Rho激酶抑制剂Y-27632对人气道平滑肌细胞增殖和细胞周期的影响

目的观察Rho激酶抑制剂Y-27632对人气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖的影响，为哮喘防治提供新思路。方法组织块贴壁法培养人ASMCs，对数传代后随机分为4组，A组加入含10％FBS的DMEM培养基，B、C、D组分别加入浓度为0．4、2．0、10．0μmol／L的Y-27632＋含10％FBS的DMEM培养基，非放射性细胞增殖（MTS）／吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）法检测各组细胞增殖情况（490nm处A值），流式细胞仪分析细胞周期。结果C、D组A值均显著低于A组（P〈0．05、0．01）；C、D组G0／G1期细胞比例显著高于A组，S、G2／M期细胞比例显著低于A组（P〈0．05、0．01）。结论Rho激酶抑制剂Y-27632可抑制人ASMCs增殖，阻滞细胞周期于G0／G1期；本研究为哮喘防治提供了新的选择。     

β-淀粉样肽(25-35)对PC12细胞Cyclin D1、CDK4、pRb、E2F1基因表达的影响

目的 观察β-淀粉样肽(25-35)[β-amyloid peptide (25-35),Aβ25-35]对体外血清饥饿培养PC12细胞的Cyclin D1、CDK4、pRb、E2F1基因表达的影响.方法 用终浓度为25 μmol/L Aβ25-35处理PC12细胞,流式细胞仪检测分析细胞周期的改变,通过RT-PCR检测Cyclin D1、CDK4、E2F1基因mRNA表达变化,Western印迹检测Cyclin D1、CDK4、pRb蛋白表达的变化.结果 流式细胞仪分析表明血清饥饿培养24 h可使约90%PC12细胞停滞于G0/G1期,25 μmol/L Aβ25-35诱导组8、16、24 h与对照组比较,S期百分率明显增加(P＜0.01),16 h后细胞凋亡率明显增加(P＜0.01),可见明显的亚二倍体峰(Ap峰);Aβ25-35浓度诱导血清饥饿培养的PC12细胞0～20 h,Cyclin D1、CDK4、pRb 、E2F1 mRNA和蛋白表达增高.结论 Aβ25-35诱导同步化于G0/G1的PC12细胞重新进入细胞周期,并阻滞于S期,同时出现凋亡,可能与增加Cyclin D1、CDK4、pRb 、E2F1 mRNA和蛋白的表达有关.     

甲基硝基亚硝基胍对日本血吸虫成虫培养细胞骨架作用的研究

目的 通过观察N－甲基－N－硝基－N－亚硝基胍（MNNG）诱导日本血吸虫培养细胞后骨架的改变,研究MNNG对培养细胞转化、增殖的作用。方法 将日本血吸虫成虫培养细胞接种于小盖玻片上,培养1周时用浓度为3mg/L的MNNG处理48h,然后用RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗菌素的培养基培养2周,再换用RPMI－1640含5％小牛血清的培养基继续培养,用考马斯亮兰染色法和鬼笔环肽荧光染色法显示培养细胞骨架。结果 MNNG诱导后,在培养第4、5周时部分培养细胞骨架排列紊乱,微丝集聚于细胞边缘。结论 MNNG有一定诱导日本血吸虫成虫培养细胞转化、促进其分裂的作用。     

甲基硝基亚硝基胍对日本血吸虫成虫培养细胞磷酸酶影响的研究

目的 研究甲基硝基亚硝基胍（MNNG）对日本血吸虫成虫培养细胞碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性的影响。方法 将虫龄26d的日本血吸虫成虫细胞接种于小盖玻片上，在RPMI－1640含20％小牛血清附加常量抗生素的常规培养基中培养第7天时，随机分为实验组和对照组，实验组用含浓度为3μg/mlMNNG的常规培养基处理48h，对照组用不含MNNG的常规培养基处理同样时间，随后换用常规培养基培养3周，当再换用含5％小牛血清的培养基培养1周时，分别用Gomori钙钴法和Gomori硫化铅法对两组培养细胞进行AKP和ACP细胞化学染色，用实验组培养细胞的AKP、ACP活性明显高于对照组培养细胞的活性（P＜0．01）。结论 MNNG能增强日本血吸虫成虫培养细胞AKP、APC的活力，对培养细胞有促生长或／或诱导其转化的作用。     

