转基因动物技术与转基因约

转基因动物技术始于上个世纪80代，20多年来，转基因动物在制作方法上由最初的显同注射法，逆转录病毒法和胚胎干细胞法，发展到体细胞核移植技术，腺病毒载体法，精子头与转移基因共注射法等。随着转基因技术的不断发展，利用转基因动物生产药用蛋白质即转基因动物制药的研究也取得了突破性进展，目前，转基因动物制药正走向产业化的道路，具有十分广阔的前景。     

转基因动物技术与转基因动物制药

转基因动物技术始于上个世纪 80年代 ,2 0多年来 ,转基因动物在制作方法上由最初的显微注射法、逆转录病毒法和胚胎干细胞法 ,发展到体细胞核移植技术、腺病毒载体法、精子头与转移基因共注射法等。随着转基因技术的不断发展 ,利用转基因动物生产药用蛋白质即转基因动物制药的研究也取得了突破性进展 ,目前 ,转基因动物制药正走向产业化的道路 ,具有十分广阔的前景     

建立转基因动物的方法及其进展

本文从显微注射法，逆转录病毒感染法，胚胎干细胞法，精子载体法和体细胞核移植法等5个方面回顾了建立转基因动物的方法，同时综述了其研究进展，并对其前景进行了展望。     

建立转基因动物的方法及其进展

本文从显微注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞法、精子载体法和体细胞核移植法等5个方面回顾了建立转基因动物的方法,同时综述了其研究进展,并对其前景进行了展望。     

逆转录病毒介导外源基因高效感染大鼠骨髓间充质干细胞

目的 通过逆转录病毒系统将小鼠同源盒基因Soxl转移至大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）。检测外源基因的表达，感染效率及感染时间。方法 常规分子生物学亚克隆技术构建重组逆转录病毒载体，转染至包装细胞株PT67，制备含目的基因的重组逆转录病毒液，感染rMSC，并用带EGFP表达盒的pLEGFP-N1载体的逆转录病毒系统作为平行对照，评估感染率；使用Westernblot以及免疫组织化学的方法检测携带目的基因的重组逆转录病毒在rMSC中的感染和表达情况。结果 本实验成功地制备了pLXSN—Soxl重组逆转录病毒载体并制备出高滴度病毒颗粒；将病毒上清感染rMSC，EGFP阳性细胞为21％，感染时间持续20d，而对照脂质体转染法EGFP阳性细胞仅为3％。免疫组化及Westernblot显示用重组逆转录病毒液感染的rMSC可表达外源基因产物Soxl蛋白。结论 采用逆转录病毒介导的方法可以将外源性基因高效转移至rMSC中，并有外源性基因的稳定表达。     

缺氧诱导因子-1α基因转染人间充质干细胞

目的将HIF-1α基因转染人间充质干细胞(hMSCs),并检测该基因在hMSCs中的表达.方法构建含人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的重组逆转录病毒载体,制备含目的基因的重组逆转录病毒,感染hMSCs.采用RT-PCR法检测HIF-1α基因的表达.结果转基因hMSCs的HIF-1α表达水平较正常hMSCs明显增高.结论HIF-1α基因成功转入hMSCs并被强制表达,为研究骨组织工程的血管化奠定了基础.     

基因打靶技术在转基因动物中的进展

80年代初发展起来的基因定位整合技术(gene targeting)以及同期建立的小鼠胚胎多潜能千细胞系(Es，emgbryonic stem cell)的体外培养方法，使转基因技术更加前进了一步，为人们在动物体内分析某一特定基因提供了有力的手段。转基因技术是将外源基因导入动物生殖细胞或ES细胞，也就是将动物原来没有的基因或不占主导地位的基因导入该动物的基因组中并使之表达，观察其表达后对动物产生的影响。而基因打靶技术则是应用外源DNA与染色体上一段与其具有高度同源性序列进行同源重组(homologous recombination)的原理使动物体内某种正常基因失活，     

转基因人肝癌细胞株(BEL7404/TNF)的建立及其生物活性的初步研究

目的 研究转基因肝癌细胞和其来源肝癌细胞株的生物学特性的差异。方法 构建含 人肿瘤坏死因子α基因（ＴＮＦα基因）的重组逆转录病毒体载体,将其导入人肝癌细胞株ＢＥＬ７４０４。通过ＭＴＴ比色法测定比较转基因肝癌细胞株及未转基因肝癌细胞株的生物活性。结果 成功建立转基因肝癌细胞株。ＭＴＴ比色法测定结果表明转基因的肝癌细胞株生长速度显著减慢。结论 ＴＮＦ基因转入肝癌细胞后,肝癌细胞株恶性程度降低。     

广泛表达人载脂蛋白E3转基因小鼠的建立

目的 建立人载脂蛋白E3(apolipoprotein E3,ApoE3)转基因小鼠,研究该基因在多种组织中表达水平的变化对动物的影响,探索该基因的功能.方法 RT-PCR法克隆人ApoE3基因,把该基因插入CMV启动子下游,构建转基因表达载体,通过显微注射法建立转ApoE3基因C57BIJ6J小鼠.并利用特异引物PCR法鉴定转基因小鼠的基因型,Westem blot检测基因表达水平.通过生化指标分析初步鉴定ApoE3基因的功能.结果建立了2个系的高表达人ApoE3转基因小鼠.结论 成功建立了CMV启动子启动的高表达人ApoE3基因转基因小鼠,为进一步探索该基因的功能奠定了基础.     

