两株登革2型病毒E、NS1蛋白基因序列测定及其系统发生分析

目的 :对从登革出血热 (denguehemorrhagicfever ,DHF)病人血清分离到的一株登革 2型病毒 (denguevirustype 2 ,DEN 2B株 )和DEN 2NGC株作E、NS1蛋白部分基因序列测定并进行系统发生树分析 ,了解其变异及分子进化特证。方法 :利用RT PCR法扩增B株和NGC株E、NS1部分基因片段 ,PCR产物直接测序 ;利用DNAssist软件预测其氨基酸序列 ,以及PHYLIP软件的CLUSTAL方法绘制系统发生树。结果 :B株与NGC株E蛋白基因区第 1～ 4 76nt(4 76bp)碱基序列存在 8个位点的差异 ;编码氨基酸存在 4个位置的不同 ;NS1基因区第 5 89～ 1 0 0 …     

贵州自然界白纹伊蚊体内登划病毒带毒情况

目的 :利用细胞、分子生物学技术对贵州省自然界白纹伊蚊体内带登革病毒 (DEN)情况进行调查。方法 :采集贵州省9个地 (州 )市共计 18个县 (区 )白纹伊蚊幼虫标本 ,饲养为成蚊 ;制备蚊悬液 ,碘化钠法提取RNA ,用登革病毒NS1基因区通用引物经逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测DEN核酸 ,限制性内切酶酶切鉴定阳性PCR产物并分型 ;蚊悬液接种C6 /36细胞进行病毒分离 ,制作细胞片 ,间接免疫荧光法检测DEN抗原。结果 :从独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到 1株DEN 2型病毒 ,从凯里、黄果树和镇远 3处地方株白纹伊蚊体内检测出DEN核酸 ,用抗DEN 4型单克隆抗体经间接免疫荧光(IFA)和RT PCR产物酶切分型鉴定分别为登革病毒 2型、4型。结论 :贵州省存在DEN感染的自然循环     

登革2型病毒全长NS1基因真核表达载体的构建及序列分析

目的克隆登革2型病毒(DEN2)全长NS1基因，构建NS1基因的真核表达重组质粒。方法用RT—PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NSl基因序列，并定向克隆入pPICZαB的KpnⅠ／XbalⅠ位点，构建真核表达载体pPICZαB—NS1，转化E.coli DH5a菌。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。结果阳性质粒经PCR及KpnⅠ／XbaⅠ双酶切获得了一个核苷酸长度为1134bp的基因；序列测定证实该基因与DEN2(NGC株AF038403)NS1基因序列有99％同源。结论成功构建了含有DEN2全长NS1基因的真核表达载体DPICZαB—NS1，为NS1的进一步酵母表达奠定了良好的基础。     

贵州自然界白纹伊蚊体内登革病毒带毒情况

目的：利用细胞、分子生物学技术对贵州省自然界白纹伊蚊体内登革病毒(DEN)带毒情况进行调查。方法：采集贵州省9个地(州)市共计18个县(区)白纹伊蚊幼虫标本，饲养成蚊；制备蚊悬液，碘化钠法提取RNA，用DENNSl基因区通用引物经逆转录-聚合酶链反应(TR-PCR)检测DEN核酸，限制性内切酶酶切鉴定阳性PCR产物并分型；蚊悬液接种C6／36细胞进行病毒分离，制作细胞片，间接免疫荧光法检测DEN抗原。结果：从独山县麻尾镇白纹伊蚊标本中分离到1株DEN-2型病毒，从凯里、黄果树和镇远3处地方株白纹伊蚊体内检测出DEN核酸，用抗DEN1～4型单克隆抗体经间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR产物酶切分型鉴定，分别为登革病毒2型、4型。结论：贵州省存在DEN感染的自然循环。     

登革病毒1型和2型国内分离株NS1基因的扩增和克隆

登革病毒(DEN)为单链正股RNA病毒,其非结构蛋白NS1在病毒免疫反应中起重要作用。我们在NS1基因序列设计了一对通用引物,扩增序列长度为413bP。应用逆转录—聚合酶链反应成功地扩增了DEN1_-4型部分基因片段,采用该引物扩增国内分离株DEN1(GZ)和DEN2(HN91)同样出现一条特异扩增带,并发现国内分离株扩增产物的电泳迁移率与国际参考株有差别。因此我们应用低融点琼脂糖回收该DNA片段,并将DEN1(GZ)和DEN2((HN91)NS1基因部分片段分别克隆到Puc19质粒载体中。经Pst Ⅰ和Ecor Ⅰ双酶切分析和通用引物PCR鉴定证明重组质粒内含有NS1基因部分片段。并准备进行核苷酸序列分析,以进一步了解其核苷酸的变异与抗原性的关系,为我国登革热的预防和控制提供理论依据。     

