诱导表皮干细胞向汗腺上皮细胞分化的研究

目的通过探索体外诱导表皮干细胞向汗腺上皮分化可能性,为汗腺组织工程探索新的种子细胞来源。方法分别收集正常皮肤表皮细胞．利用流式细胞仪多参数分选表皮干细胞;于不同时间点连续观察,不同浓度EGF（50～1000ng／mL）作用于表皮干细胞后的细胞生长动力学变化,免疫荧光鉴定汗腺细胞表型（NHE-1,NKCC-1）流式细胞仪分析不同浓度EGF对于细胞的毒性。结果50ng／mL和100ng／mL EGF对表皮细胞促增殖能力明显,且二者无显著差异（P〉0．05）：500ng／mL和1000ng／mL EGF抑制细胞增殖。1000ng／mL EGF对细胞增殖的抑制作用更明显（P〈0．05）。表皮干细胞经过50ng／mLEGF诱导后表达汗腺上皮相对特异性标记NHE-1及NKCC-1。结论表皮干细胞可成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。50ng／ml EGF可作为相对优化的表皮干细胞诱导条件。     

肝再生刺激因子、表皮生长因子对肝细胞的作用

目的：观察肝再生刺激因子(HSS)及表皮生长因子（EGF）对肝细胞增殖再生作用合适剂量及其联合效应。并推测HSS作用时相。方法：以^3HTdR掺入法检测细胞DNA增殖；体外原代大鼠肝细胞培养不同时间加入HSS，MTT法检测细胞生长状况。结果与结论：1．HSS(≤100μg／ml)和EGF(≤100ng／ml)对肝衍生细胞均有显著刺激作用(P<0．01)，并存在剂量关系，但剂量过大，刺激作用反而下降。2．HSS、EGF存在协同作用，原代肝细胞、肝癌细胞株(SMMC．7721、BEL．7402)体外培养48h后，经(^3H)TdR掺入法检测cpm值分别为各自对照组的5．94，298和3．36倍。3．体外培养原代大鼠肝细胞，于贴壁后0h，20h加入HSS其刺激作用较40h组显著，提示HSS可能主要作用于肝细胞再生G1／S期。     

人表皮干细胞的体外分离与培养

目的 探索人表皮干细胞（epidermal stem cells，ESCs）的分离方法和培养体系。方法 用Ⅳ型胶原纯化、富集ESCs，将黏附细胞（实验组）和未黏附细胞（对照组）分别接种在Ⅳ型胶原摹质（实验组为A1，对照组为A2）和3T3细胞滋养层（实验照组为B1，对照组为B2），培养体系为：低糖无钙DMEM培养基（添加10％胎牛血清、表皮生长因子10μg／L、氯化钙0．05mmol／L、氢化可的松0．8mg／L），观察细胞能否呈克隆状生长，用流式细胞仪和免疫细胞化学染色，对ECSs周期和表型进行分析。结果 实验组细胞呈克隆状生长，G0／G1期细胞和α6^briCD71 dim细胞百分率明显高于对照组，差异有统计学意义（P〈0．05），实验组角蛋白19免疫细胞化学染色呈阳性，对照组呈刚性。结论 人ESCs可通过Ⅳ型胶原快速黏附分选，并可在适当的培养体系里扩增。     

胎鼠表皮干细胞的分离培养及毛囊再生研究

目的：分离培养胎鼠的表皮干细胞及毛囊乳头层细胞，通过动物模型观察两者复合移植后，上皮形成及毛囊的再生情况。方法：采用IV型胶原分离培养胎鼠表皮干细胞，检测β1整合素及角蛋白15的表达水平，测定其细胞周期及克隆形成率（以角质细胞为对照）；分离培养毛囊乳头层细胞，并接种在纤维蛋白胶中，与表皮干细胞膜片复合形成全层皮肤等同物，移植在裸鼠全层皮肤缺损创面作为实验组，同时将胎鼠成纤维细胞替代乳头层细胞作为对照组，8－10周后观察创面及囊的组织学变化。结果：胎鼠表皮干细胞表达高水平的β1整合素及角蛋白15；细胞周期分析显示，G1期细胞百分率为94．9％，S期为3．5％，提示为慢循环细胞周期；角质细胞的G1期细胞有百分率为74．1％，S期为17．5％；表皮干细胞的克隆形成率为15．3％，明显高于对照组的6．7％；裸鼠创面愈合后8－10周，实验组可见新生毛囊形成，对照组未见到此现象。结论：能初步实现对胎鼠表皮干细胞的体外分离培养；在毛囊乳头层细胞的诱导下，胎鼠表皮干细胞可参与形成新的毛囊结构。     

