人Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV200-OB转化宿主菌E.coli JM109，热诱导获得目的蛋白的表达。经SDS－PAGE鉴定分析，目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40％以上，且以包涵体的形式表达。通过包函体分离，Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层极及Hypersil C18柱反相色谱纯化，获得纯度在95％以上，内毒素含量小于10EU／Mg的高纯度的重组人Leptin.Westem-blot鉴定表明，纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合；蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致。纯化产物经复性处理，其分子中Cys96和Cys146形成二硫键。体内活性检测显示，纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB／c小鼠的进食和体重增长，提示其具有明显的生物学活性。     

抗人结肠癌单链抗体CL-3在大肠杆菌中的表达、复性和纯化

目的:为得到单链抗体高效表达,我们对抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究.方法:以重组质粒表达载体 pJW2-CL-3 转化大肠杆菌DH5α,重组克隆在培基中温控诱导,以包涵体形式表达单链抗体.包涵体经溶解、复性、纯化后,以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白,ELISA法鉴定单链抗体的免疫活性.结果:42 ℃诱导 5 h 蛋白表达量占菌体蛋白的 30%. 8 mol/L 尿素可将包涵体大部分溶解,稀释于复性缓冲液中静置 10 ℃ 48 h 以上可使包涵体蛋白复性.纯化峰经鉴定, 27 KD 处表达之蛋白为带有E-tag的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,并证明其具有与抗原CEA特异性结合的功能,免疫活性与亲代抗体 CL-3 相似.结论:本研究获得的以包涵体形式在大肠杆菌中表达的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,具有与亲代抗体相似的免疫活性,为高效表达单链抗体,用于肿瘤的诊断和治疗提供了依据.     

Balb/Cdx鼠甘露聚糖结合凝集素-A糖识别域的原核表达

目的 获取具有生物学活性的Balb/C小鼠血清型甘露聚糖结合凝集素(MBL-A)糖识别域(CRD)蛋白.方法 应用PCR从含Balb/C小鼠MBL广A基因的质粒pmMBL-A中扩增目的 基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的 蛋白.表达产物(包涵体)经洗涤和复性处理后,利用GST柱纯化,以SDS-PAGE、Western blotting和ELISA进行分析鉴定.结果 从pmMBL-A中扩增到约450 bp的DNA片段,构建重组载体pET41a-mMBL-A-CRD,经酶切和测序鉴定后,将其导人大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约47 000.包涵体经洗涤及复性处理,GST柱纯化后,融合蛋白的纯度达90%以上.Westemblotting显示重组融合蛋白与抗GST抗体特异性反应,糖结合试验表明表达产物具有生物学活性.结论 成功获得了具有生物学活性的Balb/C小鼠MBL-A CRD蛋白,为MBL-A分子的研究奠定了一定基础.     

Balb/C小鼠甘露聚糖结合凝集素-A糖识别域的原核表达

目的 获取具有生物学活性的Balb/C小鼠血清型甘露聚糖结合凝集素(MBL-A)糖识别域(CRD)蛋白.方法 应用PCR从含Balb/C小鼠MBL广A基因的质粒pmMBL-A中扩增目的 基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的 蛋白.表达产物(包涵体)经洗涤和复性处理后,利用GST柱纯化,以SDS-PAGE、Western blotting和ELISA进行分析鉴定.结果 从pmMBL-A中扩增到约450 bp的DNA片段,构建重组载体pET41a-mMBL-A-CRD,经酶切和测序鉴定后,将其导人大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约47 000.包涵体经洗涤及复性处理,GST柱纯化后,融合蛋白的纯度达90%以上.Westemblotting显示重组融合蛋白与抗GST抗体特异性反应,糖结合试验表明表达产物具有生物学活性.结论 成功获得了具有生物学活性的Balb/C小鼠MBL-A CRD蛋白,为MBL-A分子的研究奠定了一定基础.     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

