胞比较,玻璃化冷冻卵母细胞中GSH含量降低,ROS水平升高,卵母细胞存活率、受精率、卵裂率均降低（ P＜0．05）。左卡尼汀呈剂量依赖性地增加玻璃化冷冻卵母细胞中GSH含量,降低ROS水平（P＜0．05）;高剂量左卡尼汀可明显改善玻璃化冷冻卵母细胞的存活率（ P＜0．05）。结论：左卡尼汀可通过抗氧化作用改善玻璃化冷冻卵母细胞的结局。     

冷冻载体对小鼠卵母细胞玻璃化冷冻效果影响的研究

目的探讨不同冷冻载体对小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻回收率、复苏率和解冻后胚胎发育潜能的影响。方法以小鼠卵母细胞为实验材料,以玻璃化冷冻方法冻存小鼠卵母细胞,分别以冷冻叶片（A）组、冷冻小钩（B）组、电镜铜环（C）组、自制冷冻叶片（D）组为冷冻载体冷冻小鼠卵母细胞,通过对解冻后卵子回收率、复苏率、卵子受精率及早期胚胎发育率等分析判断冻存效果。结果回收率D组明显低于其他3组,差异有统计学意义（P〈0.01）;D组与其他3组卵母细胞冷冻保存后卵子复苏率、胚胎受精率、继续发育潜能的比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论 4种玻璃化冷冻载体都是小鼠卵母细胞快速玻璃化冷冻保存中可行的冷冻载体,自制叶片组的卵子回收率明显低于其他3组,需更进一步熟练叶片制作的技术和实验人员操作技能。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

3种不同载体对卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

目的以小鼠成熟卵母细胞(MⅡ期)为试验对象,应用3种不同载体对其行玻璃化冷冻,旨在分析载体对冷冻效果的影响。方法采用玻璃化冷冻技术冻存昆明种小鼠成熟卵母细胞,设新鲜对照组和玻璃化冷冻组,玻璃化冷冻组又分为开放式脉管(OPS)组、自制麦管组和Cryoleaf组。比较冻融后鼠卵的存活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果新鲜对照组和玻璃化冷冻组的受精率、卵裂率差异无统计学意义,但囊胚形成率差异有统计学意义(P<0.05);OPS组与自制麦管组的鼠卵存活率、受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;OPS组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义;自制麦管组与Cryoleaf组比较,存活率差异有统计学意义(P<0.05),而受精率、卵裂率、囊胚形成率差异均无统计学意义。结论载体的不同会对卵母细胞玻璃化冷冻效果形成一定程度的影响。     

小鼠卵母细胞程序化和玻璃化冷冻效果的比较

目的 本实验通过建立小鼠的实验模型,比较程序化和OPS玻璃化冷冻效果,探讨卵子冷冻的具体方法 ,为卵子冷冻技术应用于临床提供实验依据.方法 通过促排卵获取小鼠MII期卵母细胞,随机分组,观察不同冷冻方法 、高浓度的冷冻保护液,对卵子的成活及进一步发育潜能的影响;不同的IVF前培养时间对冻融卵子的受精及继续发育的影响.结果 (1)OPS玻璃化冷冻组与程序化冷冻组的存活率、受精率、卵裂率及6-8cell胚形成率均无显著差异.(2)玻璃化冷冻组与暴露组的卵母细胞存活率分别为35.3%,100%,有显著性差异(P＜0.05).暴露组与对照组比较的受精率、卵裂率,无显著性差异(P＞0.05).而暴露组与对照组的6-8cell的胚形成率分别为41%,63%,两组比较,有显著差异(P＜0.05).(3)无论OPS玻璃化冷冻法还是程序化冷冻法,冻融后的培养2 h组和培养1 h组的,受精率、卵裂率,两组比较,均有显著性差异(P＜0.05).结论 本实验证实,OPS玻璃化冷冻法至少可以达到程序化冷冻法同样的效果,而OPS玻璃化冷冻法有好于程序化冷冻法的趋势.加之,其简便、省时、经济等优点,因而,更有发展前景.     

