COX-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞生长能力及VEGF表达的影响

目的:评估脂质体介导环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(AsODN)对皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16生长及血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法:将COX-2无义寡核苷酸(NsODN)和AsODN用脂质体分别导入Colo-16细胞中,克隆并观察COX-2 AsODN对细胞的生长抑制作用.Hoechst33258荧光染色法和流式细胞仪观察Colo-16细胞凋亡形态学变化及凋亡率.Western blot检测VEGF表达水平.结果:COX-2 AsODN作用于Colo-16细胞后,增殖能力受到抑制,克隆形成率下降(P<0.05),细胞出现明显凋亡,COX-2 AsODN组细胞早期凋亡率显著高于对照组(P<0.05);VEGF表达明显下调.结论:COX-2AsODN能够抑制Colo-16细胞体外生长,诱导其凋亡,并能显著下调VEGF表达.     

环氧合酶-2反义寡核苷酸对鳞状细胞癌Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2表达的影响

目的:研究环氧合酶(COX)-2反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,AsODN)对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)表达的影响。方法:免疫细胞化学法检测Colo-16细胞中COX-2蛋白表达;免疫荧光显微镜观察转染情况;蛋白免疫印迹(Western blot)及半定量反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测Colo-16细胞MMP-2蛋白和MMP-2mRNA表达水平。结果:Colo-16细胞中COX-2蛋白阳性表达,并分布在胞质、胞核;Colo-16细胞胞质和胞核可见荧光标记的COX-2无义寡核苷酸、反义寡核苷酸;Western blot及RT-PCR检测结果显不COX-2反义寡核苷酸作用Colo-16细胞48 h后,MMP-2表达显著下调(P0.05)。结论:COX-2反义寡核苷酸能有效下调Colo-16细胞MMP-2表达,提示COX-2反义寡核苷酸可能通过抑制MMP-2表达来阻断皮肤鳞状细胞癌的浸润、转移。     

环氧合酶-2反义寡核苷酸对Colo-16细胞增殖及环氧合酶-2表达的影响

目的　研究环氧合酶（COX）-2反义寡核苷酸（AsODN）对人皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖的抑制作用及COX-2表达的影响。方法　人工合成COX-2 AsODN,利用脂质体将不同浓度（50,100,200,400 nmol/L）反义寡核苷酸转染入Colo-16细胞,免疫荧光显微镜观察转染情况;采用噻唑蓝（MTT）法检测Colo-16细胞的增殖情况;Western印迹及半定量逆转录PCR检测Colo-16细胞COX-2蛋白和mRNA表达水平。结果 不同浓度的COX-2 AsODN对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用（P < 0.05）,400 nmol/L反义组在48 h抑制率最高,达60.3%;COX-2 AsODN转染Colo-16细胞后,COX-2蛋白和mRNA表达明显下调,50、100、200、400 nmol/L组COX-2蛋白灰度值分别为0.763 ± 0.070、0.600 ± 0.065、0.430 ± 0.074、0.251 ± 0.045,与阴性对照组相比差异均有统计学意义（P < 0.05）;COX-2 mRNA表达量随COX-2 AsODN浓度的增加而减少,50、100、200、400 nmol/L组COX-2 mRNA灰度值分别是0.778 ± 0.025、0.602 ± 0.041、0.417 ± 0.031、0.297 ± 0.051,各组间COX-2 mRNA表达差异有统计学意义（F = 132.48,P < 0.01）。结论 COX-2 AsODN对Colo-16细胞的体外增殖有抑制作用,并能下调COX-2蛋白及其mRNA在Colo-16细胞中的表达,提示COX-2 AsODN有潜在治疗皮肤鳞状细胞癌的作用。     

雷帕霉素对Colo-16细胞系Stat3表达的影响

目的研究雷帕霉素对皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞系Stat3表达的影响。方法用不同浓度的雷帕霉素处理Colo-16细胞,Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;Western-blotting法检测Colo-16细胞Stat3,P-Stat3蛋白表达水平。结果雷帕霉素能够诱导Colo-16细胞凋亡,荧光染色可见细胞核染色质凝聚、核裂解的形态学改变;在雷帕霉素作用后Colo-16细胞Stat3,P-Stat3表达显著下调。结论雷帕霉素能诱导Colo-16细胞凋亡,其作用机制可能与Stat3表达下调有关。     