黄牛朊蛋白原核表达产物的复性与活性分析

目的复性黄牛朊蛋白原核表达产物,分析复性蛋白的活性,以获得有活性的牛重组朊蛋白。方法构建并诱导表达黄牛朊蛋白基因重组菌,复性其包涵体裂解物,对GST-BoPrP（93～241）（Q234R）复性产物进行GSTrap FF柱层析纯化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹观察其提纯和复性效果。结果重组菌可表达分子质量约为42.4 ku的目的蛋白,包涵体裂解物经过透析复性后,可获得较高纯度的复性目的蛋白。各复性产物和纯化的GST-BoPrP（93～241）（Q234R）蛋白经免疫印迹鉴定,发现仅分子质量约为42.4 ku的条带与单抗4C11结合。结论获得高纯度复性黄牛朊蛋白原核表达蛋白,具有良好的免疫反应活性。     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coliBl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建趋化因子受体5(CCR5)胞外段重组蛋白(命名为:rCCR5)原核表达载体,并进行诱导表达.对表达产物进行纯化和鉴定.方法:截取CCR5胞外结构4个片段N-Term,ECL1, ECL2和ECL3的氨基酸序列,应用柔性linker分别串联,模拟CCR5胞外结构,依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行Western blot鉴定.结果:目的蛋白以包涵体形式存在,经包涵体洗涤、变性溶解,SephacrylS-300凝胶过滤层析及SephacrylS-100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质,目的蛋白能与CCR5 mAb特异性结合.结论:获得了大量纯化的rCCR5重组蛋白,可作为研制CCR5自体蛋白疫苗以阻断HIV-1感染的候选抗原蛋白.     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

重组人淋巴毒素α的高密度发酵、复性和纯化

目的建立和优化重组人淋巴毒素α(rhLT-α)工程菌高密度发酵方法以及目的蛋白的复性和纯化方法,得到高纯度的重组人淋巴毒素α。方法高密度发酵rhLT-α工程菌,超声破碎细胞提取包涵体,经过复性后,用DEAE Sepharose FF,Phenyl Sepharose FF(LS)进行分离纯化。结果重组人淋巴毒素α以包涵体形式表达,经过破碎离心收集包涵体,洗涤后包涵体纯度达到85%以上。复性后,经两步纯化,最终目的蛋白纯度达98%以上。活性达6×108U/mg以上。结论建立了高效简便的淋巴毒素生产工艺,为淋巴毒素的规模生产打下了基础。     

瘦素对大鼠肝纤维化星状细胞的作用及相关ERK信号转导机制

目的：探讨瘦素（leptin）对大鼠肝纤维化星状细胞（HSC）的作用及相关信号转导机制。方法采用改良原位灌注、Optiprep密度梯度离心法分离纯化大鼠HSC。通过台盼蓝拒染试验评估细胞存活率,α-平滑肌肌动蛋白（α- SMA）免疫组化鉴定,光镜观察形态学变化。将40只SD大鼠分为4个处理组：对照组、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）组（加入10-7mol/L AngⅡ）、Leptin组（加入100ng/ml Leptin）、Leptin＋AngⅡ组（加入100ng/ml Leptin＋10-7mol/L AngⅡ）。分别采用3H- TdR和3H- Pro掺入法进行HSC增殖和胶原合成的测定。Western blot检测各处理组p- ERK1/ERK1、p- ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白表达情况。结果大鼠HSC存活率＞90%,传代1次后HSC纯度＞95%。与对照组相比,AngⅡ组、Leptin组、Leptin＋AngⅡ组的HSC增殖和胶原合成均明显增加（均P＜0.05）;与AngⅡ组、Leptin组相比,Leptin＋AngⅡ组HSC增殖和胶原合成明显增加（均P＜0.05）。Western blot显示,AngⅡ组、Leptin组、Leptin＋AngⅡ组的p- ERK1/ERK1、p- ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平均较对照组明显升高（均P＜0.05）;与AngⅡ组、Lep-tin组相比,Leptin＋AngⅡ组p- ERK1/ERK1、p- ERK2/ERK2、AngⅡ蛋白水平明显升高（均P＜0.05）。结论瘦素可通过上调AngⅡ水平,激活ERK信号转导通路,刺激HSC增殖和胶原合成,导致肝纤维化。     

