山羊骨髓间充质干细胞的体外培养与生物学特性

目的:体外分离培养山羊骨髓间充质于细胞(BMSC),并观察其生物学特性.方法:应用常规密度梯度离心法从山羊骨髓中分离BMSC并传代培养,镜下观察细胞形态及生长特性,绘制细胞生长曲线,测定倍增时间,免疫细胞化学法鉴定其表型.结果:原代培养的BMSC初始呈圆形、梭形及多角形等,细胞呈贴壁生长,48 h可见贴壁细胞有伸展现象,细胞渐变为均一梭形,14 d时可达90%融合.第1、3和5代BMSC生长曲线呈"S"型,1～2d为潜伏期,2～3 d后进入对数增长期.7～8 d后进入平台期,平均倍增时间为(23.2±1.9)h.BMSC CD29和CD44呈广泛阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达.结论:成功分离培养出山羊BMSC,细胞纯度较高,生长状态良好.     

骨髓基质细胞体外三维培养的研究

目的:建立骨髓基质细胞(BMSC)体外三维培养的方法,并观察其细胞生长形态及生物学特征。方法:制备鼠尾胶原,对BMSC进行三维培养,共聚焦显微镜观察细胞形态,MTT、ALP钙钴、苏丹Ⅲ染色观察BMSC增殖及分化。结果:三维培养的BMSC早期呈现集落生长特点,后逐渐向不同的形态转变,与二维培养相比,细胞增殖峰值提前,且向成骨及脂肪细胞分化能力增强。结论:BMSC在体外三维培养模式下生长良好,能够继续保持其自我更新能力及分化潜能。     

超低温冻存对人骨髓基质干细胞生物学特性的影响

目的 观察超低温冻存对人骨髓基质干细胞(BMSC)生物学特性的影响. 方法 从正常献髓者髂骨采集骨髓,分离培养出BMSC,并对其进行成骨诱导培养.将第4代人BMSC经短期超低温冻存、复苏后,通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能、碱性磷酸酶(ALP)活性检测及体外矿化能力比较,观察超低温冻存对人BMSC生物学特性的影响.结果 第4代人BMSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、生长过程、ALP活性等方面均无显著性差异(P＞0.05).结论 短期的超低温冻存对人BMSC的生物活性无明显影响.     

体外培养大鼠骨髓基质细胞生物学特性研究

目的:观察体外培养大鼠骨髓基质细胞生物学特性,为诱导骨髓基质细胞分化形成神经元及分化机制和移植治疗脑缺血大鼠的研究奠定基础.方法:取4周龄Wistar大鼠,全骨髓法体外培养骨髓基质细胞,利用倒置相差显微镜观察原代及不同传代细胞生长形态特点,并应用间接免疫荧光法鉴定原代及不同传代细胞表型.结果:培养的骨髓基质细胞第3代,细胞增殖能力已趋于稳定,骨髓基质细胞表面标志CD54、CD44阳性的细胞已占到95.18%、94.36%.造血干细胞表面标志CD14阳性的细胞已从原代的23.19%降低到2.37%.结论:传3代的细胞已适合于细胞诱导分化,可作为理想细胞移植治疗的细胞来源.     

bFGF对骨髓基质干细胞体外培养及诱导分化时生物学特性的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化时生物学特性的影响。方法 将兔骨髓基质细胞(BMSC)经淋巴细胞分离液分离培养、传代扩增后，进行定向诱导分化，其中1组的培养液及矿化诱导液中始终含有bFGF。以MTT法描绘细胞生长曲线。结果 MTT法测定结果表明，BMSC加外源bFGF组细胞增殖较BMSC组细胞生长活跃。结论 骨髓基质细胞是一种良好的骨源细胞，具有定向分化能力，bFGF对其定向诱导分化具有良好的促进作用。     