他扎罗汀体外诱导Colo-16细胞凋亡的研究

目的:研究他扎罗汀诱导体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞的凋亡.方法:用不同浓度的他扎罗汀处理Colo-16细胞,流式细胞术检测Colo-16细胞早期凋亡率;Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;印迹杂交法测定caspase 3蛋白表达水平;半定量逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)测定caspase 3 mRNA的表达.结果:他扎罗汀显著增加Colo-16细胞的早期凋亡,且Colo-16细胞早期凋亡率与他扎罗汀呈浓度依赖性(P<0.05);荧光染色可见细胞核染色质固缩、核破碎;活化的caspase 3表达显著增强,caspase 3 mRNA表达显著增强.结论:他扎罗汀在体外可诱导Colo-16细胞凋亡,caspase 3的活化参与此凋亡过程.     

西罗莫司体外诱导Colo-16细胞凋亡的研究

目的 研究西罗莫司对体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞凋亡的影响。方法 用不同浓度的西罗莫司处理Colo-16细胞,以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测西罗莫司对Colo-16细胞体外增殖的影响;AnnexinV-FITC和PI双染检测Colo-16细胞凋亡率;Hoechst33258荧光染色法观察凋亡细胞的形态学变化;半定量逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）测定Bcl-2、Bax mRNA的表达。结果 不同浓度的西罗莫司对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用,这种抑制作用与西罗莫司的作用时间和剂量呈明显的依赖关系（P < 0.05）。西罗莫司显著增加Colo-16细胞的早期凋亡,西罗莫司（50,100,150, 200 nmol/L）作用48 h后诱导Colo-16细胞的早期凋亡率分别为7.26% ± 0.26%、8.34% ± 0.19%、9.86% ± 0.14%、11.92% ± 0.15%,与对照组1.53% ± 0.09%比较,差异有统计学意义（P < 0.05）,且Colo-16细胞早期凋亡率与西罗莫司浓度呈剂量依赖关系（r = 0.955,P = 0.000）。荧光染色可见细胞核染色质凝聚、边集、核裂解的形态学改变;Bcl-2 mRNA表达显著下调而Bax mRNA的表达显著增强。结论 西罗莫司在体外能诱导Colo-16细胞凋亡,其发生机制可能与其调节Bcl-2、Bax等凋亡调控基因的表达有关。     

他扎罗汀对Colo-16细胞体外增殖的影响及其机制的研究

目的:研究他扎罗汀对体外培养的皮肤鳞状细胞癌细胞株Colo-16细胞体外增殖的影响,并探讨其机制.方法:用不同浓度的他扎罗汀处理Colo-16细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定Colo-16细胞增殖活性;免疫组化染色技术及免疫印迹法分别测定Colo-16细胞Bcl-2、Bax蛋白表达水平.结果:不同浓度的他扎罗汀对Colo-16细胞体外增殖均具有抑制作用,其抑制作用呈明显的时效和量效关系(P<0.05);他扎罗汀作用Colo-16细胞后,Bcl-2蛋白表达明显下调,Bax表达明显增强.结论:他扎罗汀能抑制皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞的增殖,其机制与Bcl-2蛋白表达下调和Bax表达增加有关.     

K17反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和K17表达的影响

目的研究脂质体介导角蛋白17(K17)反义寡核苷酸对培养人角质形成细胞增殖和K17表达的影响。方法利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K17寡核苷酸基因片段导入体外培养的人角质形成细胞系HaCaT,应用MTT法检测其对HaCaT细胞增殖的影响,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测K17mRNA水平的变化,并以蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学结合激光扫描共聚焦显微镜检测K17蛋白水平的改变。结果脂质体介导的K17反义寡核苷酸转染HaCaT细胞后,细胞增殖受到明显抑制,同时细胞中K17mRNA和蛋白的表达明显下降,而正义寡核苷酸组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无明显变化。结论应用反义技术封闭K17基因,可以阻遏角蛋白K17基因和蛋白的表达,抑制角质形成细胞的体外生长和增殖能力。     

存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和凋亡的影响。方法以脂质体介导存活素反义寡核苷酸转染体外培养的角质形成细胞。采用MTT方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞生长曲线的影响;采用RT-PCR方法观察存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞存活素表达水平的影响;采用流式细胞仪检测存活素反义寡核苷酸对角质形成细胞细胞周期和凋亡的影响。结果存活素反义寡核苷酸作用于角质形成细胞后,细胞增殖受到明显抑制,存活素mRNA表达水平明显下降,细胞出现明显的凋亡现象。结论存活素反义寡核苷核酸能够抑制角质形成细胞增殖,促进角质形成细胞凋亡。提示存活素可能会成为一个新的治疗银屑病的靶分子。     

