富血小板血浆对珊瑚支架上骨髓基质细胞增殖和成骨分化的影响

目的：评价富血小板血浆（plateletrichplasma，PRP）对珊瑚支架上骨髓基质细胞（marrowstromalcells，MSCs）增殖和成骨分化的影响。方法：将体外培养、扩增和诱导的兔MSCs悬液与同一供体来源的PRP混合，滴加到珊瑚圆片上，再滴加牛凝血酶溶液，形成珊瑚／MSCs／PRP复合物，继续在体外培养。以珊瑚／MSCs复合物和珊瑚／PRP复合物作对照。8d和14d，通过MTT法检测MSCs增殖情况；通过组织化学方法检测培养液中碱性磷酸酶活性和骨钙素含量；通过扫描电镜观察MSCs在珊瑚支架上附着、生长和增殖情况。结果：珊瑚／MSCs／PRP组的光密度值明显大于珊瑚／MSCs组（P〈0．05）；珊瑚／MSCs／PRP组培养液中的ALP活性和OC含量明显大于珊瑚／MSCs组（P〈0．05）；扫描电镜显示：珊瑚／MSCs／PRP组，大量MSCs附着于珊瑚表面和孔洞壁，可见孔洞内有血小板和纤维网格样结构存在；珊瑚／MSCs组，珊瑚表面和孔洞壁有少量MSCs附着；珊瑚／PRP组，珊瑚表面及其孔洞内有大量的血小板和纤维网格样结构存在。结论：PRP促进了珊瑚支架上MSCs的增殖、成骨分化和粘附。     

骨髓间充质干细胞与支架材料nHA/PA66复合培养的生物活性研究

目的：研究骨髓间充质干细胞与支架材料-纳米羟基磷灰石/聚酰胺66（nHA/PA66）复合培养时生物学特性。方法：体外培养兔骨髓间充质干细胞（MSCs）,并分为A、B、C、D四组。A组为对照;B组和D组进行骨向诱导;同时,C组和D组细胞与nHA/PA66复合培养。应用MTT实验、碱性磷酸酶（ALP）染色和生物化学分析、扫描电镜,分别对各组细胞的增殖速度、ALP活性及细胞在支架上的黏附情况进行检测。结果：MTT结果显示,A组细胞增殖曲线与C组相似,而B组和D组相似;A组和C组细胞增殖略高于B组和D组。结果表明,骨向诱导可使细胞增殖轻微下降,而与支架材料复合培养对MSCs增殖无影响。ALP染色及ALP活性生化分析进一步表明,MSCs与支架材料复合培养对其骨向分化能力无影响。SEM观察则表明,C组细胞和D组细胞与支架材料均粘附良好。结论：nHA/PA66适于MSCs的黏附、增殖及骨向分化,是一种极具价值的骨组织工程支架材料。     

富血小板血浆对兔骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的:探讨自体富血小板血浆(PRP)对体外培养的兔骨髓基质细胞(rBMSCs)生物学特性的影响。方法:体外培养的rBMSCs分为实验组和对照组,实验组中加入含1%PRP的DMEM条件培养基,对照组为不含PRP的DMEM培养基,在不同时间点收集两组细胞,分别进行形态学观察、细胞周期分布和增殖指数测定、碱性磷酸酶(ALP)染色和活性测定、骨钙素(OCN)含量测定以及骨桥蛋白(OPN)mRNA相对表达量的分析。结果:实验组细胞具有成骨细胞的形态学特征;PRP作用7d后S期细胞比例较对照组明显增加,细胞增殖指数由22.89±1.24增至33.15±1.02,具有统计学意义(P<0.01);实验组ALP染色呈阳性,且ALP活性、OCN含量均较对照组明显提高,差异具有统计学意义;OPN mRNA相对表达量是对照组的3.48倍。结论:PRP可促进rBMSCs的增殖并可提高rBMSCs的体外成骨潜能,使其向成骨细胞转化。     

