颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞线粒体DNA突变的实验研究

目的:探讨颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞线粒体DNA突变及其意义.方法:去除左侧部分关节盘建立大鼠颞下颌关节骨关节病模型,培养骨关节病(术后3月)和正常髁突软骨细胞.采用32对引物,使用PCR技术部分重叠扩增全长线粒体DNA,并将PCR产物进行时间温度梯度电泳,对电泳条带与正常有差异的PCR产物进行测序.结果:在35个具有异质性突变特点的PCR产物中,发现42个异质性突变,tRNA和D-loop具有高突变率.结论:颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞线粒体DNA存在突变.     

人颗粒细胞线粒体DNA缺失的研究

目的 探讨颗粒细胞线粒体DNA突变在女性生殖老化中的可能机制，并为颗粒细胞线粒体移植提供理论基础。方法 分离70例临床行常规体外受精(IVF)和胞质内单精子注射(ICSI)患者的颗粒细胞，抽提DNA，PCR检测颗粒细胞线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)4977bp缺失情况。结果所有颗粒细胞均未检测到mtDNA4977bp缺失。结论 人颗粒细胞mtDNA并不发生4977bp缺失．这可能与其不是有丝分裂后细胞，仍具有增殖能力，受到的氧化损伤较少有关。颗粒细胞参与生殖老化的机制可能与其mtDNA突变无关。     

2 型糖尿病患者线粒体常见基因突变PCR检测的局限性

目的:研究北京地区汉族人群中线粒体DNA(m itochondrial DNA,m tDNA)多位点突变频率与2型糖尿病之间的相关性。方法:采用直接PCR、PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragm ent length polymorph ism,RFLP)、PCR-时相温度梯度凝胶电泳(temporal temperature grad ient gel electrophoresis,TTGE)法筛查m tDNA 4977片段缺失、线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变和m tDNA T14577C突变。结果:在250例2型糖尿病患者及142例健康对照外周血基因组总DNA中,未发现m tDNA 4977缺失、线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变及m tDNA T14577C突变。结论:m tDNA 4977缺失、线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变及m tDNA T14577C突变在外周血中没有检出,采用常规PCR法检测2型糖尿病患者外周血线粒体DNA突变具有较大的局限性。     

胃癌细胞系和胃癌组织中线粒体DNA4 977 bp缺失及其生物学意义

目的 明确线粒体DNA 4977bp大片段缺失在胃癌细胞系、胃癌组织及胃癌患者血清中的频率,为胃癌的早期临床诊断寻找简便准确的分子标记。方法 运用Primer-shift PCR和直接测序的方法对13个胃癌细胞系、52对胃癌组织及对应的癌旁正常组织（年龄从28-78岁）、40例胃癌患者血清及40名正常人血清进行筛查。取10例胃癌组织的石蜡切片,采用显微切割技术在同一患者的切片上同时分离3种组织（包括胃粘膜正常腺体、肠化上皮及胃癌组织）对mtDNA 4977bp缺失进行了分析比较。结果 在13个胃癌细胞系中12个有mtDNA4977bp缺失（缺失率为92.3%),52例胃癌组织中38例有缺失（缺失率为73.1%),52例癌旁正常组织中27例有缺失（缺失率为52%）,40名胃癌患者血清中17例有缺失（缺失率为42.5%),40名正常人血清中8例有缺失（缺失率为20%）。胃癌组织和癌旁正常组织mtDNA 4977bp缺失差异有显著意义,癌组织mtDNA 4977bp缺失率与胃癌的分型和患者的性别没有关联。胃癌患者血清与正常人血清mtDNA4977bp缺失差异也有显著意义。10例显微切割组织中2例肠化上皮及胃癌组织中有缺失,而胃粘膜正常腺体未见缺失。结论 线粒体DNA 4977bp大片段缺失可能在胃癌发生和胃粘膜病变演化及细胞癌变的过程中起重要作用,血清中可以检测到线粒体DNA 4977bp大片段缺失,而且在胃癌患者血清中检出率远高于正常人血清。检测胃癌患者血清中mtDNA 4977bp大片段缺失有望成为一种简便易行的胃癌生物学行为的分子标记物。     

