调节破骨细胞分化的RANK特异性cDNA片段的研究

【目的】 在生理条件下寻找调节破骨细胞(OC)分化的核转录因子NF-κB受体激动剂(RANK)的特异性cDNA功能片段,为研究OC分化机制提供理论基础。【方法】 先将RANK膜内部分的1.2 kb大小的cDNA分成20个片段,用缺失突变的方法构建出20个由肿瘤坏死因子受体1和RANK跨膜和膜内部分组成的TNFR1/RANK嵌合体的突变体,每一个突变体在RANK膜内部分含60 bp缺失。再将RANK-cDNA第1 561 ~ 1 680 bp之间的120 bp片段分为10个片段,构建10个新的TNFR1/RANK突变体,每一个突变体在其RANK膜内部分含12 bp缺失。用包装细胞Plat E分别将各突变体包装成逆转录病毒,通过感染分别将这些逆转录病毒转染到肿瘤坏死因子受体1和2基因敲除小鼠的骨髓巨噬细胞(BMM)中。用TNFɑ刺激后。观察哪一个突变体不能诱导OC形成。【结果】 首先发现表达TNFR1/RANK1561-1620或TNFR1/RANK1621-1680的逆转录病毒感染的BMM 不能分化成OC,然后在RANK-cDNA第1 561 ~ 1 680 bp这个大的片段中又发现表达TNFR1/RANK1597-1608。TNFR1/RANK1609-1620。TNFR1/RANK1621-1632或TNFR1/RANK1633-1644的逆转录病毒感染的BMM也不能分化成OC。【结论】 RANK-cDNA第1 597 ~ 1 644 bp之间的48 bp片段(5′-gggcaggtgatgaacttcaagggtgacatcatcgtggtgtatgtcagc-3′)对OC形成起决定性作用。     

TNFR1／RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义

 【目的】构建肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）膜外部分和核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）跨膜及膜内部分相结合的嵌合体，探讨其在破骨细胞（OC）分化中的意义。【方法】克隆TNFR1／RANK嵌合体的cDNA，用plat E将其包装成逆转录病毒。通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFRl／R2基因的小鼠（TNFR1-／R2-）骨髓巨噬细胞（BMM）中；用TNFQ刺激，分别观察OC的分化及骨的重吸收能力；用Western Blot方法证实TNFR1／RANK是通过NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】在TNFa刺激下，BMM能分化成OC，而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFQ刺激BMM5min后磷酸化的NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】TNFR1／RANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能，可作为研究RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。     

TNFR1／RANK嵌合体的构建及其在研究破骨细胞分化中的意义

【目的】构建肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）膜外部分和核转录因子NF-κB受体激动剂（RANK）跨膜及膜内部分相结合的嵌合体，探讨其在破骨细胞（OC）分化中的意义。【方法】克隆TNFR1／RANK嵌合体的cDNA，用plat E将其包装成逆转录病毒。通过感染将这种逆转录病毒转染到敲除TNFRl／R2基因的小鼠（TNFR1-／R2-）骨髓巨噬细胞（BMM）中；用TNFQ刺激，分别观察OC的分化及骨的重吸收能力；用Western Blot方法证实TNFR1／RANK是通过NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的磷酸化来调节OC的分化和功能。【结果】在TNFa刺激下，BMM能分化成OC，而且分化出的OC能明显地导致骨质破坏。TNFQ刺激BMM5min后磷酸化的NF-κB、JNK、P38和ERK蛋白的表达明显增强。【结论】TNFR1／RANK嵌合体具有完整的分子结构和生物功能，可作为研究RANK结构、功能及其信号途径的一个简便、有效的生物工具。     

2型登革病毒诱导ECV304细胞凋亡及死亡受体的表达变化

【目的】探讨登革病毒诱导ECV304(人脐静脉内皮细胞)细胞凋亡与胞膜死亡受体TRAILR、TNFR、Fas的表达水平的相关关系及其意义。【方法】用2型登革病毒(Dengue Virus Type2,DV2)感染ECV304细胞,流式细胞技术检测ECV304感染前、后细胞凋亡变化及死亡受体TRAILR1-4、TNFR1-2、Fas的表达水平。【结果】登革病毒感染后ECV304细胞凋亡数增加,感染前细胞凋亡数约5%(9.46%±5.07%),而感染后约28%(24.31%±3.70%),感染前、后两组细胞凋亡数经t检验,P<0.05;病毒感染后细胞表达Fas百分比增加,感染前为41%(38.95%±8.50%),而感染后为79%(67.47%±10.05%),感染前、后Fas表达经t检验,P<0.05;而TRAILR1-4,TNFR1-2表达水平甚低,感染前后无明显改变。【结论】DV2感染可诱导血管内皮细胞凋亡,其凋亡与Fas/FasL的表达改变有关,但细胞凋亡的信号转导通路有待进一步研究。     