Serum leptin levels and blood pressure in the overweight elderly

BACKGROUND: Leptin is a protein produced by adipocytes that reduces reflex appetite by blocking the Y neuropeptide, thus causing body weight loss. A large percentage of elderly people are reported to exhibit obesity, which may be caused by low leptin serum levels. However, hypertension is a highly prevalent condition in old age. Obesity under these circumstances is an added risk factor due to the presence and severity of hypertension and thus can be related with leptin serum levels. Our objective was to determine the relationship between leptin serum levels and hypertension in obese elderly persons. METHODS: A comparative transverse study was done in a random sample of 61 elderly persons-36 obese and 25 non-obese. Their blood pressure and their leptin serum levels by RIA were measured. RESULTS: Leptin serum levels showed a statistically significant difference (p <0.05) in elderly obese individuals (12.8 +/- 4.4 microg/L vs. 9.8 +/- 4.2 microg/L). Likewise, 45% of obese elderly individuals and 20% of the non-obese were hypertensive with a predominant elevation of the systolic pressure. CONCLUSIONS: The higher serum leptin levels in obese elderly individuals suggests that aging is associated with resistance to leptin and/or to a decrease of receptors for this hormone. The high incidence of hypertension during the aging process is the result of associated obesity (OR = 3.2, CI 0.88-13.14).     

瘦素和胃肠道疾病的关系

瘦素(leptin)是由肥胖基因(ob gene)编码的蛋白质产物,主要由脂肪细胞分泌,是控制体质量的关键性激素。最近在胃上皮里发现了瘦素和瘦素的mRNA。瘦素参与了胃肠道炎症、免疫、损伤等病理过程。现结合近年国内外文献,就瘦素与胃肠道疾病的关系综述如下。     

熊果酸(UA)对大鼠活化型肝星状细胞(HSC)的NADPH氧化酶(NOX)亚基及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路活化的影响

 目的  观察熊果酸(ursolic acid,UA)对大鼠活化型肝星状细胞-6 (hepatic stellate cell T6,HSC-T6) NADPH氧化酶(NAPDH oxidase,NOX)亚基及其调控的磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase/Akt,PI3K/Akt)、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen activated protein kinase,P38MAPK)信号通路及其对基质金属蛋白酶组织抑制剂-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)、基质金属蛋白酶-1(metal matrix proteinase -1,MMP-1)蛋白表达的影响,并探讨其机制。方法  取对数生长期的HSC-T6细胞,随机分成6组:空白对照组、瘦素组(100 ng/mL)、UA干预组(UA 50 μmol/L+瘦素)、NOX抑制剂DPI干预组(DPI 20 μmol/L+瘦素)、P38MAPK抑制剂SB203580干预组(SB203580 10 μmol/L+瘦素)及PI3K抑制剂LY294002干预组(LY294002 10 μmol/L+瘦素)。采用Western blot法分别检测NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达;信号通路PI3K、Akt、P38MAPK的活化及TIMP 1、MMP 1蛋白表达。结果  UA能显著抑制瘦素诱导的gp91phox、 p22phox、p67phox、Rac1蛋白表达(P均<0.01),但UA对gp91phox、p67phox蛋白表达的抑制作用不及DPI和LY294002。UA能抑制瘦素诱导的PI3K蛋白表达及Akt、P38MAPK蛋白磷酸化(P均<0.01),与DPI及LY294002作用的差异无统计学意义。UA能抑制瘦素诱导的TIMP-1蛋白表达,同时促进MMP-1蛋白表达(P均<0.01)。结论  UA能抑制瘦素诱导的大鼠HSC T6细胞NOX亚基gp91phox、p22phox、p67phox、Rac1表达及PI3K/Akt、P38MAPK信号通路的活化;其下调TIMP-1蛋白及上调MMP-1蛋白表达的机制可能与UA抑制NOX调控的PI3K/Akt及P38MAPK信号通路有关。     