白纹伊蚊贵州麻尾株垂直传播登革病毒实验研究

目的：研究白纹伊蚊贵州麻尾株对2型登革病毒(DEN—2)的经卵传递能力。方法：用DEN-2 NGC株感染白纹伊蚊贵州麻尾株，收集亲代及子1、2、3代蚊虫标本，提取亲代及子代蚊体内病毒总RNA，通过RT—PCR扩增蚊体内DEN—2病毒核酸，并用限制性核酸内切酶Hinf Ⅰ酶切鉴定。结果：感染白纹伊蚊贵州麻尾株后，子1～3代蚊体内均可检测出病毒核酸。结论：DEN-2能通过白纹伊蚊贵州麻尾株垂直传播，至少可以传3代。     

广州登革病毒1型NS2a-NS2b基因序列分析

目的对2004年广州军区总医院收治的1例疑似登革病毒感染者进行确诊,通过对病毒的基因序列分析。寻找该例感染病毒的可能来源。方法首先从疑似病人的血清提取血液RNA,用RT—PCR法对比较保守的病毒非结构蛋白NS2a-NS2b上的部分序列进行扩增,并进行基因克隆、测序及同源性分析。结果经RT-PCR和基因测序检测证实为DEN1感染;基因序列分析结果表明．该病毒与我室保存的1995年、1997年、1999年和2003年的DEN1流行株非结构蛋白NS2a-NS2b的部分序列同源性分别为90．8％、97．6％、100％和99．6％。结论该例疑似登革病毒感染患者被确诊为DEN1型病毒感染。与1999年广东省中山市的登革1型病毒流行株在部分非结构蛋白NS2a-NS2b上完全相同．并与1997年广东省潮州市和2003年广州市的流行株为同一基因型。由此初步推断,在我国可能已存在登革1型病毒的疫源地。     

禽流感病毒分离株NS基因同源性及等位基因类型分析

目的　克隆测定国内具有代表性的禽流感病毒 (AIV)的非结构 (NS)蛋白基因核苷酸序列 ,分析其同源性和等位基因类型 ,为进一步探索禽流感NS蛋白抗体监测方法奠定基础。方法　经RT PCR扩增了国内 3株H9N2、2株H5N1、2株H7N2亚型AIV分离株的NS蛋白基因 ,并把扩增的基因片段克隆到pGEM T载体中测序 ,将测序结果与GenBank中的核苷酸序列进行同源性比较 ,绘制基因进化树。结果　经测序获得了各AIV分离株NS基因的完整编码序列。同源性分析表明 ,3株H9亚型AIV的NS基因之间的同源性为 96 %～ 98% ;两株H5亚型AIVNS基因同源性为 91 6 % ;两株H7亚型AIV的NS基因同源性为 98 9%。H5和H9亚型分离株的NS基因之间的同源性均高于 90 % ;而H7N2亚型分离株与其它两种亚型分离株的NS基因同源性约为 6 0 %～ 70 %。在AIVNS基因系统发育进化树中 ,H5、H9亚型分离株都处于等位基因A群内 ;3株H9亚型分离株的进化关系较近 ,与香港、广东的部分H5N1病毒株起源相同 ,而 2株H5病毒的NS基因则处于不同分枝内 ;2株H7亚型分离株的NS基因都处于等位基因B群内 ,进化关系较近。结论　这 7株国内AIV分离株的NS基因之间的同源性差异较大 ,约为 6 0 %～ 99% ,且包括A、B两种类型的等位基因     