中国6个群体线粒体DNA Region V的缺失多态性

【目的】研究中国广东地区汉族、华东地区汉族、内蒙古汉族、云南白族、内蒙古蒙古族、新疆维吾尔族等6个群体在线粒体DNA Region V的多态性。【方法】PCR扩增后采用变性高效液相色谱技术分离片段，检测线粒体DNA Region V9 bp缺失的频率。【结果】在中国6个群体中发现标准型、缺失型和3型3种多态类型，9bp缺失频率在6个群体分别为21．4，18．0，14．0，16．9，7．0，10．4。【结论】中国6个群体在线粒体DNA Region V均存在9bp缺失的多态性，6个群体间的缺失频率存在差异。     

基于MUC1细胞内段抗炎多肽的体外构建

【目的】 在前期证实粘蛋白1(MUC1)通过封闭TLRs信号通路抑制呼吸道合胞病毒(RSV)诱导的呼吸道炎症的基础上,以TLRs细胞内段TIR结构域相互作用的结构特点为基础,通过生物信息学分析确定MUC1胞内段(MUC1 CT)抗炎多肽的候选区域,并构建各种候选区域的缺失突变体真核、原核表达载体,进而找出发挥抗炎作用的多肽片段,并在体外验证其抗炎效果。 【方法】 根据生物信息学技术预测分析MUC1 CT潜在的抗炎片段;构建MUC1 CT各种缺失突变体的真、原核表达载体,即pEGFP-C2-MUC1 CT mutants、pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants以及pET14b-MCS-SBP-EGFP-MUC1 CT mutants-TAT;转染pEGFP-C2-MUC1 CT mutants入A549细胞(来源于II型肺泡上皮细胞),利用荧光显微技术明确各绿色荧光蛋白标记的突变体蛋白的细胞内定位;转染pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants(无异常定位的突变体)入A549细胞,待MUC1 CT mutants高表达后,用RSV感染各组细胞一定时间后,使用ELISA方法测定细胞培养上清中TNF-α的水平,筛选发挥抗炎作用的多肽片段;在明确MUC1 CT的核心抗炎片段的基础上,转化pET14b-SBP-EGFP-MUC1 CT mutant入大肠杆菌(DE₃),体外表达并纯化含有穿透肽(TAT)的MUC1 CT突变多肽,预先与A549细胞孵育,再给予RSV感染,通过测定上清中的TNF-α的水平,进一步明确具有抗炎活性的片段。 【结果】 (1)通过生物信息学分析MUC1 CT,确定四处具有潜在抗炎活性的候选区域,分别是氨基酸位点7-14位,19-26位,36-40位,44-53位;(2)成功构建基于pEGFP-C2和pcDNA3-HA真核表达载体的四种缺失突变体的真核表达载体;(3)通过pEGFP-C2-MUC1 CT mutants明确各种突变体的细胞内定位情况;(4)利用pcDNA3-HA-MUC1 CT mutants明确MUC1 CT的抗炎片段;(5)通过带有TAT的MUC1 CT突变多肽进一步证实该段的抗炎活性。 【结论】 MUC1 CT抗炎片段在体外实验中具有抗炎性。     

c-myb反义RNA重组载体构建及其包装细胞株的建立

【目的】构建反义c-myb重组逆转录病毒载体并建立其包装细胞株。【方法】采用RT-PCR方法,获取目的基因,通过TA克隆方法克隆入pUC19,再反向亚克隆入逆转录病毒载体pDOR中。采用DOTAP法将重组逆转录病毒载体转入包装细胞,以NIH3T3细胞为靶细胞测定产病毒滴度。【结果】序列测定结果与GenBank中序列一致。c-myb基因片段已定向克隆入pDOR。细胞转染表明,已形成稳定的包装细胞株PA317/pDOR-myb,产病毒滴度达5.2×104～9.5×104CFU/mL。【结论】成功构建了含有反义c-myb的重组逆转录病毒质粒,并建立其包装细胞株。     