纳米羟基磷灰石表面阿伦膦酸钠和I型胶原蛋白复合膜对成骨细胞形态和增殖的影响

目的: 探讨经化学结合阿伦膦酸钠(alendronate sAium,ALN)和I型胶原蛋白(collagen type I,COL I)修饰的纳米羟基磷灰石(nano-hydroxyapatite,nHA)涂层对成骨细胞在其表面黏附、生长和增殖的影响。方法: 建立nHA涂层、nHA/ALN、nHA/COL I、nHA/ALN/COL I和nHA/COL I/ALN复合膜,将成骨细胞接种于复合膜表面,分别培养7 d和14 d,扫描电镜观察成骨细胞在不同膜层表面的黏附形态的变化,WST-1法对各膜层表面细胞数量进行定量检测。结果: 成骨细胞在nHA/ALN/COL I和nHA/COL I/ALN复合膜表面的增殖活性最高(P<0.05),扫描电镜观察成骨细胞在nHA/ALN/COL I和nHA/COL I/ALN复合膜表面生长状态优于其他膜层,在COL I膜直接作用下,成骨细胞伸展更为完全,并有较多伪足突起和微绒毛结构呈分化表型。结论: 将ALN和COL I 修饰于nHA表面能够协同促进成骨细胞的黏附和增殖。nHA/ALN/COL I复合膜促进成骨细胞的黏附与分化。     

载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞构建组织工程骨的实验研究

目的：探讨载辛伐他汀PLGA/CPC复合骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells)构建组织工程骨的可行性,并筛选辛伐他汀的有效载药量。方法：采用溶剂浇铸—粒子沥滤技术结合相分离法,制备不同浓度(辛伐他汀质量分别为0.1、0.5、1 mg)的载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料,扫描电镜观察孔隙率,绘制药物释放曲线;茜素红染色、I型胶原染色观察成骨诱导液和辛伐他汀对骨髓基质干细胞向成骨分化的作用;将第3代BMSCs经dil染色后,接种于不同浓度的复合支架材料上,扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察细胞在支架上的黏附情况,CCK-8和碱性磷酸酶(ALP)检测对其增殖和分化作用;采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：支架材料孔隙率达90%以上,孔径平均200~300 μm,载药组药物持续缓慢释放,未见药物突释现象;经辛伐他汀和成骨诱导组I型胶原表达阳性,茜素红染色可见明显钙结节;4组支架材料与细胞黏附性较好,0.5 mg组细胞生长状态最佳。CCK-8和ALP检测0.5 mg组能够明显促进细胞的增殖和分化。结论：辛伐他汀和成骨诱导液联合利用,能够更有效地促进BMSCs向成骨分化;载辛伐他汀PLGA/CPC复合支架材料是理想的组织工程支架材料;载0.5 mg辛伐他汀PLGA/CPC支架材料能够有效促进BMSCs的增殖和分化。     

富血小板血浆对犬骨髓间充质细胞矿化能力的影响

目的研究富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对犬骨髓间充质细胞(marrow stromal cells,MSCs)碱性磷酸酶(alka-line phosphatase,ALP)及矿化结节形成能力的影响。方法将不同浓度(10%、20%、30%)的PRP及重组人骨形成蛋白(rhBMP-2)加入体外培养的第3代MSCs中,对照组为无血清培养液,检测其对细胞ALP活性的影响;将第3代的MSCs在体外进行培养,实验组加入矿化液和PRP(10%或30%),对照组只加矿化液。4周后用茜素红及Von-Kossa染色检测矿化结节的形成。结果10%PRP和rhBMP-2能显著提高MSCs的ALP活性,其中10%PRP对体外矿化结节的形成,亦有一定程度的促进作用。结论PRP有促进MSCs向成骨细胞方向转化的趋势。     

富血小板血浆对鼠骨骼肌卫星细胞增殖及成骨活性的影响

目的:观察富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对体外培养的SD大鼠骨骼肌卫星细胞(muscle satellitecells,MSCs)增殖与诱导成骨的影响,探讨富血小板血浆诱导MSCs成骨的可能机制。方法:从SD大鼠心脏抽取全血,参照Landesberg法制备PRP,并进行全血和PRP中血小板(PLT)计数。取新生3～5 d的SD大鼠四肢骨骼肌,采用酶消化及差速贴壁法体外培养鼠MSCs,采用免疫组织化学的方法进行鉴定。四甲基偶氮唑盐法(MTT)观察不同浓度的自体PRP(1.6%、6.25%、12.5%)对MSCs增殖的影响;以碱性磷酸酶(ALP)钙钻法染色、ALP活性测定、茜素红染色及骨钙素和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色法,检测PRP对MSCs向成骨细胞分化的诱导作用。结果:采用Landesberg法成功获取PRP;酶消化及差速贴壁的方法成功获取MSCs,desmin及α-sarcomeric actin免疫组织化学染色阳性;浓度为6.25%的PRP可明显促进MSCs的增殖;ALP钙钴法染色阳性,胞质内见大量黑色颗粒沉积;ALP活性较对照组增高明显(P<0.01);茜素红染色可见钙结节形成;骨钙素和Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性。结论:PRP对体外培养的鼠MSCs增殖及成骨分化活性具有显著的促进作用。     