不同血清浓度及介质对体外培养小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态的影响

目的：通过探讨不同血清浓度及介质对体外培养小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线和细胞形态的影响，了解它们对成纤维细胞体外生存和生长的情况。方法：采用体外细胞培养技术进行小鼠成纤维细胞L929细胞，并采用磺基罗丹明B（sulforhodamineB，SRB）酶标仪法（A490nm波长下）测量各孔的吸光值（A值）并转换为小鼠成纤维细胞L929细胞系生长曲线；同时，分别采用HE（苏木精-伊红）染色法、、吖啶橙荧光染色和Hoechst33342荧光染色法进行小鼠成纤维细胞L929细胞系形态学观察。结果：小鼠成纤维细胞L929细胞系不同浓度的血清分别在3种不同的介质（RPMI1640培养基、0．9％生理盐水和5％葡萄糖生理盐水）中表现出不同的生长和生存情况及细胞形态学改变。其中，在不同血清浓度（0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％）的同一介质中，血清浓度为0％和100％浓度组的小鼠成纤维细胞L929细胞生长明显抑制及吸光度（A）值呈逐步减少的趋势，而除此之外的其它血清浓度组对小鼠成纤维细胞L929细胞的影响，基本表现为随着血清浓度的升高，吸光度（A）值呈逐步增加及促进细胞生长的趋势。而某些相同血清浓度在不同介质中对小鼠成纤维细胞L929细胞系生长和生存及形态学的有利影响，则基本表现为RP—M11640培养基作为介质的细胞培养效果优于0．9％生理盐水，而0．9％生理盐水作为介质的细胞培养效果又优于5％葡萄糖生理盐水。结论：不同血清浓度及介质对体外培养小鼠成纤维细胞L929细胞系生长和生存及细胞学形态均有明显影响。提示在进行体外细胞培养时应充分考虑细胞培养介质及所添加血清的浓度。     

番茄红素对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响及机制

采用MTT法和3H-TdR 掺入法观察番茄红素对体外培养雌激素受体阴性的人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响;流式细胞仪观察同步化细胞经番茄红素作用后细胞周期及凋亡的变化.结果 番茄红素作用后MDA-MB-231细胞增殖和DNA合成被抑制,具有剂量效应关系,随时间延长,抑制作用增强,最大抑制率达61.9%.番茄红素作用24 h后,细胞周期各相发生变化,G0/G1期细胞增多,S期和G2/M期细胞减少,并诱导其凋亡.证实番茄红素可抑制MDA-MB-231细胞增殖;其机制除通过阻滞细胞周期进程外,还与诱导凋亡有关.     

血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞衰老的形态学研究

目的探讨血管紧张素Ⅱ诱导人脐静脉内皮细胞衰老与细胞凋亡的关系。方法制备血管紧张素ⅡRPMI1640培养基培养人脐静脉内皮细胞,采用四甲基偶氮唑蓝比色法测定内皮细胞存活率,β-半乳糖苷酶染色、细胞周期分析鉴定细胞衰老;通过Hoechst33258荧光染色观察细胞形态学的变化,透射电子显微镜观察衰老细胞的超微结构。结果血管紧张素Ⅱ诱导组存活的细胞数为对照组的81.9%±0.04%(P<0.01),约80%的细胞呈现β-半乳糖苷酶阳性染色,流式细胞仪检测细胞周期停滞于G0-G1,荧光显微镜可见明显的细胞凋亡(P<0.05),透射电子显微镜可见血管紧张素Ⅱ诱导组细胞核染色质浓缩和凝聚。结论血管紧张素Ⅱ可诱导体外培养的内皮细胞衰老,衰老的内皮细胞发生凋亡,提示细胞凋亡参与了血管紧张素Ⅱ诱导内皮细胞衰老的过程。     