大鼠骨髓源神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:对Wistar大鼠骨髓源神经干细胞进行分离、培养和鉴定,观察其生长方式和分化特征。方法:运用无血清培养基对Wistar大鼠骨髓基质细胞进行培养,对分离获得的悬浮生长的神经球采用免疫组织化学法检测CD133和Nestin表达情况。用血清诱导其分化,分化7 d后,采用免疫荧光细胞化学染色方法检测分化后GFAP、Map2、β-tubulinⅢ、Galc的表达情况。结果:大鼠骨髓基质细胞在无血清培养基中,呈悬浮状态生长,形成细胞球,经免疫荧光检测,细胞球呈CD133和Nestin阳性。将细胞球转入含血清培养基后,转为贴壁生长,经免疫荧光检测大部分已分化细胞呈GFAP阳性,少部分细胞呈MAP-2、β-tubulinⅢ及Galc阳性。结论:采用含bFGF、EGF的无血清培养基可培养出呈球状聚集生长、具多向分化潜能的大鼠骨髓源神经干细胞。     

非诱导条件下犬骨髓基质细胞的生物学特性

目的 研究体外培养骨髓基质细胞(BMSC)的生长特点和非诱导条件下的成骨特性。方法 采用犬来源BMSC体外扩增培养，观察非诱导条件下BMSC生长变化和成骨分化。结果 形态学观察表明，BMSC贴壁细胞呈集落生长，有成纤维细胞样外观，未加入成骨诱导剂，细胞形态发生变化，钙沉积出现，碱性磷酸酶(ALP)表达。3代内扩增的BMSC有成骨活性，但原代细胞成骨活性优于传代后细胞。结论 体外培养BMSC能大量扩增，具有自然向成骨细胞分化的能力，是骨组织工程理想的种子细胞。本实验所培养的BMSC具有骨祖细胞特性。     

大鼠骨髓基质干细胞的分离培养及鉴定的初步研究

目的 :建立从成年SD大鼠股骨分离、培养并鉴定骨髓基质干细胞的方法。方法 :分离成年SD大鼠的股骨 ,用含 2 0 %胎牛血清的IMDM培养基冲洗出骨髓 ,利用骨髓基质干细胞附能力强的特点 ,分离、培养骨髓基质干细胞。采用三标 (CD11b ,CD45 ,CD90 )免疫荧光直接染色方法对骨髓基质干细胞进行鉴定。结果 :分离培养的细胞具有骨髓基质干细胞的基本特性。结论 :初步建立了大鼠骨髓基质干细胞分离、培养、鉴定的方法     

SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究

目的 建立一种简便有效的体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的方法,研究BMSCs的生物学特性,为后续细胞移植和基因治疗提供理想的种子细胞.方法 全骨髓贴壁培养法分离大鼠BMSCs,体外培养和连续传代,在倒置相差显微镜下连续观察细胞的形态变化,利用MTT法测定其生长曲线,流式细胞仪鉴定其表面抗原,成...     

体外培养骨髓基质细胞在珊瑚羟磷灰石上生长的表面形态观察

目的 观察体外培养的骨髓基质细胞与珊瑚羟基磷灰石复合后的生长特性,论证珊瑚羟磷灰石作为骨组织工程学载体材料的可行性.方法 分离纯化的狗骨髓基质细胞与珊瑚羟基磷灰石复合体体外培养,分别在相差显微镜下、扫描电镜下观察细胞的表面形态结构.结果 骨髓基质细胞在珊瑚羟基磷灰石上贴附生长良好,功能正常.结论 骨髓基质细胞在珊瑚羟基磷灰石上生长增殖良好,珊瑚羟磷灰石是骨组织工程载体材料的可靠选择.     

体外诱导骨髓基质细胞向神经细胞分化的形态学观察

目的:探讨骨髓源性神经干细胞分化为神经细胞的可行性,为中枢神经组织损伤修复寻找种子细胞的理想来源.方法:无菌取成大鼠长骨骨髓,密度梯度离心分离后获得骨髓基质细胞(BMSC),在神经干细胞培养液及细胞因子等条件下诱导其分化为神经元样细胞.结果:增殖培养24～72h见细胞分裂像和克隆单位;继续增殖培养仍可见细胞克隆(干细胞特性);诱导培养第10日有成熟神经细胞形成.说明BMSC在体外培养条件下,经过多种因子的"程序性"作用,可以向神经干细胞、成熟神经元及胶质细胞方向分化.结论:在适宜培养条件及诱导因子联合作用下,BMSC可成功诱导出神经元样细胞.     

