脑溢安颗粒对实验性大鼠脑出血后神经干细胞增殖的影响

目的:探讨中药脑溢安颗粒对脑出血后神经干细胞反应的影响。方法:72只雄性SD大鼠单纯随机分为假手术组、模型组、脑溢安组,采用Rosenberg方法复制大鼠脑出血模型,分别给予不同处理,于术后1,12h,1,3,5,7d处死动物,运用免疫组织化学,Westernblot方法检测脑出血后各组的nestin表达。结果:脑出血后,nestin阳性细胞增多,1d达高峰,然后逐渐降低,维持到第7天,nestin阳性细胞主要分布在海马、皮质区,且脑溢安组与模型组1d前各时间点差异无显著性意义(P>0.05),3d后各时间点差异有显著性意义(t分别为3.081,8.034,5.833,P<0.05～0.01);nestin蛋白表达有相同趋势。结论:正常脑组织中存在一定数量的神经干细胞,脑出血后神经干细胞被激活增殖,中药脑溢安能维持促进增殖,这种作用可能是通过调节细胞外因子来实现。     

脑溢安颗粒对脑出血大鼠脑组织病理改变及一氧化的屡生成的影响

目的：探讨脑溢安颗粒（简称脑溢安）治疗脑出的作用机制。方法：立体定位内囊注射胶原酶（ＶＩＩ型）诱导大鼠脑出血模型,Ｇｒｉｅｓｓ法检测血肿周围大脑皮质内一氧化氮（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ,ＮＯ）含量,光镜观察脑组织现理改变。结果：模型组大鼠大脑皮质ＮＯ含量显高于手术对照组（Ｐ〈０．０１）,脑溢安组大鼠大脑皮质ＮＯ含量模型组相应时间点明显降低（Ｐ〈０．０１）。结论：脑溢安可能通过减少脑内ＮＯ产生,对脑出血损伤发挥保护作用。     

脑溢安对脑出血大鼠脑内BDNFm RNA表达的影响

目的 观察脑出血模型大鼠脑内脑源性神经营养因子mRNA（BDNF mRNA）的分布以及中药脑溢安对其影响。方法 通过微量注射器向苍白球内注入Ⅶ型胶原酶0．4u制作脑出血模型，用原住杂交法观察脑出血后2、6、12h和l、4、7d共6个时间点BDNF mRNA的表达变化．以阳性细胞计数作为观察指标。结果 正常组、假手术组大鼠脑内皮质、海马、纹状体等处有BDNFmRNA的表达。脑出血后2h上迷部位BDNFIrIRNA的表达增高，但血肿中心区域未见表达信号，6h后上述部位表达信号继续增强，ld后达高峰，4d后表达开始减弱，7d后其表达水平继续下降但仍高于正常，14d后BDNFmRNA阳性细胞数量厦表达水平降至基础水平。两者的阳性细胞主要表达于神经元，其中在6h、1d,4d3个时间点上，两组阳性细胞计数比较有显著性差异（P〈0.01）。结论 脑溢安可促进脑出血后BDNF mRNA的表达。     

中药脑溢安改善脑出血大鼠神经元有氧化谢的药效机制

目的 通过观察脑出血大鼠诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）在星形胶质细胞中的表达及中药脑溢安的影响，探讨脑出血的机制和中药的脑保护作用。方法 100只动物按数字表法随机分成假手术组（25只）、手术组（75只）。其中手术组造模后又随机分入模型组、脑溢安治疗组、AG治疗组，每组25只。采用胶原酶复制大鼠脑出血模型，以免疫荧光双标组化法和蛋白质印迹法观察脑出血后iNOS的表达情况。结果 脑出血后，模型组大鼠表达iNOS的反应性星形胶质细胞主要是分布在基底核血肿上部周边；蛋白印迹结果明显，模型组大鼠基底核区iNOS从12h，1d阳性信号逐渐增强（t=15.3，P&;lt;0.01），4d达峰值（t=36.4，P&;lt;0.01），7d信号稍弱（t=27.73，P&;lt;0.01）；脑溢安组和氢基胍组的阳性信号较前者弱。结论 脑出血后，患侧基底核反应性星形胶质细胞中的iNOS表达增强；脑溢安可能通过抑制星形胶质细胞中的iNOS表达，实现其脑保护作用。     

