筛选HIV-1 P24蛋白适配子的一种简便的SELEX方法

目的 快速筛选HIV-1 P24抗原适配子,并验证其特异性与亲和力.方法 利用聚碳酯材料PCR板包被P24抗原,在PCR板中运用SELEX技术进行适配子筛选.对多条适配子序列进行了一级结构及二级结构软件分析.酶联免疫法(ELISA)对筛选到的适配子进行亲和力及特异性验证.结果 确定用聚碳酯材料可以包被P24抗原,ELISA法检测抗原包被浓度与吸光度(A值)正相关;电泳显示适配子得到富集筛选;测序后软件分析表明多条适配子有共有序列,空间结构多样;用ELISA法,结合辣根过氧化物酶(HRP)标记链霉亲和素(SA)与生物素标记的适配子,对适配子与P24的亲和力进行验证,表明筛选到的适配子与P24抗原有特异性的高亲和力结合.结论 建立了一种简便的筛选HIV-1 P24抗原适配子的方法,筛选到特异性的高亲和力P24适配子.     

单克隆抗体对HFRS病毒两种粗制抗原相对亲和力的测定

McAb为传染病的病原研究和临床诊断等提供了新的手段和制剂。由于每一株杂交瘤分泌的McAb的特性可能各不相同,而其中McAb对相应抗原的亲和力高低是决定其用途的重要依据之一,因此有必要及早确定。经典的测定抗体亲和力方法一般是以抗原抗体反应的平衡常数K值表示,但K值的求得需对抗原抗体进行纯化、定量,方法烦琐,不能常规使用。本文采用ELISA法测定,虽不十分精确,但操作简便,无需特殊试剂和设备,能快速而明确地比较出各株McAb对病毒抗原亲和力的相对高低。 测定了32株抗肾综合征出血热(HFRS)     

MHC-抗原肽-TCR亲和力与T_H1/T_H2细胞分化

MHC 抗原肽 TCR亲和力是影响T辅助细胞分化的重要因素之一 ,抗原肽与MHC之间亲和力越高越有利于TH1细胞分化 ,亲和力越低越有利于TH2细胞的分化 ;抗原浓度的变化可以调变抗原递呈细胞表面加工后抗原决定簇的密度 ;抗原肽 MHC复合体与TCR之间亲和力越高越有利于TH1细胞分化 ,反之亦然。MHC 抗原肽 TCR之间亲和力的不同会导致CD3ζ链胞内区磷酸化顺序的改变 ,可能会使亲和力不同的“量变”信号转变成细胞分化的“质变”信号。     

单克隆乙肝核心抗体的抗原结合位点及其亲和力的研究

本文用已建主的三株分泌抗乙肝核心抗原(HBcAg)单克隆抗体的杂交瘤细胞系,对HBcAg的结构进行了探讨。通过单抗相加试验、相加指数的计算、双抗体竞争试验的结果,证实三株不同Ig型的单克隆抗HBc,是对同一抗原决定簇的。另外,从对三种来源的HBcAg的双抗体竞争试验结果可看到:三株单抗对三和HBcAg表现出完全的竞争抑制,表明这三种不同来源的HBcAg具有共同的抗原决定簇。没有发现HBcAg有不同的亚型决定簇。同时,本文还对三株单克隆核心抗体的亲和力进行了测定,分别为0.02μg/ml.1μg/ml及2μg/ml。在研究方法上,选用了第二抗体的间接法来测定对抗原决定簇的特异性;亲和力的测定采用了EL1SA方法,都具有重复性好、简便易行等特点。具有实用价值。     

抗牛FSH单克隆抗体真实亲和力常数的测定

本文在Friguet等提出的酶联免疫吸附法测定单克隆抗体真实亲和力方法的基础上,提出了选择适宜抗原浓度实验点的公式,并用改良后的方法测定了五种抗牛促卵泡激素单克隆抗体的真实亲和力,取得了满意的结果。此外,本文论证了抗原、抗体从低浓度到高浓度变化时,其结合行为上存在的差异。     