Retroviral vector containing human p16 gene and its inhibitory effect on Bcap -37 breast cancer cells

目的　研究p16基因对肿瘤细胞生长抑制及细胞周期阻滞作用。方法　将p16cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN构建成p16基因逆转录病毒重组体pLp16SN。利用基因转染方法 ,将pLp16SN及pLXSN导入逆转录病毒包装细胞系PA317细胞 ,获得逆转录病毒。用逆转录病毒感染Bcap 37乳腺癌细胞 ,经G4 18筛选获阳性克隆。利用Northern和Westernblotting方法检测p16基因的表达。检测转基因细胞的生长速度 ,细胞周期及裸鼠成瘤等细胞生物学行为的改变。结果　Northern及Westernblotting显示转染p16基因的Bcap 37细胞p16基因mRNA及蛋白质表达明显增高。此细胞较未转染基因的Bcap 37细胞和转染空载体的Bcap 37细胞生长速度慢 ,G1期细胞比率增高 ,裸鼠接种成瘤体积小。结论　p16基因高表达能够抑制乳腺癌细胞Bcap 37的生长 ,并阻滞细胞从G1期进入S期     

应用精原干细胞转染法建立HBV（adr型）转基因鼠

目前转基因动物的研究已在农业和医学等领域显示广阔的应用前景 ,但其研究进展缓慢 ,转基因技术仍是主要的制约因素之一。探讨新的简便而有效的转基因方法 ,提高转基因效率 ,是转基因动物研究中的重要课题之一。Brinster等 [1]( 1994 )率先进行通过精原干细胞转染建立转基因动物技术的研究。其原理是将外源基因转染到曲细精管内的精原干细胞 ,使其整合到干细胞染色体上 ,干细胞将可能长期保留有外源基因 ,因此该雄性动物所产生的精子 (精子由精原干细胞分化而成熟 )就有可能携带外源基因 ,由该精子受精而获得的子代动物就会携带外源基因。…     

逆转录病毒介导的人抗肌萎缩蛋白小基因在mdx鼠骨髓间充质干细胞的表达

目的构建含有人抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转移的假肥大型肌营养不良模型小鼠(mdx)骨髓间充质干细胞(MSCs)中目的基因的表达。方法构建含有抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体,利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PA317,制备含有目的基因的重组逆转录病毒并感染mdx鼠的MSCs,利用免疫荧光、RT-PCR法检测目的基因的表达。结果成功构建了抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒载体。含抗肌萎缩蛋白小基因的逆转录病毒感染mdx鼠MSCs后48h,RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳出现319bp DNA片断;免疫荧光检测显示感染组mdx鼠MSCs中可见红色颗粒,深浅不一。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将抗肌萎缩蛋白小基因转移至mdx鼠MSCs并表达。     

疾病动物模型的新领域——转基因动物

分子生物学的出现与发展是转基因动物诞生的前提。转基因动物是指用基因工程技术，将外源目的基因经由生殖细胞或早期胚胎导入动物胚胎细胞染色体基因组内，使之稳定整合并能传给下一代的动物。被导入的外源目的基因称；为转基因，转基因动物问世短短二十余年间，在建立转基因动物的方法及已建立的转基因动物品系等方面都取得了长足的发展与完善。转基因动物的应用已渗透至包括医学在内的多学科领域中。本文仅就通过转基因动物技术建立的医学疾病动物模型予以扼要的介绍。1传染病转基因动物模型长期以来，对一些传染病病原体的致病机理，疫…     

HSV1—TK逆转录病毒载体构建及表达

目的 构建含TK基因逆转录病毒载体并检测其在转染细胞中的表达，为肺癌基因治疗积累实验资料。方法 从PHSV106质粒中切下约2．4kbTK基因片段，插入逆转录病毒载体PLXSN多克隆位点，酶切筛选正、反向连接质粒。正向连接子电穿孔法转化肺癌细胞A549，用PCR、细胞原位杂交法分别检测TK基因整合和表达。结果 经酶切鉴定得到正向连接子、电穿孔法转导A549细胞，经G418筛选出了转基因细胞，TK基因已整合在转染细胞中并阳性表达。结论 成功构建了TK基因逆转录病毒载体，转导该载体的肺癌细胞可表达TK基因。     