机械应力刺激对培养的人成纤维细胞分泌生长因子的影响

目的：研究单次持续40％幅度的牵拉作用于人皮肤戍纤维细胞后bFGF、TGFD。的表达，初步探讨机械应力作用下细胞增殖的机理。方法：体外培养人正常皮肤成纤维细胞，将细胞转移至牵拉细胞培养模型中的弹性膜上，待细胞贴壁生长至75％～80%融合时，实施40％单次持续牵拉，用WESTERN—BLOT对非牵拉组与牵拉组24h、36h、48h、72h的细胞bFGF、TGFβ1进行检测。结果：牵拉各组及对照组均呈阳性表达，但牵拉48h后两者的表达较未牵拉时明显增加。结论：单次40％持续的牵挂方式可以促进bFGF、TGFβ1表达，可能是导致细胞的增殖。     

高钙培养对表皮角质细胞形态和生长特点及角蛋白表达的影响

目的：观察高钙培养后表皮角质细胞的形态、生长特点及角蛋白表达的变化,进一步探讨钙在促进表皮角质细胞分化过程中的重要作用。方法：表皮角质细胞分别在低钙（0.05mmol/L）和高钙（1.2mmol/L）环境条件下培养1-2d,光镜下观察细胞的形态和生长特点,并采用免疫组织化学方法检测表皮角质细胞中角蛋白10（K10）、K14和K19的表达水平。结果：低钙培养的表皮角质细胞散在生长,分布均匀,细胞间隙较大,胞膜圆滑,边界清楚。高钙培养后,细胞胞体变得扁平,细胞间隙消失,并且细胞出现明显的成簇生长趋势。在正常培养即低钙培养条件下,K10和K19阳性细胞比例较少,所培养的细胞几乎全为K14阳性细胞;在高钙培养条件下,K10和K19阳性细胞比例明显增加,而K14的表达没有明显变化。结论：高钙培养能改变表皮角质细胞的形态和生长特点并提高细胞内角蛋白的表达水平,从而促进表皮角质细胞的分化成熟。     

表皮生长因子对肝星状细胞c-jun基因表达的影响

目的 观察表皮生长因子(EGF)对肝星状细胞c-jun基因表达的影响.方法 在培养的肝星状细胞株中加入不同浓度的EGF(终质量浓度20、100、500μg/L),于8、24、48、72 h四个时间点分别收集细胞,提取肝星状细胞总RNA;用逆转录定量聚合酶链反应(PCR)方法测定c-jun的基因表达水平.结果 EGF 3组HSC-T6细胞c-jun基因表达水平在8 h(1.46±0.16、2.12±0.20、2.78±0.32)、24 h(1.32±0.13、1.87±0.17、2.43±0.26)、48 h(1.03±0.10、1.51±0.13、2.03±0.20)、72 h(0.77±0.09、1.17±0.10、1.66±0.12)四个时间点均显著高于对照组;随剂量加大,HSC-T细胞c-jun基因表达水平逐渐升高;3组间差异有统计学意义.结论 EGF对肝星状细胞c-jun基因表达有明显的上调作用.     

热损伤与碱性成纤维细胞生长因子联合处理诱导表皮细胞去分化的实验研究

目的：体外建立表皮细胞去分化模型,为深入阐明表皮细胞去分化过程奠定基础。方法：离体条件下选择热损伤与碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为联合诱导因素处理成熟表皮细胞。通过Giemsa染色和电镜观察细胞形态的改变;通过细胞培养和滋养层培养体系观察细胞的增殖能力,包括克隆形成和复层生长情况;采用器官培养体系体外构建三维皮肤,观察细胞再分化形成表皮情况;应用基因芯片技术观察细胞基因表达的改变。结果：经联合诱导后,细胞形态发生改变,表现为体积减小,细胞器数目减少,核浆比增大。增殖和再分化能力的改变体现在诱导后的表皮细胞能形成克隆,在滋养层培养条件下可以形成复层生长,并能够在体外构建出包括基底层和基底上层在内的表皮结构。基因水平的改变表现为与角质化相关基因下调和与有丝分裂相关基因上调。结论：在热损伤与bFGF联合诱导下,已分化的表皮细胞会发生形态、功能和基因表达的改变,表现为干细胞的特性。     

表皮生长因子对颌下腺细胞在胶原海绵黏附的影响

目的　探讨表皮生长因子 (EGF)对颌下腺细胞在胶原海绵支架上黏附的影响。方法体外原代培养SD鼠颌下腺细胞 ,并传至第 2代 ,将其分别接种于含表皮生长因子修饰的胶原海绵上 ,和不含表皮生长因子修饰的胶原海绵上。于接种后 7d取材 ,进行细胞计数计算细胞贴附率 ;苏木素 伊红 (HE)染色 ,扫描电镜观察等检测。结果　实验组含有EGF ,细胞贴附率为 73 .1% ,对照组不含EGF ,贴附率为 62 .8% (P <0 .0 5 ) ,HE染色及扫描电镜观察也证实 :实验组的颌下腺细胞在胶原海绵支架上黏附 ,增殖及分化均优于对照组。结论　EGF对颌下腺细胞在胶原海绵上的黏附有促进作用。     