兔骨髓基质细胞的体外培养

目的 :比较用全骨髓法和离心法培养兔原代骨髓基质细胞 (BMSC)的差异 ,同时观察BMSC在体外培养时的生长特征及体外诱导为成骨细胞的可能性。方法 :抽取新西兰大白兔骨髓 ,分别用全骨髓法和密度梯度离心法进行原代培养 ,比较第 12d收获细胞的数量。传代后观察 1～ 6代细胞的生长特征 ,绘制生长曲线 ,测定分裂指数和贴壁率 ;同时将部分第 3代细胞进行诱导培养 ,第 16d计算碱性磷酸酶 (ALP)阳性细胞率。结果 :全骨髓法较离心法收获细胞数量少 (P <0 .0 5 ) ,1～ 6代细胞的生长特征相似 ,增殖能力强。第 3代细胞被成功地诱导为成骨细胞 ,第 16dALP阳性细胞率为 80 %。结论 :离心法较全骨髓法培养BMSC可得到较多的细胞 ,两种方法得到的细胞前 6代细胞均有较强的增殖能力 ,并可以诱导为成骨细胞 ,可作为骨组织工程用的种子细胞     

正常和病理骨髓基质细胞对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的：研究正常和病理骨髓基质细胞（BMSC）在与K562细胞接触和隔离培养条件下对该细胞株增殖与凋亡的影响。方法：将慢性髓细胞白血病（CML）患者和正常人BMSC各自分为单独培养的对照组、K562与BMSC直接接触的接触培养组和隔离培养组，分别于第2、4、7和12d观察K562细胞生长增殖情况；以末端标记技术（TUNEL）检测K562细胞的凋亡。结果：正常BMSC培养条件下与对照组比较，接触培养组和隔离培养组K562细胞数量存培养第4d后显著升高（P〈0．05），接触培养组显著快于隔离培养组（P〈0．05）；在CMLBMSC培养条件下，K562的生长速度显著加快，4d以后与对照组比较的差异有显著性意义（P〈0．01）。K562细胞凋亡在正常BMSC培养条件下显著减少，隔离培养组在第7d、接触培养组在第4d与对照组比较的差异有显著性意义（P〈0．05）；在CMLBMSC培养条件下，隔离培养组在4d后、接触培养组在2d后凋亡减少，与对照组比较差异有非常显著性意义（P〈0．01）。结论：BMSC可通过间接因素（调节因子作用）保护K562细胞，直接接触因素（由黏附分子介导的直接作用）能加强这种保护作用，导致K562细胞生长增快，凋亡减少。     

大鼠骨髓间充质干细胞原代培养及成骨成脂分化能力染色鉴定

目的：实验旨在建立一套简便有效的骨髓间充质干细胞原代培养、诱导分化及染色方法,观测骨髓间充质干细胞生物学特性,及其成骨、成脂分化潜能,为后续进行骨髓间充质干细胞基因修饰实验做好准备。方法本实验通过全骨髓培养法分离骨髓间充质干细胞,并用诱导分化培养液做定向诱导培养,观察骨髓间充质干细胞向成骨及成脂肪细胞分化过程中的细胞形态学变化,进行成骨成脂细胞染色鉴定,以探讨骨髓间充质干细胞的分离培养方法、生长规律及向成骨成脂细胞分化的条件。结果(1)通过全贴壁法成功进行了骨髓间充质干细胞原代及传代培养并绘制出第4代细胞生长曲线;(2)通过茜素红染色验证了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力;(3)通过油红O染色验证骨髓间充质干细胞的成脂分化能力。结论全贴壁法提取的大鼠骨髓间充质干细胞经传代4次左右可达到一定纯度,在一定诱导条件下,经特定染色方法鉴定,可分化为成骨细胞,成脂细胞。     

诱导兔骨髓基质细胞向神经干细胞分化的初步实验研究

目的：观察兔骨髓基质细胞体外培养的生长行为及增殖、分化情况，探讨由骨髓分离培养神经干细胞的可行性和有效性。方法：无菌条件下行骨穿术，密度梯度离心分离获取骨髓基质细胞，利用多种增殖、分化诱导因子和神经干细胞培养液进行培养、分化诱导，用免疫细胞化学方法进行鉴定。结朵：骨髓基质细胞在体外培养中能形成NESTIN抗原阳性的细胞克隆团，进一步分化，部分细胞胞体增大并出芽，逐渐发育成为较成熟的长突起细胞，长突起相互连接、交织成网并建立纤维联系。结论：骨髓基质细胞具有较强的自我更新能力和多向分化潜能，易于取材、体外培养和增殖，在一定诱导条件下可以生成神经干细胞。     