瘦素及其受体系统在女性生殖器官的表达

目的　研究瘦素 (leptin)及其受体 (Ob R)、瘦素信号传导相关蛋白质在女性生殖器官的表达 ,探讨瘦素对女性生殖系统的影响。方法　分别用免疫组织化学和原位杂交技术检测瘦素、具有信号传导功能的瘦素长受体 (Ob Rb)、磷酸化的细胞因子信号传导转录活化因子STAT3(p STAT3)、细胞因子信号传导抑制剂 3(SOCS3)、活化的STAT3蛋白质抑制剂 (PIAS3)在正常妇女子宫内膜 ( 39例 ,增殖期 2 4例 ,分泌期 15例 )、子宫颈和阴道及输卵管 ( 3例 )的表达。结果　 ( 1)瘦素、Ob RbmRNA及其蛋白质在子宫内膜的腺体及间质均呈阳性表达。 ( 2 )Ob Rb蛋白质在分泌期子宫内膜的表达 3例弱阳性 ,3例阳性 ,9例强阳性 ;在增殖期子宫内膜的表达为 2例阴性 ,19例弱阳性 ,3例阳性 ,两者比较差异有显著意义 (P <0 .0 1)。瘦素蛋白质在不同期子宫内膜的表达差异无显著意义。 ( 3)瘦素及受体蛋白质在子宫颈、阴道、输卵管的上皮 (包括腺体 )均有表达。 ( 4)信号传导相关蛋白质SOCS3、PIAS3在子宫内膜和子宫颈的腺上皮、输卵管的纤毛上皮呈阳性表达 ,p STAT3表达极弱或不表达。结论　瘦素可能通过受体系统 ,与生殖器官间有广泛联系 ,影响女性的生殖功能。     

睡眠剥夺对青春期大鼠瘦素水平的影响

目的研究睡眠剥夺对青春期大鼠瘦素水平的影响。方法健康Wister大白鼠共40只。4~5周龄。体重(102.09±8.99)g。实验组20只,雄性、雌性各10只;对照组20只,雄性、雌性各10只。采用改良多平台睡眠剥夺法建立模型,应用放射免疫法检测各组大鼠血清瘦素,所有数据均用-x±s表示,两组间差异比较采用t检验。结果72 h睡眠剥夺后,实验组大鼠血清瘦素为(0.68±0.47)pg/mL,对照组为(1.05±0.59)pg/mL,t=2.18,P<0.05,差异有统计学意义。结论睡眠剥夺使青春期大鼠瘦素水平降低,据此可以推测睡眠剥夺可能也会引起处于青春期的中小学生瘦素水平降低,进而影响中小学生青春期的发育及身体其它生理功能。因此,笔者建议,应该充分保证中小学生充足的睡眠,以免引起瘦素分泌减少,影响中小学生身体健康。     

瘦素与基质金属蛋白酶-9在胃癌中的表达及其临床意义

目的：探讨胃癌组织中瘦素（Leptin）和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达及临床意义。方法：采用免疫组化SP法检测20例胃炎组织（对照组）及50例不同分化程度胃癌组织中Leptin、MMP-9的表达。结果：（1）胃癌中Leptin的阳性表达明显高于对照组（P〈0．01）,并与胃癌的分化分型有关,与胃癌的淋巴结转移有关（P〈0．05）。（2）胃癌中MMP-9的阳性表达显著高于对照组（P〈0．01）,并与胃癌的分化分型都有关,且与胃癌的淋巴结转移有关（P〈0．05）。（3）Leptin与MMP-9在胃癌中的表达呈负相关（r=-0．507,P=0．000）。结论：Leptin和MMP-9与胃癌的浸润、转移有关,但Leptin在胃癌中对MMP-9起负调节作用。     