脑溢安对大鼠海马神经干细胞分化的影响

目的：应用血清药理学方法研究脑溢安对体外培养促神经干细胞的分化作用，旨在进步阐明脑溢安的脑保护机制。方法：从新生3d大鼠海马中分离神经干细胞，按不同培养方法进行分组，加神经干细胞基础培养液为空白组。于神经干细胞基础培养液中加50mL／L脑溢安血清为实验组。于神经干细胞基础培养液中加50mL／L正常血清为对照组。加入含50mL／L脑溢安血清的培养基中培养。在培养的第2天和第7天，用免疫细胞化学法计数Nestin，NF-200，GFAP，04四类免疫阳性细胞的变化。结果：在培养的第2天，空白组Nestin阳性细胞最多，占数细胞总数的96．1％是实验组和对照组的8～11倍，其次是胶原纤维酸性蛋白细胞(glialfibrillery acidic protein，GFAP)、04细胞，NF-200细胞最少，仅占细胞总数的3．83％；实验组以NF-200阳性细胞最多，占细胞总数的42．83％，分别为空白组11．3倍和对照组的1．2倍，其次是GFAP细胞，但较对照组少。培养的第7天，空白组仍以Nestin阳性细胞为最多，其他三类细胞与第2天比较无明显差异；实验组仍以NF-200为最多，占细胞总数的43．85％，其次是GFAP，04细胞，Nestin细胞最少。培养7d后，实验组细胞的凋亡率(4．85％)与对照组(15．32％)比较差异有显著性意义(x^2=6．04，P&;lt;0．05)。结论：脑溢安具有促进神经干细胞向神经元方向分化及促进神经细胞存活的作用。     

脑康Ⅱ号对新生大鼠海马神经干细胞增殖分化的影响

目的 探讨脑康Ⅱ号含药血清对体外培养大鼠海马神经干细胞(NSCs)增殖分化作用的影响.方法 用无血清DMEM/F12[含20 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)及B27]体外培养新生Wistar大鼠海马NSCs,在NSCs分化过程中添加大、中、小剂量(分别为2.0、1.0、0.5 kg/L)脑康Ⅱ号含药血清进行干预,以免疫荧光及细胞化学方法对NSCs及其分化后的细胞进行鉴定.结果 从新生大鼠海马分离培养的NSCs能够表达巢蛋白,并具有分化为神经元和星形胶质细胞的能力;5 d时,脑康Ⅱ号各剂量组神经球突起长度均显著长于对照组(P<0.05或P<0.01);与对照组比较,脑康Ⅱ号各剂量组细胞分化为神经元或星形胶质细胞率均明显升高(P<0.05或P<0.01).结论 脑康Ⅱ号可促进NSCs向神经元方向分化,并对所分化的神经元样细胞有促生长、发育作用.     

脑溢安对新生大鼠海马神经干细胞缺氧损伤及白介素-6和白介素-6mRNA表达的影响

目的:探讨中药脑溢安对神经干细胞缺氧损伤的保护作用机制。方法:体外培养神经干细胞来自新生3—5天的SD大鼠海马组织,将神经干细胞移入厌氧培养箱(37℃、95%N2和5%CO2)内培养6h造缺氧损伤,用免疫组化及原位杂交技术研究脑溢安对缺氧损伤神经干细胞及白介素-6(IL-6)和IL-6mRNA表达的影响。结果:脑溢安能促进缺氧损伤神经干细胞存活;缺氧损伤后神经干细胞内IL-6和IL-6mRNA表达增强,脑溢安血清组IL-6及IL-6mRNA表达显著高于模型组和正常血清对照组(P<0.01)。结论:脑溢安可能通过增强IL-6和IL-6mRNA的表达发挥其对缺氧损伤神经干细胞的保护作用。     