风疹病毒JR23株包膜糖蛋白E2的基因扩增与序列分析

目的：扩增风疹病毒（RV）JR23株包膜糖蛋白E2的基因片段，分析E2多二级结构特征及E2蛋白跨膜区结果，为研究E2基因结构与蛋白功能的关系。RV结构蛋白之间的相互作用奠定基础。方法：提取感染RV JR23株的BHK21细胞总RNA，利用RT－PCR方法扩增RV JR23株E2基因片段，将PCR产物测序；利用DNAstar软件分析JR23株E2多肽的二级结构特征；利用TmPred软件对E2蛋白的跨膜区进行预测分析。结果：利用BLAST软件分析测序结果，证明扩增产物为RV E2基因片段；DNAstar两个模型对E2多肽的α螺旋、β折叠等区域的分析有较大差异。尤其是β区，G－R模型的预测范围远大于C－F模型，二级结构中带电性与亲水区的分析结果与E2蛋白的已知功能相符；TmPred预测的有意义跨膜区有4个，少于实际值。结论：经RT－PCR扩增，扩增产物的RV JR23株E2基因序列片段，为进一步研究E2基因和蛋白结构与功能奠定基础，软件分析的结果与实际情况有差异，可能是成熟的E2蛋白与E1蛋白形成异二聚体，而部分改变了自身构象。     

应用逆转录——聚合酶链反应快速诊断临床标本登革病毒血清型

用改良的碘化钠法提取登革热患者血清中登革病毒核糖核酸（DEN－RNA）作为模板，通过逆转录反应（RT）合成cDNA，在DEN型特异引物，TaqDNA多聚酶作用下，对DEN的E基因特异片段进行体外扩增。应用琼脂糖凝胶电泳，EB染色检测扩增结果；以地高辛配基标记的型特异cDNA探针与扩增产物作Southern转印和斑点杂交鉴定扩增产物的特异性，可在2天内直接检出登革热患者血清中DEN－RNA，并确定其血清型。本文用RT－PCR检测16份登革热患者血清，15份检出DEN1，4份同时检出DEN1和DEN2，结果提示1991年广州市流行的登革热可能是由DEN1和DEN2引起的。     

VP4基因鉴定非EV71非CoxA16手足口病病原体漏检的研究

目的探讨肠道病毒VP4基因通用引物PCR诊断非肠道病毒71型( EV71)非柯萨奇病毒A组16型( CoxA16)手足口病( HFMD)病毒方案的准确性。方法通过肠道病毒VP4基因通用引物PCR鉴定阜阳地区非EV71非CoxA16 HFMD病毒时,显示两例病毒分离株为Sabin-1(命名为Fy-01和Fy-02株)。分别采用引物EVP4/Q8和VP1特异性引物对Fy-01和Fy-02分离株进行鉴定。结果采用VP4基因PCR扩增产物测序证实,两例病毒分离株为Sabin-1,而采用EVP4/Q8引物PCR扩增Fy-01分离株却存在异常的扩增条带,PCR扩增产物测序结果为柯萨奇病毒A组10型( Cox-A10);将VP4基因PCR产物制备成克隆载体挑选多个单克隆测序结果显示,Fy-01分离株既存在Sabin-1 VP4基因,又存在CoxA10 VP4基因,证实为两种毒株混合感染。结论临床诊断为非EV71非CoxA16 HFMD的病例,如病原学诊断仅采用VP4基因PCR产物测序,特别是针对多种肠道病毒混合感染引起的HFMD,其结果并不完全可靠。     

广州2002年登革病毒流行株的分离鉴定及进化分析

目的从2002年广州采集的可疑登革病人血清中分离登革病毒,明确流行株的血清型及基因型,并鉴定该分离株的毒力。方法采集疑似登革热患者血清20份,应用C6／36细胞体外培养的方法进行病毒分离,并合成登革病毒通用引物,进行逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)后,将PCR扩增产物克隆到T载体进行序列测定和比对。确定血清型后,进一步扩增在病毒进化上有代表意义的病毒血清型特异性E／NS1连接区基因片段,测序后用邻位相连(N—J)法构建登革病毒进化树,分析此次登革病毒流行株的来源。通过乳鼠脑内接种及空斑实验,测定分离株的毒力。结果上述20份血清标本中,5份标本出现明显的细胞病变,主要表现为细胞融合,形成大小不一的空泡和网状结构。RT-PCR扩增、序列测定证实为登革病毒Ⅰ型。E／NS1连接区基因序列片段分析表明,2002年广州分离株(DEN-1／GZ2002)的核苷酸序列与基因型Ⅳ型的DEN—1／T14株(澳大利亚,1981)同源性最高,达98％。N—J法构建进化树显示：11株DEN-1病毒分成3个基因群,分别与Rico-Hesse1990分型中的Ⅰ,Ⅳ和Ⅴ型以及Ana P．Goncalvez 2002年分型中的亚洲型,南太平洋型和美N／tbN型相符,本室分离的DEN-1／GZ2002株属于Ⅳ型或者称南太平洋型。DEN-1／GZ2002株脑内接种乳鼠11d左右导致乳鼠弓背,后肢麻痹、瘫痪,直至死亡。感染Vero细胞8d后可见小而不透明的空斑,病毒滴度可达10^6pfu／ml,TCID50为4．37log pfu／0．2ml。结论2002年广州登革热流行为登革病毒Ⅰ型感染所致,病毒基因型为Ⅳ型,本实验虽然未明确毒力相关基因,动物实验及细胞感染实验证实该分离株的毒力较弱。     