人卵母细胞冷冻研究进展

玻璃化冷冻技术是目前最有效的卵母细胞冷冻方法,已广泛应用于女性生育力保存。不同医学中心卵母细胞冷冻成功率的差异较大,女性年龄、卵母细胞成熟度及其冷冻方法、冷冻载体和冷冻保存时间是影响卵母细胞冷冻临床结局的主要因素。由于成熟卵母细胞具有体积大、表面积体积比小、含水量高、细胞内含物特殊和存在减数分裂纺锤体的特点,其在冷冻复苏过程中极易发生冷冻损伤。卵母细胞冷冻保存与产科和围生期并发症的发生率升高无关,但仍需密切关注其子代安全。     

玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞的影响

目的：通过比较玻璃化冷冻对不同成熟阶段小鼠卵母细胞冷冻复苏、体外成熟、胚胎发育及细胞骨架的影响,寻求最佳的卵子冷冻方案。方法：玻璃化冷冻生殖泡期卵（GV）、成熟中期卵（MⅡ）及体外成熟卵（IVM-MⅡ）,解冻复苏后,分别作体外成熟、体外受精（IVF）、胚胎培养或固定作免疫荧光标记,统计复苏率、成熟率、受精率、囊胚率、细胞骨架正常率。结果：GV冷冻组、MⅡ冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组复苏率差异无显著性（65%vs 60.92%vs 69.93%,P〉0.05）。GV冷冻组的成熟率显著低于对照组（79.6%vs 96.19%,P〈0.01）。GV冷冻组、MII冷冻组及IVM-MⅡ冷冻组三组受精率均明显低于对照组（P〈0.01）,且IVM-MⅡ冷冻组受精率显著低于MⅡ冷冻组（18.06%vs 31.34%,P〈0.01）。IVM-MⅡ冷冻组囊胚率低于MⅡ冷冻组和对照组,差异均有显著性（28.57%vs 52.38%,P〈0.05;28.57%vs 57.14%,P〈0.01）。GV冷冻组染色体和纺锤体均正常率均高于IVM-MⅡ冷冻组（53.85%vs 26.67%,P〈0.05）。IVM-MⅡ冷冻组细胞骨架三项指标均显著低于对照组,差异均有显著性（P〈0.05,P〈0.01）。结论：GV卵先玻璃化冷冻再体外成熟,其细胞骨架损伤较小,胚胎发育较好。     

细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响

 【目的】探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法（GMP）玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响。【方法】以小鼠MII期卵母细胞为模型，研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响；随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育。【结果】与对照组相比．细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异（89．3％vs91．3％．44．0％vs40．4％，30．0％vs27．7％，4．0％vs6．4％；P〉0．05）；采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法（57．4％vs40．4％；P〈0．05），且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高f40，2％vs27，7％，14．5％vs6．4％；P〉0．05）。冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞（17．1％vs3．2％；P〉0．05）。【结论】细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响：采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力。     

不同成熟时期山羊卵母细胞冷冻保存研究

目的比较山羊卵母细胞在不同成熟时期解冻后体外成熟、体外受精及胚胎发育能力。方法收集山羊生殖泡（GV）期未成熟卵和成熟卵,分5组行开放式拉细麦管（OPS）法玻璃化冷冻,Ⅰ组：直接冷冻GV期卵;Ⅱ组：GV期卵在体外培养（IVC）8h后冷冻;Ⅲ组：GV期卵在IVC16h后冷冻;Ⅳ组：GV期卵体外培养成熟（IVM）后冷冻;Ⅴ组：直接冷冻体内成熟卵。解冻后比较各组卵受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率。结果Ⅰ组（GV期卵）冷冻解冻后存活率达56.8%,显著高于Ⅱ组（33.3%）、Ⅲ组（31.6%）、Ⅳ组（28.9%）及Ⅴ组（30.4%）,差异有高度统计学意义（均P〈0.01）。各组体外受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论采用OPS法玻璃化冷冻山羊GV期卵较冷冻其他成熟时期卵效果好。     