阻断白介素12 p40功能的新型治疗性单克隆抗体的开发

目的设计并利用抗体工程方法构建并制备全新序列的阻断白介素12(IL-12)p40功能的单克隆抗体MAB1,并对其生物学活性进行鉴定,以制备可应用于治疗多种自身免疫病的IL-12通路的阻断剂。方法根据已有的IL-12 p40蛋白序列,设计、构建并制备了全新的单克隆抗体MAB1,利用间接ELISA测定其与抗原结合的亲和力,并用细胞学方法鉴定它的生物学活性。结果抗体MAB1与p40抗原的结合亲和力为0.0399 nmol/L,并能明显抑制IL-12诱导的人皮肤淋巴细胞相关抗原(CLA)水平上调。其抗原结合能力以及抑制IL-12生物学活性能力与美国强生公司抗体药Stelara(ustekinumab)相当或更优。结论全新构建的单克隆抗体MAB1可作为IL-12通路的高亲和力阻断剂,从而成为自身免疫疾病(例如斑块型银屑病)治疗用新药的临床候选药物。     

单克隆抗体亲和力常数的简易测定

<正> 在我们成功制备抗人类重组基因α_1-干扰素(rHu-IFN-α_1)单克隆抗体杂交瘤细胞株基础上,我们准备选择亲和力适中的单抗来制备亲和层析柱,以纯化相应抗原。由于放射免疫测定单抗亲和力常数(Kaff)要求高,较难广泛应用。现我们采用Beatty等改进的间接ELISA测定了五种单抗的Kaff     

日本乙型脑炎病毒单克隆抗体的抗原结合位点及亲和力测定

本研究应用快速酶联免疫吸附试验双抗体夹心法(RDS-ELISA),对6株抗日本乙型脑炎病毒(JEV)单克隆抗体(单抗)的抗原结合位点及相亲和力进行了测定。通过ELISA相加试验证实,6株单抗识别5个不同的抗原位点。2H_4和2F_2的相加指数小于50％,表明二者识别相同的抗原位点,而其余单抗则具有不同的抗原位点。由本测定可知,JEV表面至少有5种不同的抗原决定簇。 从50％最大结合的单抗浓度分析可知,6株单抗的相对亲和力为nG_2>2H_4>2F_2>mG_9     

抗原表位定向选择的人源抗TNF-αFab的鉴定

目的对通过抗原表位定向选择技术（ＥＧＳ）所筛选到的２株人源化ＴＮＦ－α抗体Ｆａｂ段进行分析鉴定。方法测定可变区基因的序列,用亲本鼠单抗Ｚ８进行竞争ＥＬＩＳＡ,用Ｌ９２９细胞检测其体外中和ＴＮＦ－α的活性,并用硫氰酸铵洗脱法比较与亲本鼠单抗的亲和力。结果基因测序表明２株抗体ＶＨ相同,属人ＶＨⅠ亚群;Ｖκ分别属人ＶκⅠ、ＶκⅢ亚群;竞争抑制实验表明所获人源抗体片段与亲本鼠源抗体是针对ＴＮＦ－α的同一抗原表位;体外中和实验证明此抗体片段能中和ＴＮＦ－α对Ｌ９２９细胞的毒性;该抗体片段的亲和力略低于原鼠单抗Ｚ８。结论用ＥＧＳ方法获得的人源抗体片段基本保持了原鼠单克隆抗体Ｚ８的特性     

一组抗肿瘤单克隆抗体相对亲和常数的测定

本文用ABC-ELISA夹心法测定的终点浓度值分析了一组15种抗人结肠癌McAbs的相对亲和常数。结果是各McAb的相对亲和力各有不同,最高达4.15×10~(-12),最低为6.25×10~(-10)。实验表明本法用于针对复杂而微量的肿瘤抗原的测定是可行的,而且本法可一次测定多个这样的McAbs的相对亲和常数。亦不需标记被测抗体或抗原。故方法简便;且灵敏度高,重复性好,这对有关的研究具有参考价值。     

抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

目的 制备抗SARS病毒N蛋白的单克隆抗体并研究其初步应用。方法 用基因重组N蛋白免疫小鼠，取免疫后的鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选分泌抗SAPS病毒N蛋白单克隆抗体细胞株。将阳性细胞株接种小鼠腹腔制备单克隆抗体腹水并对抗体进行纯化，分析纯化抗体的相对亲和力。选择亲和力较高的抗体制备检测SARS病毒抗原的酶联免疫诊断试剂，并对其敏感性和特异性进行分析。结果 共获得11株单克隆抗体细胞株，其中3株单抗与N蛋白具有较高的亲和力，4株纯化单抗与N蛋白反应很弱，其余4株单抗介于两者之间。用亲和力较高的单抗制备检测SARS病毒抗原的诊断试剂，其敏感性可达31PFU／ml，而且与其他呼吸道病毒无交叉反应。结论 该试剂特异性较好，可用于SARS病毒抗原的检测，其敏感性仍需用临床急性期样品进行评价。     

BSA免疫动物过程中抗原抗体亲和动力学特性的研究

目的 本课题使用牛血清白蛋白(BSA)作为抗原,通过对小鼠和家兔进行连续多次免疫和间隔长久免疫,探讨不同免疫周期下抗体产生及亲和力成熟的动力学变化规律.方法 采用ELISA和毛细管电泳测定抗体抗原的亲和常数.结果 伴随免疫次数的增加,特异性抗体效价持续增强.抗体亲和力水平在二次免疫应答时存在一个明显的突变过程,小鼠的抗体亲和常数从1.6×108 L/mol上升到6.9×108 L/mol.随后免疫次数虽然继续增加,但亲和力变化趋于稳定,最终稳定于7.2×108 L/mol,而B细胞对抗原的亲和力会持续增强.结论 抗体抗原亲和力随免疫次数的增加趋向饱和,BSA的线性表位为优势表位,随免疫次数的增加比重逐渐增强.     

硫氰酸盐洗脱法测定噬菌体抗体的相对亲和力

目的　建立一种测定噬菌体抗体相对亲和力的方法。方法　参照硫氰酸盐洗脱法测定完整抗体分子和Fab段相对亲和力的方法 ,在ELISA实验中以酶标抗M13为二抗检测 5个单克隆噬菌体抗体的相对亲和力 ,并与可溶性Fab段的相对亲和力进行比较。结果　噬菌体抗体可以耐受硫氰酸盐的洗脱 ,用硫氰酸盐洗脱法测定 5个噬菌体抗体所得亲和力排序与测定其相应可溶性抗体分子片段所得结果一致。结论　硫氰酸盐洗脱法可用于噬菌体抗体相对亲和力的测定。     

单克隆抗体亲和力的测定及其意义

随着单克隆抗体杂交瘤技术日益广泛的应用,需要对获得的单克隆抗体(McAb)进行系统地分析鉴定,以确定其在各种免疫学试验中的价值。除了对McAb的免疫球蛋白链理化性质、结合抗原的特异性、以及检测抗原时的敏感度进行分析外,测定McAb对特定抗原的结合亲和力(affinity),对选择合适的McAb用于某一特定目的十分重要。     

MHC—抗原肽—TCR亲和力与TH1／TH2细胞分化

ＭＨＣ－抗原肽－ＴＣＲ亲和力是影响Ｔ辅助细胞分化的重要因素之一，抗原肽与ＭＨＣ之间亲和力越高越有利于ＴＨ１细胞分化，亲和力越低越有利于ＴＨ２细胞的分化；抗原浓度的变化可以调变抗原递呈细胞表面加工后抗原决定簇的密度；抗原肽－ＭＨＣ复合体与ＴＣＲ之间亲和力越越有利于ＴＨ１细胞分化，反之亦然。ＭＨＣ－抗原肽－ＴＣＲ之间亲和力的不同会导致ＣＤ３ζ链胞内区磷酸化顺序的改变，可能会使亲和力不同的“量变”信号转     

单克隆抗体对HFRS病毒两种粗制抗原相对亲和力的测定

采用ELISA测定32株抗HFRS病毒McAb对该病毒两种粗制抗原的相对亲和力,发现每一株McAb对两种病毒抗原的亲和力相同或基本相同,而各株McAb对同一病毒抗原的亲和力则有所不同,有些差别很大。按50％最大结合浓度分析,可分为3组。1组13株McAb为0.003～0.8μg/ml,Ⅱ组9株McAb为0.1～8μg/ml,Ⅲ组10株McAb为50～300μg/ml。这一结果为选择应用这些McAb提供了依据。     