钙周期素结合蛋白的细胞周期依赖性转位现象

目的研究钙周期素结合蛋白（CacyBP／SIP）在胃癌细胞SGC7901中亚细胞定位与细胞周期的关系。方法利用双胸腺嘧啶脱氧核苷（胸苷）阻滞法将胃癌细胞SGC790l进行细胞周期同步化,流式细胞术检测细胞周期同步化效果。免疫荧光染色法观察CacyBP／SIP在不同时期的亚细胞定位。蛋白质印迹法检测CacyBP／SIP总蛋白及核蛋白在不同时期的表达水平。结果采用双胸苷阻滞法使SGC7901细胞阻滞于G,／s期,撤药后培养4h,细胞进入S期。大多数细胞在8～12h时进入G2／M期,16h又重新进入G1期。免疫荧光染色发现,在G1和S期时,CacyBP／SIP主要分布在细胞浆中,而在以G2期为主的细胞中,CacyBP／SIP聚集在核周或进入胞核,说明CacyBP／SIP存在细胞周期依赖性的核转位。在细胞的各时相中CacyBP／SIP总蛋白无明显变化,但在G2期时CacyBP／SIP的核蛋白表达水平增高。结论CacyBP／SIP存在细胞周期依赖的转位现象,可能参与了G2／M期的调控作用。     

普罗布考抑制大鼠血管平滑肌细胞周期素D1蛋白表达和G1→S转换

目的研究普罗布考是否通过阻滞细胞周期抑制平滑肌细胞增殖。方法首先用普罗布考和氧化型低密度脂蛋白与平滑肌细胞共同孵育。然后用MTT法和细胞计教法测定细胞增殖，用流式细胞术观察细胞周期，最后用蛋白印迹测蛋白表达。结果MTT法和细胞计数法显示25～100mg／L氧化型低密度脂蛋白都能刺激平滑肌细胞增殖，效应呈浓度依赖性，普罗布考能显著抑制氧化型低密度脂蛋白所诱导的细胞增殖，效应呈浓度和时间依赖性。流式细胞术分析表明普罗布考增加了G0/G1细胞比例达28.6％（P〈0．01，n=3），减少S期细胞比例达83．5％（P〈0.01，n=3）。蛋白印迹结果显示氧化型低密度脂蛋白诱导细胞周期素D1蛋白表达，高峰在6～12h，普罗布考显著减少周期素D1蛋白表达，在6h和12h分别减少达26％和23％（P均〈0.01，n=3）。结论普罗布考显著抑制氧化型低密度脂蛋白所诱导的细胞增殖，其抗增殖活性与普罗布考下调周期素D1蛋白表达，从而阻滞细胞由C0/G1期向S期转换有关。     

免疫血清对旋毛虫感染性幼虫侵入肠上皮细胞及其发育的影响

目的观察旋毛虫感染性幼虫排泄分泌(ES)抗原与旋毛虫感染性幼虫表面抗原免疫鼠血清对幼虫侵入HCT-8肠上皮细胞及其发育的影响。方法将旋毛虫感染性幼虫接种至半固体培养基(RPMI1640培养基+1.75%琼脂糖)+HCT-8细胞中,37℃5%CO2培养12、24、36、72和96h后镜下观察幼虫发育情况;将幼虫接种至含免疫血清的半固体培养基+HCT-8细胞中,培养15min后镜下观察幼虫形态及其对肠上皮细胞的侵入情况,36h后应用间接荧光抗体试验(IFAT)观察幼虫蜕皮,并计数Ⅰ期和Ⅱ～Ⅳ期幼虫。结果幼虫在半固体培养基培养12h可侵入HCT-8细胞单层,36～72h幼虫可蜕皮1～2次,培养96h可见早期成虫。在含ES抗原免疫血清与感染鼠血清条件下培养15min,幼虫头端可见免疫复合物形成的帽样结构,但在含表面抗原免疫血清、正常鼠血清或不含免疫血清条件下培养的幼虫头端则无帽样结构,头端带有帽样结构的幼虫不能侵入HCT-8细胞单层。在含ES抗原与表面抗原免疫血清条件下发育至Ⅱ～Ⅳ期幼虫的百分比(2.25%、2.2%)均明显低于含正常鼠血清条件下培养的幼虫(24.7%)(P0.05)。结论旋毛虫ES抗原免疫血清可阻止幼虫对肠上皮细胞的侵入,ES抗原及表面抗原免疫血清均可阻止部分幼虫的发育(蜕皮)。     

