靶向人端粒酶逆转录酶进行RNAi的逆转录病毒载体的构建

目的构建靶向性干扰人端粒酶逆转录酶表达的特异性小干扰RNA的真核表达载体。方法采用PCR法分别扩增增强型绿色荧光蛋白的DNA序列、U6启动子序列和靶向性干扰人端粒酶逆转录酶的特异性小干扰RNA对应的DNA序列,随后将与之相应的DNA序列片断依次克隆入真核表达载体pLXSN中,并通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体进行鉴定。以荧光显微镜和利用流式细胞仪分析重组病毒表达EGFP蛋白的情况。以MTT方法检测初步分析重组病毒对人Hela细胞的RNAi效果。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向人端粒酶逆转录酶的小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT。以磷酸钙共转染法制备的重组逆转录病毒滴定了病毒滴度后,重组病毒感染人Hela细胞24h时用流式细胞仪测得EGFP表达的阳性率为24.1%。重组逆转录病毒感染人Hela细胞48h时,MTT实验测得细胞死亡率为53.2%。结论成功构建了针对人端粒酶逆转录酶小干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN/EGFP-U6-siTERT,并制备了重组逆转录病毒,初步观察了效应,为进一步利用小干扰RNA技术研究肿瘤的基因治疗奠定了基础。     

载体介导的RNA干扰技术对甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶基因的抑制作用

目的应用载体介导的RNA干扰(RNA i)技术特异性地抑制甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。方法构建利用U6启动子转录功能性小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染人甲状腺癌FRO细胞,利用RT-PCR和W eston blot法检测hTERT基因的表达情况。结果构建的表达质粒转染FRO细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平明显降低,抑制率分别为76%和81%。结论siRNA的表达质粒能成功抑制甲状腺癌细胞hTERT基因的表达,为RNA i技术应用于甲状腺癌的基因治疗提供了实验基础。     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗的研究进展

端粒酶与肿瘤发生发展的关系是近年来肿瘤研究领域的热点之一．端粒的磨耗限制大多数体细胞的复制,肿瘤细胞主要通过转录上调端粒酶限制成分催化亚基端粒酶逆转录酶（hTERT）维持端粒长度．由于hTERT启动子区域已被克隆,其特点也已被鉴定,hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗成为研究的热点．我们综述了hTERT启动子介导的靶向性肿瘤基因治疗最新研究进展．     

人端粒酶逆转录酶基因RNAi表达载体的构建、鉴定

目的 构建端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的RNA干扰（RNAi）表达载体。方法 化学合成能编码针对hTERT基因的短发夹RNA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火处理后克隆到pSilencer1．0-U6 shRNA表达载体的U6RNA聚合酶Ⅲ（Pol Ⅲ）启动子的下游，构建重组RNAi质粒pSliencer-hTERT。结果 经酶切电泳及测序分析证实，目的序列成功插入到预计位点。结论 已成功构建pSliencer-hTERT载体，为进一步研究其对端粒酶活性的抑制作用打下基础。     

人端粒酶逆转录酶启动子介导的E1A和IL-24表达及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子介导的E1A和IL-24双基因靶向腺病毒载体,获得Ad-h-E1A-IL-24靶向重组病毒子,并探索其体外抑瘤作用。方法运用PCR扩增MCF-7乳腺癌细胞的DNA,XbaⅠ和HindⅢ酶切获得280 bp hTERT启动子,插入空载体构建成pTrack-hTERT;运用PCR及HindⅢ和XhoⅠ酶切获得E1A,与pTrack-hTERT构成pAdTrack-hTERT-E1A;运用PCR及NotⅠ和SalⅠ酶切获得IL-24,插入pTrack-PP-IRES;XbaⅠ和XhoⅠ酶切获得hTERT-E1A,与pTrack-PP-IL-24-IRES形成pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,同源重组、包装和扩增获得Ad-h-E1A-IL-24重组靶向病毒子。用25 MOI重组靶向腺病毒感染SMMC-7721肝癌细胞,MTT法测定Ad-h-E1A-IL-24的细胞生长抑制作用。结果成功构建pTrack-hTERT-E1A-PP-IL-24-IRES,并获得Ad-h-E1A-IL-24重组病毒子。与非靶向双基因比较,Ad-h-E1A-IL-24组可明显抑制肿瘤细胞生长（P〈0.05或0.01）。结论Ad-h-E1A-IL-24靶向腺病毒载体的体外抑瘤作用优于非靶向双基因载体。     