解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠OX62、Fas及TNFR1表达的影响

【目的】探讨解毒化瘀颗粒对急性肝衰竭大鼠OX62、Fas及肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)表达的影响。【方法】将30只Wistar大鼠随机分为3组,即空白组、模型组、中药组,每组10只。以D-氨基半乳糖(D-Gal N)600 mg/kg联合脂多糖(LPS)20μg/kg一次性腹腔注射复制急性肝衰竭大鼠模型。中药组大鼠在造模前5 d即开始给予解毒化瘀颗粒预处理,造模成功后24 h处死各组大鼠取肝组织,采用反转录实时定量聚合酶链反应(RT-q PCR)法检测OX62 m RNA表达,采用免疫组织化学法检测OX62、Fas及TNFR1的表达。【结果】模型组大鼠肝组织OX62 m RNA,OX62、Fas、TNFR1蛋白表达水平显著增高,与空白组比较,差异均有统计学意义(P0.05);经解毒化瘀颗粒干预治疗,中药组大鼠肝组织OX62 m RNA,OX62、Fas、TNFR1蛋白表达水平下降,与模型组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。【结论】解毒化瘀颗粒可能是通过下调OX62、Fas及TNFR1的表达来调控免疫反应,进而抑制细胞毒性T细胞介导的肝细胞凋亡。     

KCNE1蛋白胞外肽段功能的研究

【立论依据】 KCNE1/KCNQ1(IKs)为电压依赖性钾离子通道,介导心肌细胞动作电位复极化3期中的IKs电流。KCNE1的突变会造成高致死性的LQT综合症(V型)。KCNE1为通道调控亚基,对通道功能的实现具有重要意义。在其调控下,通道表现为缓慢激活特征,失活速度减慢,并且通道电导率明显增大。KCNQ1单独形成的通道,表现为快速激活和快速失活,通道电导性较小。KCNE1是由129个氨基酸构成的单次跨膜蛋白,分胞外段(N端),跨膜段(M段)和胞内段(C端)。N端包含42个氨基酸,关于该段的功能,研究极少,对其认识仍不全面,仅被报道与蛋白转运有关。本课题主要探究该蛋白N端的功能,研究关于该段可能有的更多的生理功能,并分析该段核心功能区段。 【设计思路】 通过分子技术制备KCNE1的N端缺失突变体,将其分别与KCNQ1共表达:以蛋白质印迹技术获得上述突变体的蛋白表达差异图谱,从而了解各个突变体的蛋白表达差异;以细胞免疫染色方法观察各突变体的亚细胞定位情况,从而了解N端缺失的部位对细胞定位的影响;以全细胞膜片钳技术检测各突变体(与KCNQ1共表达)的通道电流特征,从而了解N端缺失的部位对KCNE1功能的影响。最后,通过以上数据的综合分析评估KCNE1N端的功能,以及N端的核心功能部位。 【实验内容】 KCNE1的N端缺失突变体的制备及其蛋白表达;野生型和突变体(与KCNQ1共表达)的细胞免疫染色;利用全细胞膜片钳技术,获得各缺失突变体与KCNQ1共表达后的通道功能的电生理数据。 【材料】 KCNE1、KCNQ1哺乳动物细胞系表达质粒;哺乳动物表达细胞系HEK293。 【可行性】 缺失突变体制备技术成熟,其他各项实验技术为实验室常用技术;理论基础充分,思路清晰;经文献查证对于KCNE1胞外段功能研究的尚无此类报道,因此该项目具有研究意义。 【创新性】 采用缺失突变体技术,通过多种实验方法从多个角度探讨蛋白特定部位的功能,是首次较深入探讨KCNE1蛋白特定区域的功能,对蛋白功能的深入了解,有助于积累临床治疗的理论依据。     