In vitro development of Haplorchis taichui (Trematoda: Heterophyidae)

Newly excysted metacercariae of Haplorchis taichui were cultured in a candle jar set at 37 degrees C. Both monophasic culture media [0.85% NaCl, RPMI 1640, RPMI 1640+10% fetal calf serum (FCS)] and diphasic culture media [RPMI 1640 + egg yolk agar, RPMI 1640 + 5%, 10% or 15% blood in blood agar (BA), RMPI 1640 + 5%, 10% and 15% FCS with 5% blood in BA] were used in vitro. Parasites survived for only 1 day in 0.85% NaCl without any development. In RPMI 1640 with egg yolk agar and RMPI 1640 + 5%, 10% FCS, the parasite survived for 3-5 days. In contrast, worms survived for 12-14 days in RPMI 1640 with blood agar without any change in result in a different concentration of blood in BA. The ovary and testes were observed after 3 days incubation in this media. Nevertheless, only 1 parasite in RPMI 1640 with 15% blood in BA had vitellaria and eggs at day 6. RPMI 1640 with blood agar can be used as short-term maintenance for the in vitro culture of H. taichui. However, further studies are needed.     

Hepatitis C virus core protein induces apoptosis and impairs cell-cycle regulation in stably transformed Chinese hamster ovary cells

Hepatitis C virus (HCV) infection is associated with the development of hepatocellular carcinoma. Several lines of evidence suggest that the core protein of HCV may play a role in the development of this cancer. The authors examined regulation of the cell cycle in stable cell lines derived from Chinese hamster ovary (CHO-K1) cells that constitutively expressed one or more of the structural proteins of HCV. In media containing low concentrations of serum (serum starvation), cell lines expressing the core protein showed a significantly lower population of viable cells than noncore-expressing cells. The low viability of the core-expressing cells was a result of the increased population of cells undergoing apoptosis. Interestingly, the cell cycle analysis revealed that the arresting function at G(0) was impaired, and the cell cycle was accelerated in core-expressing cell lines even under serum starvation. Thus, the HCV core protein sensitizes the apoptosis to serum starvation, although it promotes the cell cycle in CHO-K1 cells. To explain these findings, the authors examined the expression of revival apoptosis and cell-cycle-related genes. Expression of the c-myc genes was significantly induced in core-expressing cells in response to serum starvation. Other apoptosis-inducing genes downstream of c-myc, p53, p21WAF1/CIP1 and Bax were significantly highly induced, although there was no induction of Bcl-2, which prevents apoptosis in core-expressing cells. Thus, the HCV core protein induced apoptosis and impaired the regulation of the cell cycle by activating c-myc expression, whereas the p53 and Bax pathways play a role in the induction of apoptosis.     

Regulation of human lung epithelial cell numbers by diesel exhaust particles.

Particulate air pollution is associated with respiratory morbidity and has cytotoxic and pro-inflammatory effects. The effects of diesel exhaust particles (DEP) on proliferation and apoptosis of A549 lung epithelial cells were examined. When deprived of serum (serum starvation), epithelial cell numbers fell, but DEP (5-200 microg.mL-1) prevented this. Using flow cytometric analysis of propidium iodide (PI) staining, DEP (10 microg.mL-1) increased cells in the S phase of cell cycle from 12.85 to 18.75% after 48 h, reversing serum starvation-induced G0/1 arrest. DEP also reduced the increase in apoptotic cells, as defined by double expression of annexin V/PI, observed after serum starvation (from 28.35 to 15.46%). The antioxidants, N-acetylcysteine (NAC; 33 mM) and AEOL10113 (10-100 microM), the N-terminal c-jun kinase inhibitor, SP600125 (33 microM), and nuclear factor-kappaB inhibitor, SN50 (33 microM), inhibited DEP-induced cell number increase. NAC inhibited DEP-induced reduction of G0/1 and increase in cells in the S and G2/M phases. Expression of p21CIP1/WAF1 mRNA and protein seen with serum starvation was reduced by DEP. In conclusion, diesel exhaust particles prevented serum starvation-led decreases in A549 epithelial cells by inducing cell cycle progression and preventing apoptosis, processes involving oxidative stress, inhibition of p21CIP1/WAF1 expression and stimulation of N-terminal c-jun kinase and nuclear factor-kappaB. Therefore, low-dose diesel exhaust particle exposure may lead to lung epithelial cell hyperplasia.     