云南省人类埃可病毒19型的分子流行病学分析

目的分析云南省1997-2013年急性迟缓型麻痹(AFP)病例和健康儿童中分离到的人类埃可病毒19型(echovirus 19,E19)VP1区基因特征及其分子流行病学特点。方法对分离到的非脊灰肠道病毒(non-polio enterovirus,NPEV)VP1区基因进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),将PCR产物送生物工程(上海)有限公司用双脱氧链终止法进行双向测序,采用Sequencher4.0软件对序列进行编辑,按Obester的方法对病毒进行定型,对E19病毒与基因库(GenBank)和文献中检索到的国内外不同时期的E19VP1区进行比较。用Neighbor-joining method构建病毒基因进化树,用1 000个Psudoreplicate datasets进行Bootstrap统计学分析。结果云南省1997-2013年从急性迟缓型麻痹(AFP)病例和健康儿童共3 750例中分离到26株E19病毒,与GenBank和文献中检索到的28株进行基因进化分析,54株病毒可分为6个基因型。云南省不同来源(AFP或健康人群)、不同时间分离到的E19主要分布在2、4、5型的基因进化分支,E19具有基因、地理和时间分布多样性特点。结论利用基因测序的方法持续对云南省AFP病例和健康儿童进行肠道病毒监测,增加和更新病毒基因序列,对今后开展肠道病毒的分子流行病学研究,确认病毒传播来源具有重要意义。     

深圳市2015年首例输入性登革热病毒溯源分析

目的 对2015年深圳市报告的首例输入性登革热病例进行溯源分析。方法 收集该病例流行病学资料及血清样本,并通过免疫层析法和实时荧光RT-PCR对该病例血清中的特异性IgM抗体、IgG抗体、NS1抗原及病毒核酸进行检测。用C6/36细胞对血清进行病毒分离。对分离株的E基因进行序列测定,与不同型别的标准株及不同地区的分离株进行同源性分析并构建系统发生树。同时对糖基化位点、毒力位点上的序列进行比较。结果 从该病例血清中检测出IgM抗体、NS1抗原和2型登革病毒RNA,并成功从血清样本中分离出登革病毒DEN2-SZ1503。 SZ1503与标准2型登革病毒NGC株E基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分别为93.8％和97.8％。系统发生树表明SZ1503与SG（EHI）D2 / 06572Y13株（Malaysia 2013）,具有最高相似性,且位于系统发育树的同一分支中。该分离株同1051株（Indonesia 76）、10株（Somalia 84）和271-206株（Sri Lanka 90）一起属于基因型Ⅳ。SZ1503株E基因的糖基化位点与其他登革热2型毒株相同,毒力位点也与之前报道的毒株一致。结论 病毒学、血清学和流行病学结果表明,该输入登革热病例是由2型登革热病毒引起的,SZ1503病毒株的遗传特征与马来西亚流行的登革热病毒一致。     

丙型肝炎病毒结构区基因变异的研究

目的：探讨丙型肝炎病毒（HCV）结构区主变异在HCV感染慢性化中的作用。方法：采用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增HCV的C、E1及E2／NS1区核苷酸片断（1kb）,扩增产物进行克隆,以单链构象多态性（SSCP）／异质性双体分析（HDA）方法对每份血清中30个克隆的C／E1和E2／NS1区准种（Quasispecies）进行优化筛选,分析HCV急性感染者和持续性感染者血清种复杂性。结果：HCV的C／E1区和E2／NS1区增片段形成的SSCP条带间差异明显,但E2区形成的异质性双体与同源双体之间差距准种复杂性的增加与病毒持续性感染有关。     