褪黑素对EGF作用后神经干细胞增殖的影响

目的：研究褪黑素对体外培养、EGF诱导后神经干细胞分化和增殖的影响。方法；取胚胎13d SD大鼠纹状体行神经干细胞培养，分别加入表皮生长因子（EGF）、EGF＋褪黑素（MT）、MT和空白对照组。培养7d的神经干细胞球胰酶消化成单细胞悬液再培养，分别加入EGF、MT、EGF、M和空白对照组。结果：EGF、EGF＋MT组原代培养的纹状细胞在第二天即可观察到细胞出芽、增殖，7d可见大量细胞克隆，两组之间细胞克隆的数量和大小没有明显差别；MT组和对照组相比无明显变化。传代再培养后，EGF、EGF＋MT和MT组第二天即可观察到细胞再增殖，3d即形成大量的细胞克隆，此三组之间相比细胞克隆数量没有明显变化；空白对照组没有见到任何细胞增殖，但可见细胞分化成神经细胞和星形胶质细胞。结论：褪黑素能够诱导EGF刺激后的神经干细胞增殖。     

脑出血大鼠应用脑溢安后脑内多唾液酸神经细胞黏附分子的表达

目的：多唾液酸神经细胞黏附分子是发育阶段神经干细胞膜上特异表达的糖蛋白，观察脑出血后其在脑内的表达与中药脑溢安干预的关系。方法：实验于2004—09／11在中南大学湘雅医院中西医结合科实验室完成。125只SD大鼠随机分为正常对照组5只，假手术组40只，模型组40只，脑溢安组40只。模型组和脑溢安组用Ⅶ型胶原酶诱导大鼠脑出血建立模型，假手术组用生理盐水代替Ⅶ型胶原酶，正常对照组不造模。给药：正常对照组与模型组不给药，假手术组颅内注射2μL生理盐水，脑溢安组行脑溢安浸膏（主要含钩藤、大黄、丹皮、地龙等）灌胃，2mL／次，2次／d。假手术组、模型组、脑溢安组分别于术后1，3，5，7，10，14，21，28d8个时间点将大鼠麻醉后分批处死5只，取脑组织切片进行多唾液酸神经细胞黏附分子的免疫组化观察，以阳性细胞数作为观察指标。结果：125只大鼠全部进入结果分析。①正常对照组和假手术组术后1，3，5，7，10，14，21，28d均无多唾液酸神经细胞黏附分子阳性表达。②脑溢安组及模型组大鼠均于术后5d在血肿区出现多唾液酸神经细胞黏附分子阳性表达，7d达高峰，10d开始下降，至术后28d多唾液酸神经细胞黏附分子阳性显色逐渐减少，并完全集中在血肿近侧脑室及海马处，两组变化趋势相同，阳性表达均高于正常对照组。③术后14d脑溢安组多唾液酸神经细胞黏附分子阳性细胞计数开始多于模型组（t=2．984，P=0．017），至28d仍显著高于模型组（t=-3．99，P=0．004）。结论：脑出血大鼠术后5d血肿区出现多唾液酸神经细胞黏附分子，呈阳性表达，证明其脑内存在神经干细胞重塑。通过强化此种重塑可能是脑溢安促进脑出血后神经功能恢复的途径之一。     

HD02对前脑缺血大鼠神经干细胞增殖分化蛋白的作用

目的 观察神经干细胞(neural stem cell，NSC)增殖分化相关蛋白Notehl、hes5、MashI、NeuroD在HD02促进慢性前脑缺血大鼠NSC增殖分化中的作用。方法 雄性SD大鼠30只，分为正常对照组(6只)、模型对照组(12只)、HD02组(12只)，后两组又分成缺血后15，30d小组，每组各6只，制作SD大鼠前脑缺血模型，利用Western blot方法检测NSC增殖分化相关蛋白变化。结果 与正常对照组比较，造模后15，30d、慢性前脑缺血大鼠Nsc增殖分化相关蛋白表达水平显著升高(t=7．42—38．16，P&;lt;0．01)；与模型对照组比较，HD02可明显表达明显增加Notchl，hes5，Mashl，NeuroD表达水平(t=3．17—36．55,P&;lt;0．05或P&;lt;0．01)。结论 HD02能增加慢性前脑缺血大鼠NSC增殖分化相关蛋白表达，这可能与HD02促进NSC增殖分化有关。     

