大鼠骨髓间质干细胞体外分离培养及生物学特性研究

目的：建立大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)体外分离培养方法，并对大鼠MSCs的生物学特性进行研究。方法：分离5～8周龄的大鼠股骨骨髓进行体外培养，取5代以后的MSCs观察形态特征，绘制生长曲线，进行细胞化学染色，并用流式细胞仪检测其表面标志和进行细胞周期分析。结果：大鼠MSCs细胞形态呈长梭形或多边形，细胞生长曲线呈S形，群体倍增时间为30h，细胞化学染色显示碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(POX)、苏丹黑B(SB)阴性，而*醋酸萘酚醋酶(α-NAE)与糖原(PAS)阳性，流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD90表达阳性，而CD34、CD38、CD45表达阴性；细胞周期分析显示，G0／G1期：79．48％，G2／M期：6．10％，S期：14．42％。结论：本方法分离纯化出的是MSCs，其在体外具有生长稳定，增殖较快的特点，是组织工程研究中良好的细胞来源，也是转基因研究优良的载体细胞。     

兔骨髓间质干细胞的体外分离、培养及活性鉴定

目的：建立一种体外分离培养自体兔骨髓间质干细胞（ Ｍ ａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍ ａｌ Ｃｅｌｌｓ， Ｍ Ｓ Ｃｓ）的方法。方法：抽取兔骨髓液３～５ ｍ ｌ，经密度梯度离心得骨髓单个核细胞，以１６×１０４／ｃｍ ２ 细胞浓度培养，１２～１４ ｄ 后得到贴壁生长的单层细胞，随后进入传代培养，每传一代约 ５～７ ｄ。结果：原代培养的、以及传代后培养的细胞均为贴壁生长的、均匀一致的纺锤形细胞。两种细胞经体外特殊环境诱导后均可转化为骨髓网状间质细胞和成骨细胞。结论：该细胞经体外长期培养后仍具有多潜能转化活性，确系骨髓间质干细胞。为该细胞的广泛应用奠定基础。     

兔骨髓间质干细胞的体外分离,培养及活性鉴定

目的：建立一种体外分离培养自体兔骨髓间质干细胞（ＭａｒｒｏｗＳｔｒｏｍａｌＣｅｌｌｓ,ＭＳＣｓ）的方法。方法：抽取兔骨髓液３～５ｍｌ经密度梯度离心得骨髓单个核细胞,以１．６×１０＾４／ｃｍ＾２细胞浓度培养,１２～１４ｄ后得到贴壁生长的单层细胞,随后进入传代培养,每传一代约５～７ｄ。结果：原代培养的,以及传代后培养的细胞均为贴壁生长的,均匀一致的纺锤形细胞,两种细胞经体外特殊环境诱导后可转化为骨髓网     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的：体外培养大鼠骨髓间质干细胞（BMSCs）,并进行形态学观察、表面分子标记和多向分化能力的检测鉴定。方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,显微镜下进行形态学观察,流式细胞仪检测细胞表面标记物CD29、CD44、CD45,并诱导大鼠BMSCs向成骨和成脂分化。结果分离培养的细胞以梭形细胞为主,呈漩涡状生长。 CD29、CD44均呈阳性表达,而CD45呈阴性。成脂成骨诱导后,油红O和茜素红S染色均呈阳性。结论全骨髓贴壁培养法分离培养的细胞具有间质干细胞的生物学特性,具有多向分化潜能。     