聚合酶链反应扩增大片段mtDNA

目的 :探讨聚合酶链反应 (PCR)扩增大片段线粒体DNA方法。方法 :快速碱裂解法提取线粒体DNA ,长时程PCR扩增出 5 430bp线粒体DNA。结果 :扩增出 5 430bp线粒体DNA产物特异性强 ,产量高。 结论 :该方法反应条件简便、稳定 ,也可用于其它大片段的扩增 ,有一定的实用价值。     

人多种组织中线粒体DNA存在13.1 kb片段缺失突变

目的:在人外周血细胞中筛选到新的线粒体DNA大片段缺失突变后,进一步探讨该缺失在稳定组织内的分布.方法:以人外周血细胞及人体多种组织DNA为模板,进行PCR扩增,筛选该突变.结果:在人外周血细胞及多种稳定组织中发现13.1 kb缺失突变的存在.结论:这种广泛分布于健康人多种组织中的线粒体DNA缺失突变可能与衰老有关.     

多重半巢式聚合酶链反应检测巨细胞病毒DNA多聚酶基因

目的：探讨多重半巢式聚合酶链反应（msnPCR)在研究巨细胞病毒（CMV）DNA多聚酶基因（UL-54）中的应用价值。方法：从8例心肺移植患者血标本中提取DNA,以CMV-UL54为模板,自行设计6条特异性引物,建立msnPCR扩增系统。扩增产物在DNA测序仪上自动测序。结果：msnPCR能扩增出427bp和1052bp两条目的片段,扩增产物测序表面存在导致氨基酸改变的碱基有义突变。结论：msnPCR扩增结合测序,可检测CMV-UL54的7个功能区目片段中的碱基突变,msnPCR比普通PCR更加省时和经济。     

结直肠癌线粒体DNA拷贝数改变及4977片段缺失

目的 探讨结直肠癌（colorectal cancer,CRC）线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）拷贝数异常、线粒体DNA 4 977 bp大片段缺失与TNM分期和分化程度的关系.方法 选取118例石蜡标本大肠癌组织,分别提取总DNA.以ND1和β-actin为目的基因,进行SYBR Green荧光定量PCR扩增,并用PCR扩增方法检测4 977片段缺失情况,探讨它们与不同TNM分期和分化程度之间的关系.结果 CRCⅠ和Ⅱ期癌组织平均拷贝数（2ND1/β-actin）分别为128.42±31.25和115.12±47.15,Ⅲ和Ⅳ期癌组织平均拷贝数为105.22±16.35和99.45±28.46.Ⅰ和Ⅱ期的拷贝数明显高于Ⅲ和Ⅳ期的拷贝数（P〈0.01）,癌组织低、中、高分化的平均拷贝数分别为101.34±41.35、112.33±42.32和127.22±31.23（P〈0.01）,4 977片段缺失率为15.25%（18/118）,线粒体DNA4977bp缺失与患者的分期呈负相关,与分化程度无明显关系.结论 线粒体DNA 4 977 bp缺失在大肠癌的早期阶段起到了重要作用,随着肿瘤的进展,拷贝数逐渐减少,线粒体DNA拷贝数的变化及大片段缺失在肿瘤的发病机制中可能起一定作用.     