脑溢安颗粒对脑出血大鼠脑组织病理改变及一氧化氮生成的影响

目的探讨脑溢安颗粒(简称脑溢安)治疗脑出血的作用机制.方法立体定位内囊注射胶原酶(Ⅶ型)诱导大鼠脑出血模型,Griess法检测血肿周围大脑皮质内一氧化氮(nitricoxide,NO)含量,光镜观察脑组织病理改变.结果模型组大鼠大脑皮质NO含量显著高于手术对照组(P<0.01).脑溢安组大鼠大脑皮质NO含量较模型组相应时间点明显降低(P<0.01).结论脑溢安可能通过减少脑内NO产生,对脑出血损伤发挥保护作用.     

异丙酚对体外培养大鼠神经干细胞增殖的影响

目的：研究静脉麻醉药异丙酚对大鼠神经干细胞的体外增殖的影响。方法：从孕14.5d的胎鼠前脑分离培养神经干细胞;采用逆转录-聚合酶联反应（RT-PCR）检测GABAA受体亚基的表达情况;用不同浓度（0~0.05mM）的异丙酚处理大鼠神经干细胞,BrdU标记及非放射性细胞增殖（MTS）法检测细胞增殖能力变化,原位末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡情况,蛋白印迹技术检测凋亡执行蛋白多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的活化切割情况与细胞周期调控激酶Chk1与Chk2的磷酸化情况。结果：大鼠神经干细胞也表达部分GABAA受体亚基;异丙酚处理抑制大鼠神经干细胞增殖,但不影响细胞凋亡;异丙酚增强Chk1在317位丝氨酸的磷酸化,不影响345丝氨酸磷酸化,也不影响Chk2在68位苏氨酸的磷酸化。结论：异丙酚抑制体外培养的大鼠神经干细胞增殖,可能部分通过激活Chk1在317位丝氨酸磷酸化发挥作用。     

安脑丸对急性脑出血大鼠OX42、脑源性神经营养因子及突触素表达的影响

目的:观察安脑丸对大鼠脑出血后OX42、脑源性神经营养因子(BDNF)及突触素(SYN)表达的影响。方法:SD大鼠190只随机分为正常组10只,假手术组、模型组、安脑丸组各60只;后3组又随机分为造模后12h、1d、2d、4d、7d、10d共6个时间点,各10只。模型组制作脑出血模型,安脑丸组加用安脑丸灌胃。于各时间点采用免疫组化法及western blot法检测OX42、BDNF及SYN表达情况。结果:模型组及安脑丸组OX42及BDNF阳性细胞数及SYN、BDNF蛋白表达显著高于正常组及假手术组(P<0.01),安脑丸组OX42阳性细胞数显著少于模型组(P<0.01),BDNF阳性细胞数及SYN、BDNF蛋白表达显著高于模型组(P<0.01)。结论:小胶质细胞的激活、BDNF及SYN的表达与脑出血密切相关,安脑丸可显著减少脑出血后小胶质细胞的活化,增加BDNF及SYN的表达。     

盐酸二甲双胍对海马神经干细胞增殖的影响

目的:观察盐酸二甲双胍(Met)对海马神经干细胞(NSCs)增殖的影响。方法:采用体外悬浮培养法获得海马NSCs,加入不同浓度Met进行培养,通过巢蛋白(Nestin)免疫荧光法鉴定细胞、观察细胞增殖;CCK-8测定NSCs增殖。结果:体外培养NSCs高表达Nestin。Nestin与CCK-8检测结果显示,随着Met浓度从5μmol/L增加至10μmol/L,NSCs数量逐渐增加。当Met浓度为5μmol/L时,细胞增殖数目最多且细胞活力最好。随着Met浓度进一步增至20μmol/L,NSCs增殖能力逐渐下降。结论:在一定浓度范围内,Met能促进海马NSCs增殖。     