机械应力作用皮肤成纤维细胞增殖的相关研究

目的 研究机械应力作用皮肤成纤维细胞增殖效应。方法 自行设计一种新的机械牵拉细胞培养模型，原代培养皮肤成纤维细胞，取3～5代的成纤维细胞种植在模型的弹性膜上，待细胞达到75％～80％融合度时，实施40％延长度的机械牵拉，检测实验组及对照组12、24、36、48、72h时间点的细胞数．利用MTT法检测不同时间点细胞的增殖变化，同时利用流式细胞仪检测不同时间点的细胞增殖周期。结果 采用40％延长度的机械牵拉可以明显导致细胞增殖，同时，代表细胞增殖特性的S期也随机械牵拉发生改变。结论 40％延长度的机械牵拉可以改变细胞的增殖周期，导致细胞增殖。     

表皮生长因子对子宫内膜细胞体外增殖的影响

本研究观察了表皮生长因子（ＥＧＦ）在体外对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的影响。采用酶消化加物理方法分离人子宫内膜上皮细胞及基质细胞,分别在体外培养,细胞汇合后消化,一部分用盖片法培养,用特异性抗体鉴定细胞纯度,另一部分做细胞增殖实验。在细胞中加入不同浓度的ＥＧＦ,培养２４、４８、７２小时,用ＭＴＴ法及流式细胞仪测定ＥＧＦ对子宫内膜上皮细胞及基质细胞增殖的作用。结果：ＥＧＦ浓度为５．０及１０．０ｎｇ／ｍｌ时,明显刺激子宫内膜上皮细胞及基质细胞的增殖,ＭＴＴ与流式细胞仪两法一致。ＥＧＦ不刺激细胞凋亡。结论：采用酶消化结合物理方法分离的人子宫内膜基质细胞及上皮细胞,方法简便、快速,细胞纯度高,在体外生长良好,可用于体外研究着床及异位子宫内膜生长的机制。当ＥＧＦ浓度为５．０及１０．０ｎｇ／ｍｌ时,确实刺激子宫内膜细胞的增殖。     

表皮生长因子刺激对脂肪干细胞促血管生成作用的影响

目的 探讨表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）旁分泌促血管生成因子及促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）小管形成的影响.方法 体外原代培养ADSCs,流式细胞术分析细胞表面标志物表达,酶联免疫吸附法（ELISA）检测不同浓度EGF刺激前后ADSCs-CM中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、肝细胞生长因子（hepatoeyte growth factor,HGF）、间质源性因子-1 （stromal-cell derived factor-1,SDF-1）含量变化;HUVEC小管形成实验检测EGF预处理对ADSCs促进HUVEC形成管样毛细血管的影响.结果 利用脂肪抽吸液成功培养出ADSCs,ADSCs具有其特异的表面标记物表达;ADSCs可分泌各种促血管生成因子,且EGF刺激可增加其分泌量;ADSCs可促进共培养的HUVEC形成管样毛细血管,用EGF预处理ADSCs后该作用显著提高.结论 体外环境下ADSCs可分泌多种促血管生成因子,并可促进共培养的HUVEC形成管样毛细血管;EGF刺激可增强该作用,15 mg/L EGF即可达到最佳效果.     

Effect of low-level laser irradiation and epidermal growth factor on adult human adipose-derived stem cells

The study investigated the effects of low-level laser radiation and epidermal growth factor (EGF) on adult adipose-derived stem cells (ADSCs) isolated from human adipose tissue. Isolated cells were cultured to semi-confluence, and the monolayers of ADSCs were exposed to low-level laser at 5 J/cm² using 636 nm diode laser. Cell viability and proliferation were monitored using adenosine triphosphate (ATP) luminescence and optical density at 0 h, 24 h and 48 h after irradiation. Application of low-level laser irradiation at 5 J/cm² on human ADSCs cultured with EGF increased the viability and proliferation of these cells. The results indicate that low-level laser irradiation in combination with EGF enhances the proliferation and maintenance of ADSCs in vitro.     

Proliferation of anterior cruciate ligament cells in vitro by photo-immobilized epidermal growth factor.