不同冷冻方法对胎儿卵巢组织早期卵泡的影响

目的观察不同冷冻方法对胎儿卵巢组织早期卵泡的影响。方法分别采用程序冷冻法(PFG)、快速冷冻法(RFG)、玻璃化冷冻法(VG)冻存胎儿卵巢组织,解冻后进行光镜、电镜观察。结果光、电镜组织形态学观察发现冻后各组卵泡结构均存在一定程度的冷冻损伤。冷冻后的胎儿卵巢内形态正常的卵泡数明显下降,在2 mm×2 mm×1 mm的卵巢皮质内,形态正常的卵泡数在PFG、RFG、VG及新鲜对照组(FCG)中分别为(992.3±618.2)个、(542.8±202.5)个、(1604.8±964.0)个和(1888.2±645.3)个。RFG卵泡数显著低于FEG与VG(P<0.05),但与PFG间差异无统计学意义(P>0.05)。结论三种冷冻方法均可有效冻存胎儿卵巢组织,其中玻璃化法对卵巢内早期卵泡的损伤最小,单位体积内保存的卵泡数最多。     

不同浓度保护剂及渗透平衡时间对慢速冷冻小鼠卵母细胞活力的影响

目的探讨不同的冷冻保护剂浓度、渗透平衡时间对小鼠卵母细胞冷冻后存活率及存活卵母细胞ICSI受精后胚胎发育潜能的影响。方法小鼠卵母细胞来自用HMG/HCG刺激的性成熟小鼠,依据预平衡液浓度,即1.0M或1.5M丙二醇(PROH),将卵母细胞分为A、B组,依据装载液蔗糖浓度(0.1、0.2、0.3M)的不同将A、B两组分为A1、A2、A3、B1、B2、B36组;依卵母细胞在平衡液中的渗透平衡时间不同(<10min、>20min)分为C、D两组;依装载液中的渗透平衡时间不同(<10min、>30min)分为E、F两组。卵母细胞在预平衡液中渗透平衡10~20min,在装载液中渗透平衡5~30min后进入慢速程序化冷冻并保存,快速解冻后观察卵母细胞存活率I、CSI受精率和优质胚胎形成率。结果A、B组间冻存卵母细胞存活率差异有非常显著性统计学意义(43.7%vs 23.5%);A2组的卵母细胞存活率最高(52.5%),A3组次之(42.9%);C、D两组间冻存卵母细胞存活率、透明带破裂率差异无统计学意义。E、F两组间存活率、透明带破损率差异有统计学意义(52.5%vs6.3%;6.6%vs 75.0%);新鲜组和冷冻组卵母细胞受精率、卵裂率、优质胚胎率差异均有统计学意义(81.8%vs 40%;77.3%vs 100%;90.9%vs 83.3%)。结论(1)在慢速冷冻中,平衡液较低的PROH浓度(1.0M)和装载液较高的蔗糖浓度(0.2M)有益于卵母细胞冻存存活率的提高。(2)小鼠卵在平衡液中的渗透平衡时间以10min为宜;在装载液中室温下的渗透平衡时间以5~10min为宜,最好不要超过15min。(3)冻存复苏后的存活卵经ICSI受精后受精率下降,但受精后胚胎的发育潜能似乎未受多大影响。     

First Babies from Cryopreserved Oocytes in Hungary

Embryo cryopreservation (CP) is a well established technique and it has been widely used for years with good results on the field of human assisted reproduction. Oocyte CP offers more advantages compared with embryo freezing with regarding ethical, legal …     

Effect of Incubation Temperature and Warming Solutions on the Viability and Maturation of Vitrified-thawed Human Immature Oocytes