小鼠肿瘤坏死因子受体1基因的克隆及其与绿色荧光蛋白的融合表达

目的：构建小鼠肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）和绿色荧光蛋白（GFP）的融合基因真核表达质粒，然后在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达，为TNFR1的基因干预研究提供简便的判定手段。方法：从小鼠肝组织提取总RNA，RT-PCR扩增出TNFR1基因的cDNA片段，将目的片段克隆至pMD18-T载体。酶切和测序鉴定，然后将目的片段酶切回收后插到GFP表达载体pEGFP-N2中GFP基因序列的上游，构建TNFR1-EGFP融合基因真核表达载体pEGFP-TNFR1，将该重组质粒转染到CHO细胞后24—48h，用免疫组化技术检测TNFR1的表达情况。同时荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果：扩增出了长约1360bp的基因片段，并将其克隆至pMD18-T载体，酶切和测序鉴定无误；将pMD-TNFR1中TNFR1基因亚克隆至pEGFP-N2载体，酶切鉴定无误；重组质粒pEGFP-TNFR1转染CHO细胞后，免疫组化染色可见细胞有阳性棕染，同时荧光显微镜下也可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了小鼠TNFR1-EGFP融合基因真核表达质粒；重组质粒可在CHO细胞中表达出TNFR1-EGFP融合蛋白，为进一步的TNFR1基因干扰研究奠定了基础。     

Wilson病ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体构建及功能研究

【目的】构建ATP7B基因铜离子结合区缺失突变体,研究其在Tx小鼠肝细胞中的表达及功能。【方法】利用长片断PCR和质粒重组技术构建不同铜离子结合区的缺失体,脂质体介导转染Tx小鼠肝脏细胞,然后进行高铜、低铜孵育,观察ATP7B突变蛋白在细胞内的定向移动及对铜离子转运功能的影响。【结果】ATP7B基因1-4铜离子结合区逐个缺失后,ATP7B蛋白定向移动减慢至消失;5-6铜离子结合区缺失,细胞铜转运功能停滞。【结论】ATP7B基因6个铜离子结合区功能不同,其中1-4结合区主要根据铜浓度诱导ATP7B蛋白细胞内定向移动,而5-6结合区则直接参与铜离子细胞外转运。     

肿瘤坏死因子受体基因转移增强TNF杀伤肿瘤细胞作用的研究

目的 :探讨肿瘤坏死因子受体 (TNFR)基因转移对肿瘤细胞表面 TNFR表达量的影响 ,进而观察其对TNF杀伤肿瘤细胞作用的影响。　方法 :建立 TNFR的逆转录病毒表达载体 ,通过转染包装细胞 PA 317产生完整病毒颗粒 ;人前列腺癌细胞株 PC- 3m和小鼠 Renca肾腺癌细胞株经病毒感染后 ,检测其细胞表面 TNFR数量及TNF在体内外对其杀伤作用的变化。　结果 :TNFR基因转移前后 PC- 3m细胞表面与 TNF结合的位点数量分别为 2 912个 /细胞和 8872个 /细胞 (P<0 .0 5 ) ,Renca细胞表面与 TNF结合的位点数分别为 783个 /细胞和 36 78个 /细胞 (P<0 .0 5 )。 TNFR基因转染后 ,TNF在裸鼠体内对 PC- 3m和 Renca的肿瘤抑制率分别增强 1.8和 2 .1倍。　结论 :以逆转录病毒为载体的基因转移方法 ,可以提高肿瘤细胞表面 TNFR的表达量 ,从而增强 TNF对肿瘤细胞的体外杀伤作用和体内抑制作用     

maspin基因启动区的初步鉴定

目的：研究maspin基因表达的调控机制。方法：利用PCR技术扩增maspin基因5’上游启动区860bp(-765～ 95bp)不同的缺失片段,并将它们分别与荧光素酶(LUC)报告基因相连,构建了6种maspin—LUC报告基因表达质粒,通过转染实验检测maspin启动区不同长度片段在雄激素依赖性前列腺癌细胞(LNCaP)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞(PC-3M)中驱动荧光素酶表达的活性：并转染雄激素表达受体(AR)到PC-3M细胞,观察雄激素及其受体对不同片段表达活性的作用。结果：maspin基因启动区(-312～247bp)之间含有与雄激素受体相关的负性调控元件,在( 14～95bp)之间含有一个功能性的中文(Sp1)调控元件一结论：maspin基因的表达受雄激素受体及Sp1的调节。     