体外诱导的神经元样细胞对大鼠脑损伤模型修复的影响

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 诱导为神经元样细胞后对大鼠脑损伤模型修复的影响。方法:骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs并采用流式细胞术进行鉴定,川芎嗪诱导其分化,将诱导24h的细胞直接注射移植到大鼠脑缺血模型海马区组织, 检测分化的神经元样细胞在神经系统微环境中存活及病理变化。结果:细胞移植组病理变化与脑损伤模型组相比, 神经细胞变性、坏死数量明显减少, 间质水肿较轻。结论:骨髓间充质干细胞诱导为神经元样细胞后移植入对大鼠脑缺损伤的修复有一定的作用。     

骨髓基质细胞体外成骨的实验研究

目的 研究骨髓基质细胞体外培养的成骨能力,为细胞移植修复骨缺损提供一条新途径。方法 取新西兰大白兔股骨大转子处骨髓,进行体外培养,纯化,10－14天后进行转代。培养后的细胞经倒置显微镜,透射地镜,钙染色,碱性磷酸酶染色等方法进行观察。结果 培养纯化后的细胞呈梭形,多角形,电镜显示具有分泌功能旺盛的结构,碱性磷酸酶染色强阳性,培养3－4周后,能形成钙结节。细胞在体外能多次传代,维持成骨表型。结论 骨髓基质细胞在体外培养纯化后,骨与成骨细胞相似的形态结构和生物学特性,能形成钙化的骨样组织。     

Bone marrow stromal cells express neural phenotypes in vitro and migrate in brain after transplantation in vivo

Objective To investigate the differentiation of bone marrow stromal cells （BMSC） into neuron-like cells and to explore their potential use for neural transplantation. Methods BMSC from rats and adult humans were cultured in serum-containing media. Salvia miltiorrhiza was used to induce human BMSC （hBMSC） to differentiate. BMSC were identified with immunocytochemistry. Semi-quantitative RT-PCR was used to examine mRNA expression of neurofilamentl （NF1）, nestin and neuron-specific enolase （NSE） in rat BMSC （rBMSC）. Rat BMSC labelled by Hoschst33258 were transplanted into striatum of rats to trace migration and distribution. Results rBMSC expressed NSE, NFI and nestin mRNA, and NF1 mRNA and expression was increased with induction of Salvia miltiorrhiza. A small number of hBMSC were stained by anti-nestin, anti-GFAP and anti-S 100. Salvia miltiorrhiza could induce hBMSC to differentiate into neuron-like cells. Some differentiated neuron-like cells, that expressed NSE, beta-tubulin and NF-200, showed typical neuron morphology, but some neuron-like cells also expressed alpha smooth muscle protein, making their neuron identification complicated, rBMSC could migrate and adapted in the host brains after being transplanted. Conclusion Bone marrow stromal cells could express phenotypes of neurons, and Salvia milliorrhiza could induce hBMSC to differentiate into neuron-like cells, If BMSC could be converted into neurons instead of mesenchymal derivatives, they would be an abundant and accessible cellular source to treat a variety of neurological diseases.     

米诺环素微环境对体内外骨髓间充质干细胞的影响

 目的研究米诺环素在体内外干扰骨髓间充质干细胞后对其生长的影响。方法大鼠脊髓损伤后,经口给予米诺环素,并将带有GFP基因的SD大鼠骨髓间充质干细胞局部移植到损伤脊髓,在体外培养大鼠骨髓间充质干细胞并给予不同剂量的米诺环素进行干预。利用荧光显微镜计数细胞,采用MTT法描绘细胞生长曲线来观察干细胞的生长状况。结果米诺环素联合骨髓间充质干细胞治疗实验性脊髓损伤,在损伤中心可以观察到更多的移植细胞,体外培养的骨髓间充质干细胞在合适剂量米诺环素的干预下呈现出更加旺盛的生长趋势。结论合适剂量的米诺环素可以促进体内移植的骨髓间充质干细胞在损伤脊髓内更多地迁移到损伤中心,而对于体外培养的骨髓间充质干细胞米诺环素会促进其增殖。