HepG2.2.15细胞诱导MT2淋巴细胞凋亡及其意义

观测表达Ｆａｓ抗原（Ｆａｓ）的Ｔ淋巴细胞一感染乙型肝炎病毒的ＭＴｓ细胞对表达Ｆａｓ配体（ＦａｓＬ）的实质细胞一ＨｅｐＧ２２．１５细胞的敏感性,了解乙型肝炎病毒感染对淋巴细胞和肝实质细胞交互作用的影响。方法体外培养ＭＴ２细胞,用乙型肝炎病毒诱导表达ＦａｓＬ。将表达ＦａｓＬ的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞与其共孵育后,以Ｔｕｎｅｌ法观测ＭＴ２细胞凋亡情况。结果ＭＴ２细胞感染乙型肝炎病毒后可测到Ｆａｓ表达信号。与表达ＦａｓＬ的ＨｅＰＧ２．２．１５细胞共孵育４８～７２小时以后,出现凋亡信号。结论乙型肝炎病毒诱导表达Ｆａｓ的ＭＴｓ细胞与表达ＦａｓＬ的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞交互作用后发生凋亡,表明通常在乙型肝炎发病中作为效应细胞的淋巴细胞,亦可成为凋亡靶细胞。     

E1A基因对人肺腺癌细胞增殖和细胞周期的影响

目的 探讨E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的抑制作用与细胞周期的关系及作用机制。方法 利用细胞增殖曲线和裸小鼠体内致瘤性实验研究E1A基因对人肺腺癌细胞增殖的影响,采用流式细胞术分析人肺腺癌细胞周期,以蛋白印迹方法分析P16、P21、P53和cyclin B1水平变化。结果 转染E1A基因后,人肺腺癌细胞（Anip973-E1A）生长缓慢,体内致瘤性降低。Anip973-E1A细胞周期出现明显的S期抑制和G2/M阻滞,周期调控蛋白P16、P21、P53水平无明显变化,但cyclin B1表达明显下降。结论 E1A基因能显著抑制人肺腺癌细胞的体内外增殖,降低周期蛋白cyclin B1的表达,使细胞周期阻滞于G2/M,这可能与A1A基因抑制作用有关。     

软脂酸对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞的作用及机制

目的:探讨不同浓度的软脂酸对酒精体外诱导的脂肪变性肝细胞的作用及机制.方法:体外培养人正常肝细胞株L-02,设立空白对照组、酒精诱导组及软脂酸干预组.软脂酸干预组设6个浓度梯度(2.5、5、10、20、30、40μmol/L),空白对照组用正常培基培养96h,酒精诱导组和软脂酸干预组在细胞培养24h后加入终浓度为60mL/L的无水乙醇,继续培养24h后,软脂酸干预组加入各浓度软脂酸.采用MTT法测细胞增殖,油红O染色观察细胞内脂滴形成情况,试剂盒检测细胞内三酰甘油的含量,Westernblot法测定细胞核内成熟的固醇调节元件结合蛋白-1c(nSREBP-1c)的含量.结果:60mL/L的无水乙醇培养L-02细胞72h成功建立了脂肪变性模型,软脂酸干预后,软脂酸浓度≤10μmol/L时,软脂酸明显地促进酒精诱导的脂肪变性肝细胞的增殖(P<0.05),并且明显地减轻细胞内脂滴的形成,减少细胞内三酰甘油的含量和细胞核内nSREBP-1c的含量,并呈现出剂量效应关系;而软脂酸浓度≥20μmol/L时,明显地抑制酒精诱导的脂肪变性肝细胞的增殖(P<0.05),并且加重细胞内脂滴的形成,增加细胞内三酰甘油和细胞核内nSR...     