自建两轮PCR法对低载量HBV DNA S区基因的扩增及实验条件优化

目的 探究低载量HBV DNA S区基因扩增的可行性并对实验条件进行优化,为隐匿性HBV感染(OBI)患者HBV DNA S区基因突变检测提供依据.方法 采用传统巢式PCR和自建两轮PCR方法扩增6例低HBV DNA载量(100～200 IU/mL)和22例更低HBV DNA载量(20～99 IU/mL)的血清样本中HBV DNA S区基因,并对引物序列、引物量、PCR产物模板稀释倍数、退火温度、PCR反应循环数、PCR总反应体系等条件进行优化.PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,切割目的条带凝胶进行克隆测序,然后对克隆测序结果进行核酸序列BLAST比对确认.结果 设计3对巢式PCR引物(P1～P3),扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化后,6例低HBV DNA载量的血清样本中仅2例经巢式PCR扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,22例更低HBV DNA载量样本无一例扩增成功.自建两轮PCR法设计了P4～P15共12对引物,扩增产物理论上包含整个HBV DNA S区基因.经过PCR扩增条件优化并筛选出P13为最佳引物后,6例低HBV DNA载量的血清样本全部扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列;15例(15/22,68.18％)更低HBV DNA载量的样本扩增出HBV DNA S区基因特异性靶序列,经PCR产物克隆测序均证实为HBV DNA S区基因,该15例样本中HBV DNA载量最低为20.1 IU/mL.结论 基于引物P13自建的两轮PCR法更适用于低载量HBV DNA S区基因的扩增,扩增效率和特异性均优于传统巢式PCR;扩增产物可进一步应用于OBI者HBV DNA S区基因序列突变分析.     

贵州省部分少数民族线粒体DNA 9bp序列缺失频率研究

目的: 研究中国贵州省部分少数民族线粒体DNA 9 bp 序列缺失情况.方法: 采用PCR法扩增线粒体基因组细胞色素氧化酶II和tRNAlys基因间非编码序列中含9bp序列缺失的片段,3%琼脂糖凝胶电泳检测缺失情况.结果: 各少数民族线粒体DNA 9 bp序列缺失频率为7.4%～23.4%,最低为银屏壮族,最高为沙井苗族.结论: 贵州省部分少数民族线粒体DNA 9bp 序列缺失频率较高,各民族DNA 9 bp序列缺失频率有一定差异.     

Detection of mitochondrial DNA deletion by a modified PCR method

Objective: To develop a simple and efficient method for detecting small populations of mitochondrial DNA deletion. Methods: Peripheral blood cell DNA was obtained from a victim who was aecidently exposed to a ^60Co radiation source 11 years ago. Using the DNA as template, PCR was performed to generate multiple products including true deletions and artifacts. The full length product was recovered and used as template of secondary PCR. The suspicious deletion product of mtDNA could be confirmed if it was only yielded by first PCR. Using either original primers or their nested primem, the suspicious deletion product was amplified and authenticated as true deletion product. The template was recovered and determined to be a deletion by sequencing directly. Results: A new mtDNA deletion, spanning 889 bp from nt11688 to nt12576, was detected in the peripheral blood cells of the victim. Conclusion: The new PCR-based method is more efficient in detecting small populations of mtDNA deletion than other routine methods. MtDNA deletion is found in the victim, suggesting there is relationship between the deletion and phenotypes of the disease.     

人外周血细胞线粒体DNA中存在特大片段缺失突变

了解线粒体ＤＮＡ大片段缺失突变及其意义。方法采用６种方法提取人外周血细胞ＤＮＡ,,其中１种方法先分离线粒体,再抽提线粒体ＤＮＡ。以得到的人外周血细胞ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,其产生经琼脂糖凝胶回收后与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接、转化、测序。结果６种方法抽提ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增后,产物电泳行为相同,发现人血细胞线粒体ＤＮＡ存在１３１６２ｂｐ特大片段缺失突变。结论此缺失首首发现的,经测序证明为人线粒体ＤＮ     