The purpose of this study was to explore the early treatment potential of anterior cruciate ligament (ACL) injuries using artificial juxtacrine stimulation by photo-immobilization of a growth factor. A photo-reactive epidermal growth factor complex (EGF-Az) was synthesized by conjugating EGF with N-(4-azidobenzoyloxy) succinimide followed by immobilization onto polystyrene culture plates using UV irradiation. ACL cells from human tissues (1 x 10(5)cells, 100 microl/well) were cultured as follows: control, no EGF; 50 microl native EGF; 50 microl EGF-Az immobilized; and 100 microl EGF-Az immobilized. The ACL cells were cultured long-term and evaluated for possible differences in their responses to EGF. An in vitro wound closure assay was developed to enable examination of cellular proliferation and migration. ACL cell proliferation was most evident in the photo-immobilized EGF culture group and was seen to increase in proportion to the amount of added EGF. In the in vitro wound closure assay, the lesioned area at 72 h after culture initiation was indistinguishable in the photo-immobilized cultures, but remained clearly visible in the controls. We conclude that photo-immobilized EGF induced rapid proliferation of ACL fibroblast cells by artificial juxtacrine stimulation and speculate that similar EGF immobilization onto bioabsorbable material (e.g., polyglycolic acid or polylactic acid) might contribute to a new therapy for the treatment of ACL injuries.     

小鼠胚胎睾丸Leydig细胞培养、纯化及其功能研究

目的:探讨小鼠胚胎睾丸Leyd ig细胞体外培养、鉴定、纯化的方法,并进行形态学观察、分泌睾酮能力等生物学特性检测。方法:选择胎龄16 d的胎鼠睾丸,0.03%胶原酶Ⅰ消化,3β-羟基类固醇脱氢酶(HSD)染色鉴定及纯度测定,锥虫蓝染色检测细胞活率。放免法测定Leyd ig细胞不同培养时间及密度下分泌睾酮的水平。结果:Leyd ig细胞培养前和培养72 h后纯度分别为(45.10±1.66)%和(81.17±2.32)%;培养液中可检测到睾酮,睾酮水平与Leyd ig细胞数、培养时间相关,单个Leyd ig细胞睾酮分泌能力逐日下降。结论:该法分离的胚胎Leyd ig细胞纯度较高,生长性好,保持增殖和分泌睾酮的生物学特性,可应用于相关的研究。     

体外诱导骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞的研究

目的探讨表皮生长因子(EGF)体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为上皮细胞的可行性。方法抽取小型香猪的骨髓，经密度梯度离心分离纯化MSCs，培养扩增后。用含EGF的不同介质诱导，观察细胞形态的变化，免疫组织化学染色和流式细胞仪鉴定角蛋白的表达。结果免疫组织化学染色显示EGF诱导后3d MSCs角蛋白表达较弱，7d角蛋白表达增强。流式细胞仪检测发现EGF诱导后3d表达角蛋白的MSCs较少(3％)，7d表达角蛋白的细胞数量明显增加(13％)。结论MSCs在体外EGF诱导下可能分化为上皮细胞。     

Effect of interleukin 6 on basal and FSH-stimulated secretion of estradiol and progesterone by human granulosa cells in vitro

Aim: To determine the effects of interleukin-6 (IL-6) on the secretion ofestradiol and progesterone by human granulosa cells in vitro. Methods:Granulosa cells were obtained from infertile patients undergoing IVF ETtreatment and cultured with serum-free supplemented HAM's F10 medium.In the absence or presence of FSH, granulosa cells were treated with differ-ent concentrations of gene recombinant human iterlukin-6 (rhIL-6). Themedia were collected after 24, 48, 72 and 96 h and assayed for estradiol andprogesterone. IL-6 and R mRNA was determined by means of RNA slotblot. Results: IL-6 had a significant inhibitory effect on estradiol secre-tion, especially in the presence of FSH. IL-6 inhibited the FSH-stimulatedprogesterone secretion, but not the basal progesterone release. The inhibi-tion shows certain degrees of dose- and time-dependency. Conclusion:IL-6 participates in the regulation of ovarian function through its inhibitoryeffect on FSH-stimulated steroidogenesis by granulosa cells.     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮细胞的实验观察

目的:研究表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)加条件培养基体外诱导大鼠 MSCs 向表皮细胞定向分化的可行性。方法:采用 Ficoll-Paque 淋巴细胞分离液分离扩增大鼠骨髓 MSCs,免疫细胞化学染色及流式细胞仪进行鉴定。传至第3代的大鼠 MSCs 用表皮生长因子(EGF)、条件培养基等定向诱导 MSCs 分化为表皮细胞;免疫细胞化学对细胞角蛋白 CK5/8、19(Cytokeratin5/8、19)阳性表达细胞进行检测。结果:从大鼠骨髓中分离培养的 MSCs 增殖能力强,细胞表面标志 CD34、CD45阴性,CD29、CD44阳性,流式细胞仪检测显示细胞纯度高,诱导后7d 细胞免疫化学显示角蛋白5/8、19染色阳性,具有表皮细胞特征。结论:从大鼠骨髓中分离培养出的问充质干细胞,具有自我更新和增殖能力强的特点,经诱导可定向分化表达角蛋白。