体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构

[目的]研究体外培养大鼠骨髓间质干细胞的超微结构。[方法]采用常规技术对SD鼠骨髓间质干细胞进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和透射电镜分析。[结果]流式细胞仪检测,细胞表达CD29和CD44,不表达CD11b和CD45;经5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后结蛋白和肌球蛋白染色阳性。透射电镜观察有巨噬样、内皮样和成纤维样三类基本细胞,巨噬样细胞表面有胞质突起,胞浆含电子密度高的结晶样包涵体;内皮样细胞靠胞膜边有吞饮小泡,胞浆中有电子密度高的内皮特殊小体;成纤维样细胞呈梭形,较幼稚,细胞器简单,有丰富的糖原和核糖体;经诱导分化的肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带;细胞间存在胞膜局部紧密连接和胞质突起接合。[结论]传代贴壁生长的为骨髓间质干细胞;超微结构分析显示早期幼稚细胞发育的特征,但各有特点;在不同培养条件诱导下,细胞具备向肌肉和脂肪组织分化的潜能。本研究为进一步了解和掌握骨髓间质干细胞的生物学特性和临床应用打下基础。     

猪骨髓间质干细胞体外分离,培养鉴定及向肌细胞转化的探索

为建立一种稳定的体外分离,培养及鉴定自体骨髓间质干细胞的方法,抽取贵州香猪骨髓液3ml,以1×106细胞浓度培养,2 d后得到贴壁生长的细胞,约10 d后进行传代培养,传代周期约为5-7 d。选原代及10次传代后的贴壁细胞向成骨细胞及肌细胞转化。原代及传代培养的贴壁细胞为纺锤形细胞。两种细胞在体外特殊诱导环境下可定向分化为成骨细胞及肌细胞。通过本方法培养得到的细胞经长期传代后仍具有多能转化活性,确系骨髓间质干细胞。     

人骨髓间质干细胞体外培养及诱导成骨的鉴定

目的 优化人骨髓间质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs)体外分离培养方法,对hBMSCs体外培养及诱导成骨能力进行鉴定.方法 密度梯度离心法分离hBMSCs,流式细胞分析法(FACS)对细胞表面抗原、细胞活力、细胞周期进行检测.以含地塞米松(1×10-7 mmol/L)、β-甘油磷酸钠(10 mmol/L)、抗坏血酸(35.22 mg/L)的DMEM培养液对hBMSCs进行诱导分化,相差显微镜和透视电镜观察细胞形态,Gomori钙钴法进行碱性磷酸酶染色(ALP),免疫组化检测Ⅰ型胶原,茜素红法进行钙结节染色.结果 hBMSCs可在体外分离扩增,表达CD44、CD105和CD106,不表达CD34和CD45,细胞活力为92.3%,G0-G1细胞占94.2%.经成骨培养液诱导后细胞形态由长梭形向多边形转变,ALP染色、Ⅰ型胶原染色及钙结节染色均为强阳性.结论 hBMSCs可在体外长期、稳定培养,具有向成骨细胞分化的潜能.     

大鼠骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定的初步研究

目的 :建立从成年SD大鼠股骨分离、培养并鉴定骨髓基质干细胞的方法。方法 :分离成年SD大鼠的股骨 ,用含 2 0 %胎牛血清的IMDM培养基冲洗出骨髓 ,利用骨髓基质干细胞附能力强的特点 ,分离、培养骨髓基质干细胞。采用三标 (CD11b ,CD45 ,CD90 )免疫荧光直接染色方法对骨髓基质干细胞进行鉴定。结果 :分离培养的细胞具有骨髓基质干细胞的基本特性。结论 :初步建立了大鼠骨髓基质干细胞分离、培养、鉴定的方法     

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究

[目的]建立从大鼠骨髓中分离大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stemcells,r MSCs)和体外传代培养技术,并对r M-SCs的生物学特性进行研究。[方法]采用贴壁筛选法分离r MSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养,绘制1、3、5代细胞生长曲线,用流式细胞仪检测其表面抗原,并比较在含不同浓度胎牛血清培养液培养后r MSCs的生长、增殖情况。[结果]r MSCs在体外培养扩增,原代可获得(5~6)×105、第5代可获得(2~3)×108个细胞。r MSCs形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,流式细胞仪检测结果显示,r MSCs表面抗原CD90表达阳性,而CD45表达阴性。[结论]所建立的分离和培养方法获取的是r M-SCs,具有r MSCs生物学特性,是组织工程研究中良好的细胞来源。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及生物学特性研究