重复磁刺激对体外培养大鼠神经干细胞增殖作用的影响

目的探讨重复磁刺激(rMS)对体外培养大鼠神经干细胞（NSCs）增殖的作用机制。 方法取新生3天内的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠双侧海马组织培养NSCs,通过cck-8试剂盒检测第2代NSCs的OD值绘制生长曲线图。再将第2代NSCs分为空白对照组和rMS组,rMS组刺激参数为频率10Hz,50%最大输出强度,每天200个脉冲,连续刺激3d。于rMS组最后1次干预1h后收集2组细胞,采用cck-8试剂盒检测其细胞增殖效应,同时用免疫印迹法检测c-fos蛋白和环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(p-CREB)的表达量。 结果第2代神经球经巢蛋白(nestin)免疫荧光染色证实为NSCs,生长曲线提示培养第3天时NSCs活性最佳。rMS干预后,rMS组cck-8的OD值为（0.309±0.043）,与空白对照组的（0.256±0.043）比较,差异有统计学意义(P<0.05);rMS干预后,rMS组的c-fos和p-CREB蛋白相对表达量分别与空白对照组比较,差异均有统计学意义（P<0.01）。 结论频率10Hz的rMS可促进NSCs的增殖,其作用机制可能与p-CREB和c-fos蛋白表达的增加有关。     

HD02对新生大鼠海马神经干细胞增殖分化和细胞周期的影响

目的：观察HD02对新生大鼠体外培养神经干细胞(neural stem cell，NSC)增殖、分化和凋亡的影响。方法：分离、培养新生大鼠海马NSC，采用免疫荧光双标技术检测NSC增殖分化，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡变化。结果：HD02的中低剂量组BrdU阳性细胞数、BrdU+Nestin,BrdU+NeuroD，BrdU+NF200,BrdU+GFAR，BrdU+Oli阳性细胞数和S期细胞比率明显高于空白对照组和EGB761组(P&;lt;0．01)，G0／G1期比率(51．12&;#177;3．66)％明显低于正常对照组(68．23&;#177;3．30)％；细胞凋亡率(5．18&;#177;0．80)％与EGB761(4．98&;#177;0．40)％相比差异无显著性意义(P&;gt;0．05)，但却明显低于正常对照组(6．43&;#177;0．55)％(P&;lt;0．01)。结论：HD02能显著促进NSC增殖分化。其机制可能与缩短G0／G1期、减少凋亡、促进S期比率有关。     

脑溢安对脑出血肝阳化风证患者血浆内皮素和一氧化氮水平的影响

目的 :探讨脑溢安颗粒剂 (NYA)治疗脑出血的作用机制。方法 :6 5例急性脑出血患者随机分为 NYA组 (31例 )和西药组 (34例 )。分别采用 NYA或西药进行治疗 ,观察患者血浆内皮素 (ET)和一氧化氮 (NO)含量的变化及临床疗效。结果 :NYA组基本痊愈加显效率为 80 .6 % ,总有效率为 93.5 % ;西药组分别为 5 2 .9%及76 .5 %。急性期血浆 ET含量明显增高 ,NO含量明显降低 ;治疗 4周后 ,NYA组 ET和 NO基本恢复到正常范围。NYA组疗效明显优于西药组 (P<0 .0 1或 P<0 .0 5 )。结论 :NYA通过调节 ET和 NO水平来改善脑血管功能状态 ,这可能是其治疗脑出血的机制之一     

转化生长因子β对大鼠神经干细胞增殖和分化的调控作用

目的：研究转化生长因子β对新生(P0天)大鼠脑室管膜前下区(anterior subventricular zone,sVZa)神经干细胞增殖、迁移和分化的调控作用。方法：应用地高辛标记的cRNA探针核酸分子原位杂交技术显示新生大鼠脑内转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)的mRNA表达。结果：新生大鼠的脑内广泛表达TGF-β mRNA，尤以SVZa区经喙侧迁移流(rostral migratory stream，RMS)至嗅球的通路上最为明显，其强度又以SVZa区最强，阳性细胞数量最多，密度最大，RMS区域相对较弱，嗅球又见增多。细胞核和细胞质内均可见到阳性产物，但阳性产物主要沉积在胞核内。结论：SVZa区神经干细胞表达了较高含量的TGF-β，提示TGF-β参与了维持SVZa区神经干细胞的增殖状态，使SVZa区的神经干细胞处于适度稳定的增殖状态，而嗅球区表达量较高的TGF-β则可能主要参与促进细胞分化。     