Ⅰ型登革病毒NS1蛋白特异性血清型单克隆抗体的制备及鉴定

目的研制Ⅰ型登革病毒(DEN1)非结构蛋白1(NS1)蛋白特异性单克隆抗体,鉴定其特异性。方法以具有良好免疫原性的DEN1重组NS1蛋白、DEN1全病毒及两者混合免疫共3种免疫方案,分别免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,杂交瘤细胞经间接ELISA法双筛I、FA和Western Blot进行mAbs的类型及亚类、特异性等鉴定。结果采用3种免疫方案免疫Balb/c小鼠,获得9株抗NS1蛋白的mAb,其亚类测定一株为IgG2a,另外8株为IgG1。这些mAbs与DEN1重组NS1蛋白和DEN1全病毒均结合,而且特异性好,仅1株杂交瘤分泌的单抗和其余3型DEN有交叉反应。结论成功获得了特异性针对DEN病毒NS1蛋白的特异性血清型mAb,将为进一步研究NS1蛋白的结构和功能及临床诊断试剂研发奠定基础。     

登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列pcDNA3.1载体的构建

目的：克隆登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,构建NS1基因部分序列的真核表达载体。方法：用PCR技术扩增登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列,并定向克隆入pcDNA3.1（＋）的kpnⅠ、xhoⅠ位点,构建真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1,转化EcoliDH5a。阳性重组质粒用PCR、酶切及序列测定等方法鉴定。电穿孔法将真核重组载体转染COS-7细胞,RT-PCR鉴定其表达情况。结果：阳性质粒经kpnⅠ及xhoⅠ双酶切及PCR获得了1个核苷酸长度为413 bp的基因,序列测定证实与NGC株NS1基因部分基因序列有99%同源,重组真核质粒转染COS-7细胞经RT-PCR鉴定证实有表达。结论：成功构建了含有登革2型病毒NGC株NS1基因部分序列基因的真核重组载体pcDNA3.1（＋）-NS1。     

猪瘟病毒内蒙流行株E2融合基因的构建

目的：获取猪瘟病毒内蒙流行株的E2基因并构建融合基因。方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从感染猪瘟病毒内蒙流行株猪脾脏中获得并扩增E2基因特异性片段,将扩增的E2基因测序后与Chaperone10相连接构成融合基因并连接到表达载体上。结果：所获得的猪瘟病毒内蒙流行株E2基因和其他地区猪瘟病毒流行株(HCLV株)E2基因有4个碱基的差异;融合基因Chaperone10-E2构建成功。结论：不同地区猪瘟病毒E2基因差异不大。     

登革Ⅱ型病毒Tr1751株E蛋白基因的克隆与表达载体的构建

目的从登革Ⅱ病毒Tr1751株中克隆表达E蛋白的基因,构建了真核表达质粒,为其后继的关于结构和功能的研究提供了条件。方法合成DEN2(Tr1751株)的E蛋白基因引物,通过RT-PCR的方法扩增含有信号肽E蛋白的基因片段,并与真核载体p IRES-hr GFP-1α连接,得到重组的质粒p IRES-hr GFP-1α-E,再用PCR、双酶切和测序的方法进行鉴定。结果 RT-PCR得到的为1 527bp的E蛋白基因片段,酶切鉴定和测序显示重组的质粒含有DEN2病毒中的E蛋白的基因。用重组质粒测序后与Gen Bank中的已知Tr1751株进行相似性比对,核苷酸序列和推导的氨基酸序列同源性均为99%。结论成功的构建出含有全长DEN2的E蛋白基因的真核质粒,为登革病毒核酸疫苗的研究奠定了基础。     

登革病毒Ⅱ(NGC株)pET-42a-NS_(4b)-NS_5载体构建

目的:构建NS4b-NS5基因的原核表达载体。方法:用RT-PCR技术扩增DEN2(NGC株)全长的NS4b-NS5基因序列,并定向克隆入pET42a,构建原核表达载体pET42a-NS4b-NS5,转化BL21菌。阳性质粒用PCR、酶切等方法鉴定。结果:阳性质粒经PCR及双酶切获得了一个长为1.05Kb的基因片段。结论:成功构建了含有DEN2全长NS4b-NS5基因的原核表达载体pET42a-NS4b-NS5。