RNA干扰抑制表皮生长因子受体表达对Colo-16细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的 探讨靶向表皮生长因子受体（EGFR）基因的短发夹RNA（EGFR-shRNA）对皮肤鳞状细胞癌Colo-16细胞生长和雷帕霉素敏感性的影响。方法 构建针对EGFR序列特异的shRNA表达载体,用脂质体转染Colo-16细胞。实验分正常细胞组、脂质体组、阴性对照组、阳性干扰组。分别采用免疫细胞化学和Western印迹测定EGFR蛋白的表达;噻唑蓝（MTT）法检测Colo-16细胞对雷帕霉素的敏感性;流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果 EGFR-shRNA可明显抑制Colo-16细胞EGFR的表达,抑制率达43.3%（F = 44.6,P < 0.05）,并将Colo-16细胞对雷帕霉素的敏感性提高2.44倍。阳性干扰组Colo-16细胞的凋亡率为（12.65 ± 0.091）%,与正常细胞组差异有统计学意义（F = 2042.9,P < 0.05）。结论 针对EGFR的质粒表达载体可以有效抑制Colo-16细胞EGFR的表达,增强Colo-16细胞对雷帕霉素的敏感性,并诱导其凋亡。     

三氧化二砷诱导人鳞状细胞癌细胞凋亡的研究

目的：研究三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3)诱导人鳞状细胞癌细胞系Colo-16细胞凋亡，探讨As2O3对鳞状细胞癌的临床应用意义。方法：应用MTT分析、流式细胞仪分析和DNA凝胶电泳分析等实验方法，观察了As2O3诱导人鳞状细胞癌细系Ｃolo-16细胞凋亡过程。结果：As2O3能同时诱导Colo-16细胞凋亡和坏死，并且具有浓度和时间依赖性。结论：As2O3可以诱导鳞癌细胞系Colo-16细胞凋亡，抑制细胞增生活跃，并有时间和浓度的依赖性。     

反义寡核苷酸阻遏角蛋白14的表达

目的 研究脂质体介导角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)阻遏人角质形成细胞K14基因和蛋白的表达及抑制体外增殖活性的效果.方法 人表皮角质形成细胞原代培养,3~10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化(SABC)方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响.结果 脂质体介导的K14反义寡核苷酸转染角质形成细胞后,能有效地抑制角质形成细胞中K14基因的表达;48h后可阻遏K14蛋白表达;流式细胞仪检测见反义寡核苷酸处理组细胞周期发生明显改变,G₁期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降.而正义寡核苷酸1组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此变化.结论 应用反义技术封闭K14基因,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖.     

Bcl-2 and bcl-xL antisense oligonucleotides induce apoptosis in melanoma cells of different clinical stages

Recent clinical studies have shown the promise of bcl-2 antisense therapy in patients with melanoma. To further demonstrate the importance of bcl-2 and validate the related antiapoptotic protein bcl-xL as targets for antisense therapy in melanoma, their implication as survival factors in melanoma cells of different clinical stages as well as in normal melanocytes was investigated. Primary cell cultures derived from 17 melanomas, the cell line A375, and normal melanocytes from healthy donors were treated with antisense oligonucleotides targeting either the bcl-xL mRNA or the bcl-2 and the bcl-xL mRNAs simultaneously. Bcl-2 and bcl-xL expression in cells was analyzed by real-time polymerase chain reaction and Western blotting. Cell viability was assessed in 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide and apoptosis assays. Bcl-2 expression was low in melanoma cells of stages I, II, and III, hardly detectable in A375 cells, but high in normal melanocytes. Bcl-xL expression was high in all cell types tested. As shown in A375 cells and the stage III melanoma cells 0513, both the bcl-xL monospecific oligonucleotide 4259 and the bcl-2/bcl-xL bispecific oligonucleotide 4625 effectively reduced tumor cell viability by induction of apoptosis with IC50 values ranging from 200 to 350 nM. Oligonucleotide 4625 proved to be superior to 4259, as it significantly reduced the viability of cells from all melanoma stages. Both oligonucleotides reduced also the viability of normal melanocytes. Our data suggest that bcl-2 and bcl-xL are promising targets for antisense therapy of melanoma, and that the simultaneous downregulation of their expression may provide additional clinical benefit.