GSTM1基因缺失与非小细胞肺癌关系的病例对照研究

【目的】探讨谷胱甘肽硫转移酶 μ基因缺失与肺癌发生的关系。【方法】采用病例 对照研究方法和PCR检测手段分析谷胱甘肽硫转移酶 μ基因缺失在病例和对照组中的分布情况 ,并分析其与肺癌发生的关系。【结果】谷胱甘肽硫转移酶 μ基因 (GSTM1)缺失在病例组和对照组中的分布存在显著差异 (P <0 0 1) ,病例组中GSTM 1-/-基因型携带率较高 ( 6 1% ) ,而对照组则为 48% ;GSTM1-/-基因型是肺癌发生的重要危险因素 (OR为 1 7,P =0 0 4)。【结论】谷胱甘肽硫转移酶 μ基因缺失与肺癌的发生密切相关 ,GSTM 1-/ -是肺癌发生的重要宿主因素 ,并可能是肺癌遗传易感性的重要生物学标志。     

感染性早产患者血清、胎盘组织TNFRⅡ的表达水平及其与TNFRⅡ196基因多态性的关系

【摘要】 目的 探讨肿瘤坏死因子α受体Ⅱ（TNFRⅡ）基因第6外显子196T→G多态性与早产合并绒毛膜羊膜炎遗传易感性的关系。方法 对46例早产患者（根据胎盘病检有无绒毛膜羊膜炎分为早产感染组21例和早产非感染组25例）母血、胎盘组织和同期50例足月正常产母血、20例胎盘组织进行研究。应用RT-PCR技术测定胎盘组织中TNFRⅡ mRNA 的表达水平;采用ELISA法测定母血清可溶性TNFRⅡ(sTNFRⅡ)水平。采用PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对TNFRⅡ第6外显子196位点进行基因分型,分析该位点不同基因型间早产患者胎盘TNFRⅡ mRNA和母血sTNFRⅡ水平的差异。结果 ①在早产患者中TNFRⅡ基因196位点TG（GG）基因型与TT基因型比较,其对应的TNFRⅡ mRNA、sTNFRⅡ均有增高的趋势,但差异无统计学意义（P>0.05）。②孕妇胎盘组织中TNFRⅡ mRNA及血清中sTNFRⅡ水平在早产感染组增高,差异有统计学意义（P0.05）。早产组不同基因型与绒毛膜羊膜炎的相关性分析显示,TNFRⅡ基因TG+GG基因型与早产绒毛膜羊膜炎的发生可能相关（χ2=11.088, P<0.05）,TG+GG基因型OR值为12.65,95％CI为2.359~67.848,其发生绒毛膜羊膜炎的几率是TT基因型的12.65倍。结论 TNFRⅡ基因第6外显子196位点突变不引起早产孕妇TNFRⅡ转录、翻译水平改变,该基因196位点多态性却与感染性早产孕妇血清sTNFRⅡ、胎盘组织TNFRⅡ mRNA表达水平的增高有关,该位点多态性可以成为早期预测、诊断感染性早产的指标。     