Objective To investigate the viability and maturation of frozen-thawed human immature oocytes exposed to different temperature of vitrification and warming solutions. Methods The immature oocytes in germinal vesicle (GV) and matephase I (MI ) stages were collected from our ICSI patients and exposed to different temperature of vitrification and warming solutions before frozen in the freezing/thawing procedures. The different temperature groups were as follows: Group A, equilibration solution at 37℃, vitrification solution at room temperature, warming solution at 37℃; Group B, both vitrification and warming solution at room temperature; Group C, both vitrification and warming solutions at 37℃; Group D, the frozen-thawed oocytes and the fresh oocytes were cultured for in vitro maturation. The survival rate and maturation rate were compared among groups. The oocytes were examined using immunofluorescent stainingand confocal microscopy to check the spindle configuration and chromosome arrangement. Results The survival rates and MII rates of GV stage oocytes in groups A, B, C were 100%(15/15), 81.3%(13/16), 68.8%(11/16) and 33.3%(2/6), 83.3%(10/12),72.7%(8/11), respectively. The survival rate of group C was significantly lower than that of the control (P<0.05). The normal spindle and chromosome configuration were only observed in group B, with the rates of 20% (2/20) and 10% (1/10), respectively. The survival rates of MI stage in groups A, B, C were 71.4%(10/14), 100% (12/12) and 83.3%(10/12), no significantly difference from that of the contro1(100%, 14/14). The MII rates of MI stage in groups A, B and C were 0%(0/14), 66.7%(8/12) and 80% (8/10), respectively. The MⅡ rate in group A was significantly lower than that in other groups (P<0.01). Only one oocyte in group C was found with normal spindle and chromosome configurations. Conclusion The appropriate operation temperature of vitrification and warming solutions can improve the outcomes of the vitrified-thawed human immature oocytes.     

FSH干预对小鼠玻璃化冻融移植卵巢血流重建的影响

目的观察小鼠卵巢玻璃化冻融中卵泡刺激素（FSH）干预对移植48h卵巢血流重建的影响及相关机制。方法将4周龄C57BL/6J小鼠卵巢分为新鲜对照组（FCG）、玻璃化冻存对照组（VCG）,0.3IU·mL-1FSH干预玻璃化冻存组（FSH-VG）,采用卵巢异体肾被膜下移植技术,于移植48h通过卵巢形态学观察、荧光血管灌注、EdU检测细胞增殖情况、免疫组织化学及western-blot方法观察并分析血流重建的影响因素。结果小鼠玻璃化冻融卵巢移植48h,与VCG比较,FSH-VG血流灌注较广,且达到卵巢近中央部;FSH-VG组正常卵泡百分比明显高于VCG组（P〈0.01）,VCG组闭锁卵泡百分比明显高于FSH-VG组（P〈0.01）,增殖细胞主要为卵巢间质细胞。FSH-VG组CD34、PCNA蛋白表达高于VCG（P〈0.01）。结论玻璃化冻融过程中的FSH干预可加速小鼠卵巢冻融后移植的血流重建,CD34及PCNA表达上调。     

不同激活方法对小鼠卵母细胞孤雌激活的实验观察

目的　建立合适的小鼠卵母细胞孤雌激活方法。方法　取不同卵龄小鼠卵母细胞 ,运用不同浓度的氯化锶和不同强度的电脉冲对其进行活化 ,观察小鼠卵母细胞激活率和体外发育状况。结果　① 14、16和 18h卵龄组卵母细胞经 10mmol LSrCl2 处理后 ,三组的激活率随卵龄的增长而提高 ,分别为 2 1 1%、4 1 8%和 73 7% ,组间差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ;卵母细胞离体后在激活前体外培养 3h也能提高其激活率 ,但当卵龄达到一定时 (18h) ,体外培养激活率不再提高。② 5 0、10 0、15 0mmol L三种浓度的SrCl2 均能有效地激活小鼠卵母细胞 ,激活率分别为 5 8 5 %、6 8 95和 70 9% ,与对照组和 1 6mmol L组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。③卵母细胞的激活率随处理时间的延长而提高 ,30、6 0、12 0、2 4 0minSrCl2 处理时间的激活率分别为 4 4 9%、5 6 1%、6 8 9%、77 0 % ,相隔两组之间差异有统计学意义 (P <0 0 5 )。④ 1 5kV cm ,16 0 μs和 1 0kV cm ,32 0 μs脉冲刺激下的卵母细胞激活率显著高于 1 8kv cm ,90 μs脉冲刺激组 (5 8 5 %vs2 7 1%、6 9 1%vs2 7 1% ,P <0 0 5 ) ,前两组之间差异无统计学意义 (P >0 0 5 )。结论　小鼠卵母细胞孤雌激活率与卵龄和激活方案有关 ;氯化锶浓度、作用时间和