人端粒酶逆转录酶在肿瘤免疫治疗中的应用

寻找有效的抗原表位是近期肿瘤免疫治疗的热点,人端粒酶逆转录酶(hTERT)的免疫学特性使其成为肿瘤免疫治疗中一个吸引人的目标.从人和鼠系统获得的数据证实,细胞毒淋巴细胞(CTL)能识别hTERT特异的肽并杀死多种组织类型hTERT表达的肿瘤细胞.由于hTERT在人肿瘤组织中的广泛表达,在极少正常组织的低水平表达,临床试验已开始检验将hTERT作为肿瘤免疫治疗目标的可行程度.近期树突状细胞(DC)转运系统及其相关技术的发展和成熟提供了一个快速有效筛选抗原肽的方法.     

尖锐湿疣组织中survivin mRNA和人端粒酶逆转录酶mRNA的表达及意义

survivin是近年发现的一种凋亡抑制基因，具有抑制细胞凋亡的作用，人端粒酶逆转录酶（hTERT）是端粒酶（telomerase）活性的限制性组分。尖锐湿疣（CA）增生快，治疗后常易复发，部分病例有恶变可能，这与CA存在细胞凋亡和端粒酶活性异常可能有关。而survivin在CA中表达情况未见报道，为研究CA组织中survivin mRNA和hTERT mRNA表达情况，我们应用逆转录-PCR（RT—PCR）和原位杂交法分别检测CA组织中survivin和hTERT mRNA的表达，并探讨他们在CA发病中的可能机制。     

端粒酶启动子调控tk基因靶向性杀伤鼻咽癌细胞的实验研究

目的 探讨端粒酶催化亚单位启动子/胸腺嘧啶脱氧核苷激酶(hTERTp/tk)基因特异载体在体外靶向性杀伤鼻咽癌细胞的效应.方法 通过细胞转染将hTERTp/tk转染鼻咽癌细胞株中,采用RT-PCR及MTT法检测hTERTp/tk/pGL3体外特异性杀伤鼻咽癌细胞的效应及其tk基因、端粒酶表达.结果 转染hTERTp/tk/pGL3后可见tk基因表达,端粒酶及其hTERT表达较对照组下降.hTERTp/tk/pGL3能特异性杀伤鼻咽癌HNE1细胞,而对正常成纤维细胞无杀伤作用,hTERTp/tk/pGL3杀伤细胞的效应比阳性对照CMV/tk/pGL3的无选择性杀细胞作用略低.结论 hTERTp/tk基因特异表达系统具有靶向性杀伤鼻咽癌细胞的作用及抑制肿瘤细胞端粒酶活性.     

正、反义hTERT基因真核表达载体的构建与鉴定

目的构建正、反义hTERT基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的hTERT cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义hTERT基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的hTERT cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义hTERT基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。     

hTERT在肾癌中的表达及临床意义

目的 检测人端粒酶逆转录酶(hTERT)在肾癌中的表达及其临床意义.方法 采用RT-PCR及Western blot方法检测45例肾癌组织、45例配对的癌旁肾组织及786-0细胞系中hTERT mRNA及蛋白的表达情况,观察其表达与肿瘤大小、临床分期、病理组织分型、分级之间的关系.结果 hTERT mRNA及蛋白在肾癌组织中呈高表达(P=0.000),其表达与肾癌的肿瘤大小、临床分期、病理组织分型、分级之间无关(P＞0.05).结论 肾癌组织中hTERT表达较高,可尝试用于肾癌的诊断和预测,并为基因治疗提供了思路.     