Cochlear mitochondrial DNA3867bp deletion in aged mice

目的　探讨老龄小鼠耳蜗mtDNA缺失情况 ,明确老龄小鼠耳蜗mtDNA缺失的位置。方法　应用套式PCR和DNA测序技术对不同月龄 12 9/CD1杂交小鼠耳蜗 31个 (2月龄 7个 ,7- 10月龄 16个 ,17- 19月龄 8个 )进行定性及定量检测。结果　 1 小鼠耳蜗mtDNA386 7bp大片缺失 ,缺失发生在nt910 3-nt12 970之间 ,其两侧nt90 89-nt910 3和nt12 95 6-nt12 970为核苷酸完全相同的 15bp重复序列。 2 随着小鼠月龄的增加 ,耳蜗mtDNA386 7bp缺失发生率有明显增加的趋势 ,2月龄小鼠未发现缺失 (0 /7) ;17- 19月龄小鼠 (7/8)明显高于 7- 10月龄小鼠 (4/16 ) (P <0 0 1)。 3 缺失mtDNA/总mtDNA比值 ,17- 19月龄小鼠明显高于 7- 10月龄小鼠 (P <0 0 1)。结论　老龄小鼠耳蜗出现mtDNA386 7bp大片缺失可能与老年性聋发生相关     

BMP7基因克隆及其在兔关节软骨细胞中的表达

目的：克隆骨形态发生蛋白BMP7基因并检测其在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达。方法：从体外培养的幼兔膝关节软骨细胞中提取总RNA;按GenBank BMP7基因序列化学合成2条引物,采用RT-PCR方法得到BMP7基因;将BMP7基因片段插入到真核表达载体pcDNA 3.1中,构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒;利用双酶切、PCR及核苷酸序列分析鉴定BMP7目的基因;将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒转染家兔关节软骨细胞,分别采用原位杂交、PCR、Western blotting法测定BMP-7表达。结果：克隆得到的BMP7基因核苷酸序列长约1 300 bp,构建的重组pcDNA 3.1-BMP7真核表达载体质粒目的基因BMP-7序列与GenBank报道的BMP-7基因（No. BC008584)一致,转染了BMP7基因的体外培养的成年家兔膝关节软骨细胞表达了BMP7蛋白。结论：成功构建表达BMP7蛋白的转基因关节软骨细胞,其可用于细胞移植治疗或作为种子细胞构建组织工程软骨修复关节软骨缺损。     

实验性骨关节病中软骨细胞的凋亡

The right knees of rabbits were immobilized in full extension for up to eight weeks using plaster cast. Specimens of the articular cartilage obtained from tibial plateau were studied by histopathologic and TDT-mediated fluorescein-dUTP nick-end labelling(TUNEL) techniques. The results showed that TUNEL-positive chondrocytes with apoptosis specific morphology were detected on superficial and middle layer of the articular cartilage from one to two weeks after immobilization, and these changes progressed until 4 weeks after immobilization. Six weeks after immobilization, TUNEL-positive chondrocytes were seen through the entire thickness of the articular cartilage. Our findings indicate that apoptosis of chondrocytes could be induced by immobilization and might be responsible for articular cartilage degeneration, and which is one of the pathways involved in the pathophysiological mechanism of osteoarthritis.     

实验性骨关节病中软骨细胞的凋亡

应用兔膝关节伸直位石膏管型固定造成的实验性骨关节病模型,对其关节软骨细胞进行形态学及原位ＤＮＡ 断裂标记研究。结果显示：制动１ 周时即出现软骨表层细胞凋亡,２ 周后凋亡呈增加趋势,６周时出现全层软骨细胞大量凋亡,而正常及实验对照组很少出现凋亡细胞。提示制动可引起软骨细胞凋亡;软骨细胞凋亡可能是关节软骨出现退变的重要机制之一。     