目的对Long-Evans大鼠骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）进行分离培养,并检测其生物学特性。方法采用0．85％NH4Cl分离培养Long-Evans大鼠股骨来源BMSCs,检测生长曲线和生长周期,并进行细胞表面抗原和成骨能力鉴定。结果BMSCs体外培养生长状况良好,具有活跃的增殖能力。第5代细胞生长速度较第3代略减慢。细胞周期显示93．79％细胞处于G0～G1期。表面抗原检测绝大多数细胞阳性表达CD29和CD90,几乎不表达CD45。在体外能够向成骨细胞分化。结论Long-Evans大鼠股骨来源骨髓间充质干细胞经0．85％NH4Cl分离培养后,纯度高,具有良好生物学特性。     

犬骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定

[目的]探讨分离、培养、纯化和鉴定犬骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）方法,观察MSCs体外生长特征。[方法]自犬髂后上棘抽取骨髓约10ml,1．073g／ml的Percoll分离液梯度离心,培养皿培养、换液除去非贴壁细胞,获得MSCs,通过及时、反复传代对MSCs进行纯化和扩增培养,测定生长曲线,并进行形态学观察。流式细胞仪检测扩增后MSCs细胞周期及表面抗原特性。[结果]MSCs在含10％小牛血清的IMEM中生长性状相对稳定,1、3、5代细胞生长曲线基本一致,增殖速度快。流式细胞仪检测表明MSCs强表达干细胞标记CD44,而不表达造血干细胞特异抗原CD34、CD11a、CD14和HLA-DR。第2代（P2）末MSCs周期显示有82．4％的细胞处于G0／G1期。[结论]密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离、纯化和培养犬骨髓MSCs。     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及表型分析

目的体外分离培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性,为进一步实验研究打下基础.方法通过密度梯度离心法及贴壁培养分离纯化人骨髓中的单个核细胞、体外培养传代、倒置相差显微镜观察细胞生长情况、瑞氏染色及透射电镜观察细胞形态及结构、绘制生长曲线、流式细胞仪检测细胞表面标记及增殖周期、免疫细胞化学及细胞化学染色对分离培养细胞进行鉴定.结果原代和传代培养的细胞以成纤维样为主,有较强的生长增殖能力;流式细胞仪检测细胞表面标记:CD29、CD105阳性,CD34阴性;细胞周期分析:90%以上的细胞处于G0/G1期;细胞CD106、纤维连接蛋白表达阳性,CD45、CD14及层连蛋白、胶原蛋白Ⅱ表达阴性,细胞糖原(PAS)染色强阳性,细胞碱性磷酸酶(ALP)染色阴性.表明细胞不是造血细胞且未向成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞分化,而是处于未分化阶段的间充质干细胞.结论通过密度梯度离心法及贴壁传代培养可以分离纯化MSCs以满足下一步实验研究,该细胞具有特殊的生物学特性.     

兔骨髓间充质干细胞的筛选与体外培养

目的 :探讨兔骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离筛选及扩增的条件 ,同时观察骨髓细胞体外培养的生物学特性。方法 :无菌条件下采集兔骨髓 ,肝素抗凝 ,经淋巴细胞分层液 (相对密度为 1 .0 77)密度梯度离心分离骨髓单个核细胞 ,进而贴壁培养 ,获得MSCs。采用常用细胞培养技术和细胞培养的研究方法 ,观察不同贴壁时间、不同种植密度、有无包被成分及不同蛋白包被培养板对MSCs生长增殖的影响。结果 :预先蛋白包被培养板有利于MSCs贴壁。在细胞生长和增殖方面 ,纤粘连蛋白优于明胶和Ⅰ型胶原 ,以贴壁 48～ 72h ,种植密度 (3～ 9)× 1 0 4 /ml为最适条件 ,有利于梭形细胞形态和快速增殖能力的维持 ,保持成体干细胞的多向分化性。结论 :建立了MSCs体外分离和培养的最适条件 ,为进一步研究MSCs的诱导分化和应用提供了保证     

成鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞的研究

目的:探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外培养和向神经元样细胞分化的能力.方法:利用Percoll分离液(1.073×103g/L)梯度分离成年大鼠MSCs,采用3种不同的方法对其诱导分化,免疫细胞化学方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、星形胶质细胞特异性标志(GFAP)和神经前体细胞(Nestin)的表达.结果:成功进行了成年大鼠MSCs的原代和传代培养,3种诱导方法均能使MSCs分化为神经元样细胞,都能表达NSE、NF和Nestin,而不表达GFAP.结论:MSCs能在体外分离、扩增、传代,并能向非间充类细胞分化.     