瘦素的表达分布及对脓毒症后内环境紊乱恢复的作用

目的研究瘦素(Leptin)的表达分布,以及脓毒症对其蛋白和mRNA水平的影响。方法采集正常大鼠下丘脑、肺、肝、脾、胃、十二指肠、肾、附睾脂肪垫、睾丸等重要脏器标本,以RT-PCR法检测Leptin mRNA表达的组织分布。建立大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)致脓毒症模型,设立假手术、CLP模型和CLP 脂肪乳、CLP 雌二醇、CLP 胰岛素组等干预能量代谢和神经-内分泌功能的实验组,采用放射免疫分析法检测损伤后12h各组血清Leptin浓度,并采用RT-PCR法检测损伤后下丘脑、脂肪及肺内Leptin mRNA表达的变化。结果正常大鼠上述9种重要脏器内均有Leptin mRNA表达。与损伤后假手术组血清Leptin相比,其他4组与之差异无统计学意义。与损伤后假手术组脏器组织Leptin mRNA表达水平相比,CLP模型组在下丘脑、脂肪和肺内的表达水平显著降低,其他3组则有不同程度的变化。脂肪乳对Leptin mRNA表达的影响具有中枢诱导而外周抑制的双向模式。结论Leptin广泛表达于机体多种重要脏器,它可能作为一种保护因子促进脓毒症后内环境紊乱的恢复。     

冠心病与瘦素、Hs-CRP及炎性因子的相关性

目的 探讨瘦素水平与冠心病炎症反应的关系,以及炎症反应蛋白和炎症因子在新发冠心病中的相关性及意义.方法 选择新发冠心病病人60例,其中心绞痛(CAP)36例,急性心肌梗死(AMI)24例,检测其入院后24 h内血清瘦素、超敏C-反应蛋白(Hs-CRP)、白细胞介素6(IL-6)水平.结果 CAP组血清瘦素、Hs-CRP、IL-6水平及AMI组血清Hs-CRP、IL-6水平均明显高于对照组,差异有显著性(t=4.429～12.470,P<0.05).CAP组瘦素水平高于AMI组(t=3.098,P<0.05),Hs-CRP、IL-6水平明显低于AMI组,差异有显著性(t=2.024～5.985,P<0.05).CAP组病人血清Hs-CRP水平与瘦素和IL-6水平呈显著正相关(r=0.610～0.680,P<0.05);瘦素与IL-6之间亦呈显著正相关(r=0.566,P<0.05).AMI组病人血清Hs-CRP水平与瘦素水平无相关关系(r=0.305,P>0.05),而与IL-6水平有显著正相关关系(r=0.585,P<0.05);瘦素与IL-6无相关关系(r=0.092,P>0.05).结论 瘦素及炎症因子参与了冠心病的发生发展,而且在冠心病发病中,瘦素参与了免疫炎性反应过程.     

瘦素及其受体在甲状腺乳头状癌中的表达与病理特征相关性研究

目的 探讨瘦素（Leptin）及瘦素受体即肥胖基因（obesity receptor,OB-R）在甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）中的表达与病理特征相关性,为临床PTC预后评估及治疗提供依据.方法 收集甲状腺腺瘤组织标本20例和PTC组织标本60例,采用SP免疫组织化学染色法检测Leptin、OB-R在PTC及甲状腺腺瘤组织中的表达,观察Leptin、OB-R在PTC及甲状腺腺瘤组织中的阳性表达情况,分析PTC中不同临床特征Leptin、OB-R的表达水平.结果 OB-R在PTC中的阳性率明显高于甲状腺腺瘤（P=0.04）.PTC中的双重表达率（46.7％）明显高于甲状腺腺瘤（20.0％,P=0.04）.Leptin、OB-R表达水平均在多发病灶、肿瘤直径≥1 cm、TNM分期为Ⅲ期、Ⅳ期的患者中明显升高（P＜0.05）,Leptin在有淋巴转移的患者中明显增高（P＜0.05）,而OB-R表达则与是否淋巴转移无明显关系（P＞0.05）.结论 Leptin、OB-R在PTC中存在高表达,双重表达也较普遍,在甲状腺癌发生、浸润、转移过程中起了一定作用.Leptin在PTC中具体作用机制若获得证实,则可能成为PTC预防及治疗的新靶点.