维生素K对氟致睾丸功能损伤的作用研究

【立论依据】 长期摄入过量氟造成氟斑牙和氟骨症,同时男性生殖能力下降,甚至导致不育。维生素K在骨骼发育中有重要作用,促进血清中骨钙素(osteocalcin, OC)羧化,羧化骨钙素与羟基磷灰石结合能力增强,促进骨骼矿化,改善骨骼质量。BGP属于γ-羧基谷氨酸(γ-Carboxyglutamic acid, Gla)蛋白类,该蛋白为维生素K依赖型,睾丸组织含Gla蛋白。非羧化骨钙素(uncarboxylation Osteocalcin, ucOC)与睾丸内分泌功能密切相关,而维生素K可促进睾酮分泌。当氟骨症发生时,机体OC水平表现出明显变化,但ucOC水平变化尚无研究。 【设计思路】 以氟骨症动物模型入手,采用形态学、细胞生物学及分子生物学技术,研究维生素K通过OC与ucOC途径对氟致睾丸损伤可能作用途径与效果,为新疆高发地方病氟骨症发病机制积累实验数据与资料,探讨维生素K做为氟骨症治疗药物可能性。 【实验内容】 (1)复制饮用水氟骨症模型,Wistar大鼠自由饮用含氟化钠100 mg/L去离子水10周,以白垩状氟斑牙出现为建模成功标志,检测造模前后血中OC、ucOC浓度与睾丸形态功能变化。(2)观察不同类型维生素K对氟骨症大鼠骨骼及睾丸功能损伤不同作用效果。选用三种类型维生素K,维生素K1 10 mg/d/只皮下注射、维生素K3 10 mg/d/只皮下注射和维生素K4 4 mg/d/只灌胃,另设空白对照组与l,25-二羟维生素D组(0.10 μg/(kg·d)灌胃),给药20 d后检测大鼠骨骼与睾丸的形态学和功能学变化。(3)检测筛选出维生素K对氟骨症大鼠骨骼与睾丸中OC与ucOC表达的影响。给药方式与前同,给药前、后检测血清中OC与ucOC浓度、骨钙素N端各分子片段含量、骨与睾丸中两种OC及骨钙素N端各分子片段的蛋白与mRNA表达等。(4)数据采用SAS软件分析,组间比较用方差分析,计数资料用秩和检验Kruskal-Wallis法,相关性分析采用Pearson法。 【材料】 大鼠,氟化钠,三种维生素K,OC与ucOC检测试剂盒、抗体、引物,睾酮检测试剂盒等。 【可行性】 前期实验已完成,资料调研充分,指导教师有两项相关国家自然科学项目,实验平台具备条件。 【创新性】 (1)氟骨症骨相与非骨相损伤之间相互作用的研究思路。(2)氟骨症中维生素K与骨组织内分泌功能关系的研究角度。     

丙型肝炎病毒C,E2,NS3区基因嵌合重组载体的构建

【目的】构建包含丙型肝炎病毒（HCV）C区、E2区及NS3区的嵌合重组载体。【方法】设计合成3对寡核苷酸引物,用PCR法从HCV重组质粒pHCVc、pBE2和pGMXNS3-5中特异扩增出编码HCVC区、E2区和NS3区抗原的部分基因片段（501、603和900bp）,分别用HindⅢ、BamHⅠ、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后,逐个定向连接到质粒pcDNA3中,转化宿主菌XL1-Blue,分别用上述内切酶酶切及DNA测序鉴定重组质粒。【结果】酶切鉴定示所切下的片段大小均与预计相符,测序结果与文献报道序列及预计结果一致,证实符合表达框架。【结论】成功构建了HCV嵌合重组质粒pcDNA3-C-E2-NS3。     

以β-淀粉样蛋白为靶的单价及二价真核表达载体的构建和表达

 【目的】构建以β-淀粉样蛋白为靶单价及二价真核表达载体pcDNA3．1-Aβ1-42、pcDNA3．1-AB42x，并在真核细胞中表达目的蛋白。【方法】PCR法扩增编码B一淀粉样蛋白的目的基因，利用基因克隆技术构建单价及二价真核表达载体；应用酶切及测序鉴定真核表达载体构建成功后，用Western blot和细胞免疫组化染色检测其在真核细胞中的表达。【结果】相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段（分别为137bp和269bp），测序未发现突变；Western blot结果可见两条约为4ku和8ku的条带，细胞免疫组化染色可见阳性细胞。【结论】单价及二价真核表达载体构建成功；真核表达载体能在真核细胞中表达出目的蛋白。     

以β-淀粉样蛋白为靶的单价及二价真核表达载体的构建和表达

【目的】构建以β-淀粉样蛋白为靶单价及二价真核表达载体pcDNA3．1-Aβ1-42、pcDNA3．1-AB42x，并在真核细胞中表达目的蛋白。【方法】PCR法扩增编码B一淀粉样蛋白的目的基因，利用基因克隆技术构建单价及二价真核表达载体；应用酶切及测序鉴定真核表达载体构建成功后，用Western blot和细胞免疫组化染色检测其在真核细胞中的表达。【结果】相应的双酶酶切能够获得插入的目的基因片段（分别为137bp和269bp），测序未发现突变；Western blot结果可见两条约为4ku和8ku的条带，细胞免疫组化染色可见阳性细胞。【结论】单价及二价真核表达载体构建成功；真核表达载体能在真核细胞中表达出目的蛋白。