来自噬菌体抗体库识别KG1a细胞的scFv5C1的高效表达、纯化及其生物学特性

目的为深入研究源于噬菌体抗体库特定单链抗体（scFv）的功能和其识别抗原的分子特征,将识别KG1a细胞的单链抗体5C1scFv高效表达、纯化;用scFv测定未知抗原的相对分子质量（Mr）;并研究5C1scFv对KG1a部分细胞生物学特性的影响。方法基因重组构建表达5C1scFv的载体pSTE-5C1,在大肠杆菌中诱导表达,金属离子螯和亲和层析法纯化,获得高纯度的活性5C1scFv;借助生物素-链亲和素的高亲和力和高灵敏度的显色系统,用Westernblot分析其识别的KG1a细胞膜蛋白的Mr;用聚集实验分析5C1scFv对KG1a细胞同型聚集的影响。结果5C1scFv在大肠杆菌中获高效表达,纯化后活性蛋白产量可达每升培养物50～60mg,纯度大于95%;成功地测定了其识别抗原的Mr为（85.0/124.5）×103;并确认5C1scFv以浓度依赖方式抑制KG1a细胞的同型聚集。结论高效表达纯化的5C1scFv特异性识别Mr为（85.0/124.5）×103的KG1a细胞膜表面分子,此分子可能是一种在KG1a细胞表面表达的参与细胞同型聚集的分子或受体。这些结果为进一步深入研究抗原本质及克隆抗原分子基因奠定了良好的基础。     

抗TSLP 全人源单链抗体的体外亲和力成熟

目的：对抗TSLP-scFv全人源单链抗体进行单点突变,以提高其亲和力。方法：本研究前期筛选了特异性好的抗TSLP-scFv,本研究利用Discovery Studio系统模拟TSLP和抗TSLP-scFv 三维结构,进行分子对接,对结合表位氨基酸进行随机突变,选取可显著提高其亲和力的氨基酸突变点,根据突变位点设计引物,采用重叠延伸PCR对氨基酸位点进行突变。将突变后的scFv基因与表达载体pLZ16连接,转化E.coli DH5αF′,表达后筛选亲和力提高的抗TSLP-scFv。结果：DS系统筛选出可以提高scFv亲和力的5个单点突变氨基酸位点,PCR扩增出突变后的抗TSLP-scFv DNA片段大小为1 000 bp左右。将测序正确的菌株进行表达,通过ELISA筛选出与抗原结合力提升的抗TSLP-scFv;通过生物大分子相互作用技术,测定单抗的亲和力,突变后的scFv M4亲和力较突变前提高了10倍左右。结论：成功提升了抗TSLP-scFv全人源单链抗体的亲和力。     

人血管内皮钙黏蛋白5单克隆抗体的制备及应用

目的制备并鉴定人血管内皮钙黏蛋白5(VECDH5)的单克隆抗体(m Ab)。方法用重组原核人VECDH5蛋白免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术进行细胞融合;间接ELISA筛选阳性克隆,得到稳定分泌抗VECDH5抗体的杂交瘤细胞株,ELISA测定其效价;Western blot法、流式细胞术、免疫荧光细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定其特异性及抗原表位。结果制备并获得1株可分泌特异性抗VECDH5的杂交瘤细胞株(2C11)。ELISA测定腹水效价高达1∶10 000。多种方法均证实该抗体能特异性识别人VECDH5蛋白,并可在上述不同方法中应用。经抗原表位鉴定,研究制备的2C11识别的氨基酸序列为LDREVVPWYNLTVEA。结论成功制备了亲和力高、特异型好的抗人VECDH5的m Ab。     

正常成人和SLE、肝病患者血清中的IgA_1和IgA_2

以前由于难以制备对IgA亚类有特异性1弓8·的高亲和力的抗血清,阻碍了对其亚类的研究。这两亚类间在结构上的不同,在于少量氨基酸代替了CH:及CH:功能区中的氨基酸,而且绞链区中8一氮基酸序列在IgA,中重复出现,但在IgA:中则丢失。用常规抗血清很少能识别出这种有决定意义的抗原区来。