高压氧对大鼠脊髓损伤后移植神经干细胞增殖分化的影响

目的：探讨高压氧（HBO）对大鼠脊髓全横断损伤后移植的神经干细胞存活、增殖及分化的影响。方法：成年健康SD大鼠20只,随机分为神经干细胞移植组（NSCs组）和HBO联合神经干细胞移植组（HBO＋NSCs组）各10只。2组均采用脊髓全横断损伤模型,术后均给予NSCs移植治疗,HBO＋NSCs组在移植后辅以HBO治疗。治疗后检测移植在脊髓损伤处的神经干细胞存活、增殖及分化的情况。结果：术后第28d,HBO＋NSCs组移植的神经干细胞存活数量显著多于NSCs组（P〈0．05）。2组大鼠的脊髓损伤处及其相邻的组织均可观察到较多移植的神经干细胞分化为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性染色细胞。HBO＋NSCs组中移植的神经干细胞分化为神经元特异性烯醇化酶（NSE）阳性染色细胞百分率显著高于NSCs组（P〈0．05）。结论：HBO能够促进大鼠脊髓损伤处移植的神经干细胞存活、增殖,并能促进这些细胞能分化为NSE阳性神经元。     

脑微血管内皮细胞对体外缺氧神经干细胞增殖及凋亡的影响

目的:观察脑微血管内皮细胞对体外培养缺氧神经干细胞增殖、凋亡的影响。方法:实验于1996-01/1996-12在佳木斯大学神经科学所完成。实验材料:同一基因背景新生的Wistar大鼠由哈尔滨医科大学实验动物学部提供(黑动字第99102001)。实验方法:①取新生24hWistar大鼠大脑培养神经干细胞,采用免疫组织化学方法鉴定神经干细胞。②取出生1～7dWistar大鼠大脑培养脑微血管内皮细胞,采用免疫细胞化学方法鉴定。③将培养传代纯化的脑微血管内皮细胞,用0.25%胰酶消化成单细胞液后接种于涂有多聚赖氨酸包被的盖玻片上,接种传3代后用胰酶消化的神经干细胞,以1∶10接种比例加入神经细胞完全培养液共培养。④用无菌石蜡油覆盖于低糖细胞培养液表面,制备低氧低糖溶液。对照组:正常神经干细胞置于37℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养。缺氧共培养组:取共培养3d细胞,吸出培养液,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次,加入低氧低糖溶液共同作用2,4,8,16h后换液,用PBS缓冲液冲洗3次后,换神经细胞完全培养液,置于细胞培养箱中复氧培养。缺氧单纯神经干细胞组:取传3代神经干细胞,用无菌Hank’s缓冲液清洗2次后,方法同上。实验评估:免疫组织荧光鉴定缺氧条件下神经干细胞的增殖与凋亡。结果:①免疫组织化学方法检测Nestin及Ⅷ因子相关抗原分别鉴定为神经干细胞及脑微血管内皮细胞。②对照组细胞胞体饱满,折光性强,周围有光晕。缺氧单纯神经干细胞组细胞胞体肿胀,折光性差,有大量细胞碎屑,仅有少量活细胞,并出现悬浮死细胞。缺氧共培养组细胞形态有所改善,细胞折光性仍较好,大部分细胞突起仍未见回缩,仅少数细胞肿胀,坏死。③随着缺氧时间的延长,细胞死亡明显增多,存活数明显下降。缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组与对照组(321.76±22.20,180.00±17.89,255.33±10.33,P<0.01)。④缺氧条件下脑微血管内皮细胞对神经干细胞增殖及凋亡的影响:缺氧共培养组细胞存活数明显高于缺氧单纯神经干细胞组,细胞凋亡细胞数低于缺氧单纯神经干细胞组(P<0.05)。结论:脑微血管内皮细胞可以促进缺氧神经干细胞的增殖、减少其凋亡。