RNA干扰人端粒酶逆转录酶基因对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性抑制的研究

目的:探讨RNA干扰技术使人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因沉默,对膀胱尿路上皮癌BIU-87细胞株端粒酶活性的抑制作用。方法:针对hTERT基因设计构建多种siRNA表达载体,并转染至膀胱肿瘤BIU-87细胞,通过实时荧光定量、单四唑(MTT)检测端粒酶活性,观察siRNA表达载体对hTERT基因表达的影响。结果:实时荧光定量和MTT检测证明,所构建的载体能导致不同程度的hTERT基因沉默,并成功地抑制BIU-87细胞的生长。结论:RNA干扰膀胱尿路上皮癌细胞(BIU-87)端粒酶hTERT基因,能影响端粒酶基因的表达,为进一步研究端粒酶活性在膀胱尿路上皮癌中的作用奠定了基础。     

人端粒酶反转录酶启动子的克隆与肿瘤靶向治疗的研究

目的 克隆hTERT启动子,并观察hTERT启动子调控下tk/GCV系统对人肺癌细胞系A549的特异性杀伤效果。方法 设计特异性引物,以HepG2基因组DNA为模板,用PCR方法扩增hTERT启动子;分别构建hTERT启动子和hCMV启动子调控的LacZ、tk基因真核表达载体;将上述质粒用脂质体转染A549细胞和人胚肺成纤维细胞系MRC5后,通过RT-PCR和β-Gal染色观察hTERT启动子工作情况;用MTT法检测不同浓度的GCV对A549和MRC5细胞的细胞毒作用。结果 成功克隆hTERT上游-280bp~+40bp的核心启动子。RT-PCR和β-Gal染色显示hTERT启动子能有效地调控其下游tk基因、LacZ基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中特异性转录和表达;hTERT启动子调控的tk/GCV系统对端粒酶阳性的肿瘤细胞系A549有明显的特异性杀伤效应。结论 hTERT启动子可特异性地调控目的基因在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达而不影响正常的细胞,表明端粒酶启动子调控自杀基因的表达是一种很有希望的肿瘤靶向基因治疗策略。     

人端粒酶蛋白催化亚单位反义基因转染对胃癌细胞恶性表型的逆转作用

目的 探讨人端粒酶蛋白催化亚单位（hTRT）反义基因治疗对胃癌细胞恶性表型的逆转作用。方法 采用基因重组技术,构建hTRT正比、反义真核表达载体,采用脂质体法导入SGC－790细胞、反义真核表达载体,并导入SGC－790胃癌细胞株中,获得稳定表达正、反义基因的细胞系7901－S、7901－AS1和7901－AS2。7901－AS1和7901－AS2出现显著生长抑制现象,端粒酶活性明显下降,细胞凋亡增加,异型性减小,G0／G1期细胞增加,S和G2M期细胞减少,增殖指数减小,软琼脂中克隆形成,裸鼠体内成瘤消失。结论 hTRT反义基因治疗可以明显抑制SGC－7901细胞的增殖,部分逆转肿瘤细胞的恶性表型,其机制可能主要是通过诱导细胞分化而非诱导细胞凋亡途径实现的,提示hTRT基因可以作为肿瘤治疗的靶基因。     

hTERT及c-myc蛋白在宫颈癌中的表达

目的探讨宫颈癌及癌前病变中端粒酶逆转录酶（hTERT）和c-myc蛋白的表达及相互关系。方法以44例宫颈癌、18例宫颈上皮内瘤变（CIN）和6例正常宫颈组织为研究对象，采用免疫组化SP方法检测c-myc蛋白、hTERT蛋白，并对各指标阳性表达率和相关性进行比较分析。结果正常宫颈组织、宫颈上皮内瘤变（CIN）、宫颈癌组织中，c-myc蛋白的阳性率分别为0，38．9％，72．7％；hTERT蛋白为0，33．3％，77．3％。二者在CIN、宫颈癌中分别与正常组织相比差异有显著性（P〈0．05）。宫颈癌组织中的表达较CIN高，差别有显著性（P〈0．05）。宫颈癌中，c—myc蛋白和hTERT蛋白的表达在有周围组织浸润、有淋巴结转移和远处转移时显著增高，其阳性表达随期别的增加而增高（P〈0．05）。二者的表达呈正相关。结论hTERT基因的过度表达在宫颈癌的发生发展过程中具有重要作用；c-myc蛋白和hTERT的过表达是宫颈癌发生中的早期事件，其表达水平随着宫颈癌恶性程度的增加而增加; c-myc在转录水平上激活hTERT的表达，可能是宫颈癌发生发展的重要阶段。