人骨关节炎软骨细胞的体外培养

目的:对人骨关节炎软骨细胞的分离、消化和培养进行初步研究,并就其生物学活性同人正常软骨细胞进行比较和评价。方法:以含血清培养液配制的0.05%和0.2%Ⅱ型胶原酶顺序消化关节软骨分离细胞,检测细胞存活率;体外传代培养观察细胞形态、生长、增殖和Ⅱ型胶原、蛋白多糖聚集体等的变化,以及用流式细胞仪检测有或无IL-1β诱导的细胞凋亡和周期变化。结果:①消化后骨关节炎组原代细胞活力平均为82%,少于正常组的95%(P<0.01)。②MTT检测骨关节炎组细胞增殖低于正常组(P<0.01),Ⅱ型胶原免疫组化和甲苯胺蓝O异染反应均较弱,传至第4代软骨细胞生物学特性基本消失。③骨关节炎组细胞凋亡率为6.9%,而正常组为0.5%,IL-1β诱导后凋亡率增加了27.4%,正常组只有12.7%。结论:酶二步消化法具有较高细胞存活率、低污染率和操作简便等特点,分离培养的骨关节炎软骨细胞符合人患骨关节炎时软骨细胞退变的表现,能很好的为骨关节炎细胞水平的研究提供最佳实验对象。     

Radioautographic findings in osteoarthritic femoral head

During total hip replacement for 8 patients with hip joint osteoarthritis specimens of femoral articular cartilages of 3 types of involvement were taken, i.e. the "normal" articular cartilage, the fissured and wrinkled articular cartilage, and the yellow or dusky red, markedly thickened, and roughened articular cartilage. Radioautographical studies with 3H-Thymidine labelling showed the clusters of articular chondrocyte, degeneration, death and vanishing of the chondrocytes with empty lacunae left; and mitosis and proliferation of the chondrocytes, as evidenced by silver granules in the nuclear area. In the articular cartilages of three types of involvement, the percentages of degenerated, dead and vanished chondrocytes represented by empty lacunae, of non-mitotic chondrocytes without silver granule and of chondrocytes undergoing mitosis with silver granules, were 19.9, 38.3 and 41.8; 9.1, 48.9 and 42; 5.3, 35.0 and 59.7 respectively. A large number of empty lacunae appeared in the "normal" articular cartilage, signifying aging of the cartilage. Chondrocytes bearing silver granules appeared not only in the "normal" articular cartilage but also largely in the severe osteoarthritic cartilage and served as a compensatory manifestation of both aging and osteoarthritis.     

正常关节和骨关节炎软骨细胞凋亡和超微结构的研究

目的 探讨正常关节和骨关节炎（OA）软骨细胞凋亡和超微结构的变化,以及正常关节和OA关节软骨细胞体外培养的凋亡来分析骨关节炎可能的发病机制。方法 胡氏造模法制作新西兰大白兔OA模型,3周后切取关节软骨,末端原位标记染色法分析正常关节软骨,骨关节炎软骨的细胞凋亡。分离关节软骨细胞体外培养,然后通过钙黄绿素和双FITC-AI双染色,分析软骨细胞的活力和凋亡情况,同时切取关节软骨细胞行透射电镜分析软骨细胞中一些超微结构的变化。结果 发现OA组软骨中凋亡细胞（14.32±3.17）比正常组（4.54±1.17）明显增多,两组间比较差异有统计学意义（t''=15.85,P<0.05）;而体外培养的软骨细胞中,OA组分离的软骨细胞存在大量凋亡细胞（83.63±20.11）和正常组（91.45±4.70）比较,差异有统计学意义（t''=2.07,P<0.05）。OA组部分软骨细胞的活力明显增强,OA组为79.45±3.60,正常组为75.60±5.33（t=3.28,P<0.01）。在超微结构的研究中,发现大量软骨细胞内的超微结构,有明显的变化,特别是线粒体在正常组为7.3±2.3,而OA为3.4±1.7,明显减少,比较差异有统计学意义。OA组染色质边缘化,空泡化和分布异常也非常明显。结论 在OA模型中,存在软骨细胞大量凋亡现象,通过超微结构现象分析凋亡细胞增多同时存在染色质的减少和分布异常,以及一些细胞小体的减少,可能和软骨细胞能量过度代谢和线粒体的减少等有密切的关系。