反义细胞周期素D1基因转导肾小球系膜细胞

建立外源基因转导肾小球系膜细胞的基因转移系统，为系膜增殖性肾小球疾病的机制和治疗研究提供条件。方法：利用基因重组技术构建反义CyclinD1逆转录病毒表达载体，重组体经Lipofectin转染第3代包装细胞，建立了能持续分泌假病毒颗粒的无性细胞系，重组病毒经DEAE-葡聚糖转导肾小球系膜细胞，并对系膜细胞转录表达CyclinD1反义RNA水平进行原位杂交分析。结果：建立的无性细胞系上清中病毒滴度达1×10~6CFU／ml以上；假病毒重组体成功转导系膜细胞，并高效表达CyclinD1反义RNA。结论：该逆转录病毒载体基因转移系统能很好地适用于系膜增殖性肾小球疾病的间接体内基因治疗研究。     

生物技术在肿瘤发生、癌早期检测、基因工程和基因治疗中的作用和展望(续完)

２．３．２转基因技术及其实验动物是将体外克隆的基因，通过基因携带体，植入靶动物体内并释放功能蛋白，此种转基因只能维持一定时期的功能，如果使基因携带体稳定的结合到动、植物细胞的基因库内，并能复制给后代，此种动物或植物称为永久性转基因动物或转基因植物。此...     

hR24L基因的克隆及逆转录病毒重组体的构建

目的　克隆人类DNA损伤修复基因hR2 4L ,并构建逆转录病毒表达载体重组体 ,为进一步研究该基因的功能及作用机制奠定基础。方法　用PCR法扩增hR2 4L基因的开放阅读框 (ORF) ,然后连接到 pEGM -T载体中 ,经测序验证无突变后 ,再重组到逆转录病毒表达载体 (pDor -neo)中 ,得到正义和反义重组体。 结果　建立了一种有效的基因克隆方法 ,成功地克隆了hR2 4L基因 ,获得了含有重组体的稳定遗传的细胞株。结论　PCR法是克隆hR2 4L基因的有效方法 ,成功构建逆转录病毒表达载体重组体是研究该基因的重要前提     

hTERT-逆转录病毒载体构建及其在脐血间质干细胞中的表达

目的:构建hTERT-逆转录病毒载体,向脐血间质干细胞(UCBMSCs)中导入hTERT基因,观察该基因的表达。方法:PCR法扩增出hTERT全部片断,定向克隆入pLNCX2载体。将病毒质粒导入包装细胞内,筛选阳性产毒细胞,测定病毒滴度。取病毒上清感染脐血MSCs,筛选转基因细胞,检测转染前后hTERT在mRNA水平的表达。结果:用BglⅡ和NotⅠ双酶切构建质粒,证明PLNCX2-hTERT构建成功,转基因细胞的hTERT基因在mRNA水平得到表达。结论:hTERT-逆转录病毒载体构建成功,在逆转录病毒介导下,外源性hTERT基因转入脐血MSCs后得到表达。     

人P58.1重组逆转录病毒载体的构建及其在淋巴细胞中的表达

目的构建人P58.1基因的逆转录病毒表达载体并探讨该基因在淋巴细胞中的表达。方法由逆转录病毒栽体pMSCV介导，将白血病受者的P58．1基因导入健康供者的淋巴细胞中，并用逆转录聚合酶链式反应和流式细胞仪检测转染后基因的表达。结果测序及BglⅡ、EcoRⅠ双酶切鉴定证实，获得了P58.1基因且已正确插入载体pMSCV。流式细胞仪检测空载体、未转染及重组pMSCV转染供者淋巴细胞的P58．1分子表达率差异有显著性，重组逆转录病毒感染的供者淋巴细胞整合了受者的P58．1基因，且能转录为相应的mRNA并在细胞膜上有P58．1分子表达。结论成功获得P58．1基因并构建重组逆转录病毒载体，该基因已稳定整合入淋巴细胞的基因组中，且获得了表达。     

逆病毒载体介导的双耐药基因在小鼠骨髓细胞的转移

目的　增强造血细胞对化疗药物的耐受性 ,探讨逆转录病毒介导的基因转移效率及耐药基因导入在造血细胞保护性基因治疗中的作用。方法　应用电穿孔基因转移法将逆转录病毒载体G1Na MGMT IRES MDR1导入病毒包装细胞GP E86及PA3 17,以VCR加压筛选后的阳性克隆上清感染小鼠骨髓细胞 ,应用PCR、Southernblot及流式细胞仪检测耐药基因MGMT及MDR1在细胞中的转移与表达。结果　加压筛选及乒乓效应使病毒滴度由 ( 0 .2～ 7.6)× 10 4CFU/mL提高到 ( 1.9～ 5 .7)× 10 6 CFU/mL ,从DNA、RNA及蛋白水平上分别证实了双耐药基因在小鼠骨髓细胞中获得了有效转移和表达 ,而转基因后的小鼠骨髓细胞对VCR、高三尖杉酯碱和BCNU的耐药性比未转导细胞分别提高了 5 .7、5 .0和 8.5倍。结论　双耐药基因成功导入小鼠骨髓细胞为肿瘤基因治疗的临床研究提供了实验基础。