小鼠骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞的分离?培养及鉴定

目的:建立一种高效,稳定的从小鼠骨髓中同时分离培养间充质干细胞(MSC)和内皮祖细胞(EPC)的方法.方法:从小鼠骨髓分离单个核细胞,经差速贴壁结合专用血清或特殊培养基分别扩增MSC和EPC.以成骨、成脂诱导分化鉴定MSC,并以流式细胞术(FCM)检测MSC纯度;以Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1荧光双标,结合vWF、CD31免疫组化染色鉴定EPC,并计算其纯度.结果:早期贴壁细胞48 h换液时即可见明显集落形成,1周后即达80%融合,传至第3代后经诱导能够向成骨细胞和脂肪细胞分化,FCM检测CD29、CD34、CD45、CD90阳性率分别为(93.86±1.12)%,(0.48±0.38)%,(1.89±1.49)%,(94.11±3.32)%;2次贴壁细胞经EGM-2 MV专用培养基培养后,第3天开始伸展,第5天可见集落形成,约2周左右可融合近80%,传代后Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1双荧光染色阳性率(75.2±4.5)%,vWF、CD31免疫组化染色阳性率分别为(55.7±4.7)%和(52.5±3.6)%.结论:采用该方法可以同时培养扩增骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞,效率高,稳定性和重复性好.     

人骨髓间充质干细胞的分离培养及部分生物学特性的实验研究

目的 建立一种体外分离和培养人骨髓间充质干细胞(MSCs)的方法，并探讨其部分生物学特性。方法 无菌条件下抽取正常健康人骨髓3-5ml，经密度梯度离心得到单个核细胞，接种入含10％胎牛血清的IMDM培养液，测定其生长曲线，并观察其贴壁率、细胞周期和超微结构变化。结果 培养的MSCs3-4h开始贴壁，贴壁率为60％-80％，2-3d即可见集落形成，14d左右融合90％以上，基本上为梭形成纤维细胞状形态，流式细胞检测显示有70．03％的细胞处于G0/G1期，电镜观察表现出早期细胞的特点。结论 成功地建立了一种分离培养人骨髓MSCs的方法，获得的细胞形态单一、生长稳定、增殖较快，为进一步应用MSCs促进创伤修复提供了实验基础。     

小鼠骨髓间质干细胞的生物学特点及分化潜能鉴定

目的：建立一种体外分离，培养和鉴定小鼠骨髓间质干细胞的方法，探讨体外培养中间质干细胞的一些生物学特点，为利用MSCs促进创伤修复提供实验基础，方法：分离5－6周龄的小鼠胫骨，股骨，用预冷的IMDM培养基冲洗出骨髓，经密度梯度离心得到骨髓单个核细胞，接种后12－16d形成意志贴壁的成纤维状细胞，体外多向诱导分化鉴定分离的细胞，用传代的细胞进行生长曲线的测定，观察其接种贴壁率，检测细胞周期和超微结构。结果：体外传代培养的MSCs具有分化形成成骨和成脂细胞的能力；MSCs倍增时间约为38h，传代后12h贴壁达90％以上，细胞周期显示有80％细胞处于G0／G1期，并用电镜照片显示其超微结构。结论：在本实验条件下，体外培养的MSCs具有多向分化潜能,体外生长稳定，传代后的细胞适应性强，增殖较快，超微结构和细胞周期表现出较早期细胞特点，可望用于自体创伤促愈。