舒肝颗粒对大鼠肝星状细胞增殖及胶原分泌的影响

目的:观察舒肝颗粒对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖及胶原分泌的影响.方法:体外培养HSC-T6.设空白对照组、正常对照组和舒肝颗粒干预组,其中,舒肝颗粒干预组设7个浓度梯度.前两者加入无血清的RPMI 1640胞培养液,后者加入含舒肝颗粒的无血清RPMI 1640细胞培养液,药物终浓度分别为0.56、0.28、0.14、0.07、0.035、0.018和0.009 g/L.采用MTT法检测细胞增殖,ELISA法检测Ⅰ、Ⅲ及Ⅳ型胶原含量.结果:经48 h,舒肝颗粒干预组HSC抑制率分别为48.59%、38.24%、28.12%、21.15%、8.47%、7.26%和0.33%,明显高于正常对照组,且呈剂量效应关系.舒肝颗粒干预组细胞上清液中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原含量较正常对照组明显降低(5.437 μg/L±0.043 μg/L、3.26μg/L±0.217μg/L、2.18μg/L±0.245μg/L vs 13.817μg/L±0.787μg/L、8.629μg/L±0.178μg/L、5.29μg/L±0.315μg/L,均P<0.01).结论:舒肝颗粒可通过抑制HSC增殖和胶原蛋白的分泌,减少胶原纤维在肝脏内的沉积,这可能是其抗肝纤维化的作用机制之一.     

磁性纳米控释紫杉醇对食管癌Eca109细胞株生长的影响

目的:观察不同浓度磁性纳米控释紫杉醇对食管癌细胞Eca109的影响及与不同化疗药物的对比.方法:取对数生长期的食管癌Eca109细胞作细胞增殖抑制实验,实验组分别给予不同浓度的磁性纳米控释紫杉醇和5-氟尿嘧啶、泰素,同时设立二甲基亚砜(DMSO)和RPMI1640液对照,测定24,48,72h三个时间段的吸光度值,计算抑制率.经不同浓度的磁性纳米控释紫杉醇作用72h后,用电镜观察细胞超微结构,同时用流式细胞仪测定细胞周期和细胞凋亡.结果:MTT实验显示磁性纳米控释紫杉醇可抑制食管癌细胞增殖,与5-氟尿嘧啶,泰素相比,具有缓释性(P<0.01);电镜可发现药物作用组细胞核固缩、解聚以及凋亡小体;流式细胞仪检测显示G1峰前有明显的凋亡峰;细胞周期分析提示磁性纳米控释紫杉醇可将Eca109细胞阻滞于G2-M期,且与浓度相关.结论:磁性纳米控释紫杉醇对人食管癌细胞Eca109的生长有明显的抑制作用,使细胞分裂阻滞于G2-M期,并诱导细胞凋亡,且具有缓释效果.     

Molecular epidemiology of malaria in Cameroon. XXIII. Experimental studies on serum substitutes and alternative culture media for in vitro drug sensitivity assays using clinical isolates of Plasmodium falciparum

Correlation studies on the in vitro drug response of field isolates of Plasmodium falciparum and molecular markers for drug resistance are becoming important as many malaria control programs abandon monotherapies and resort to combination therapies. The standardization and optimization of the in vitro drug sensitivity assay are one of the prerequisites for validating molecular markers in the field. The present study was designed to assess and compare the growth of freshly obtained isolates for at least the first erythrocytic cycle in various culture media and determine the in vitro response to chloroquine in alternative media. Parasite growth was consistently higher in Dulbecco's modified Eagle's medium (DME)-human serum, Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)-human serum, RPMI 1640 medium-goat serum, and a serum-free medium containing 1:1 (v/v) mixture of IMDM and F-12 supplemented with an ammonium sulfate fraction of adult bovine serum than in RPMI 1640 medium-human serum mixture. The level of chloroquine response determined in human serum-supplemented DME, IMDM, and RPMI 1640 media did not differ significantly (P > 0.05) from the control (RPMI 1640-human serum). This study suggests that alternative media may be used to optimize parasite growth during the critical initial phase of transition from in vivo to in vitro conditions. The capacity of these media to support long-term cultivation of P. falciparum requires further investigation.