多孔支架材料PLGA/HA生物相容性的实验研究

目的:探讨多孔支架材料聚乳酸羟基乙酸/羟基磷灰石(poly lactic-glycolic acid/hydroxyapatite,PLGA/HA)的生物相容性。方法:贴壁法培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),经体外诱导、扩增,采用实验组A:PLGA/HA(5%HA)、实验组B:PLGA/HA(10%HA)的梯度浸提液进行体外培养,应用MTT法评估材料的细胞毒性;BMSCs与实验组A、实验组B、对照组C(polylactic-glycolicacid,PLGA)进行体外复合培养,通过定性及定量检测细胞在材料表面的粘附、增殖能力及成骨活性,比较分析各组支架材料之间的差异。结果:两实验组材料的细胞毒性均为0或1级;BMSCs能在实验组和对照组支架材料上粘附、增殖,且两实验组与对照组在各时间点有显著性差异(P<0.01)。碱性磷酸酶活性各时间点在两实验组间无明显差异。结论:多孔支架材料PLGA/HA(5%HA)、PLGA/HA(10%HA)具有良好的生物相容性,有可能应用于骨组织工程。     

PRP/nHA/Co复合材料修复牙周组织缺损的应用研究

目的:将富含血小板血浆(PRP)与纳米羟基磷灰石(nHA)/胶原(Co)复合,通过动物实验评价复合材料的生物学性能,充分发挥每种材料的优点,使之成为组织工程学中一种新型替代骨组织的生物活性材料和支架材料。方法:将nHA和胶原复合并将其制备成nHA/Co复合膜后加入PRP制备成PRP/nHA/Co复合材料。实验动物制备大小为5mm×5mm的牙周缺损,右侧为实验组,在相应牙位置入PRP/nHA/Co复合膜材料;左侧对照组不放置任何材料。术后第4、8周行64排CT片和组织病理检查,观察成骨效果。结果:动物生存状态良好,牙龈附着愈合良好。CT观察实验组出现新生牙槽骨,骨嵴基本恢复到原来高度;对照组牙槽嵴高度未见增加。HE染色观察对照组缺损处周围见大量炎性细胞,纤维组织增生,无软骨形成并有大量上皮长入;实验组可见大量新生的牙槽骨。结论:PRP/nHA/Co复合生物膜可以作为组织工程学中一种新型替代骨组织的生物活性材料和支架材料。     

富血小板血浆对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨影响的实验研究

目的:探讨富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bonemarrowmesenchymal stem cells,rBMSC)体外成骨能力的影响。方法:体外分离、培养rBMSC,经细胞表面标记物检测和体外诱导分化鉴定后,分别采用MTT法检测PRP对细胞增殖活性的影响;细胞化学法检测PRP对成骨诱导后rBMSC碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)活性的影响;RealTime-PCR检测PRP对细胞成骨分化指标Col-3、OPN mRNA表达水平的影响;扫描电镜观察PRP对rBMSC在Bio-Oss上粘附的影响。结果:rBMSC传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;细胞表面标记物CD29阳性率为88.2%,CD90阳性率为98%,CD34细胞阴性率为2.8%,CD45细胞计数阴性率为2.7%;成骨诱导21 d后,茜素红染色可见明显矿化结节;成脂诱导14 d后,油红O染色可见红色脂滴形成。MTT检测,10%PRP组在培养1、3、5、7、9 d各时间点的OD值均显著高于空白对照组(P<0.05)。ALP染色显示,无论是诱导培养7 d还是14 d,成骨诱导液+PRP组的ALP活性均明显高于单纯成骨诱导液组,差异有统计学意义(P<0.05);另外,各组不同诱导培养时间点相比还发现,无论是实验组还是对照组,在诱导7 d时,ALP活性均较低;而在14 d,ALP的活性明显升高。RealTime-PCR检测显示,单纯10%PRP诱导培养7 d和14 d后细胞Col-3、OPN mRNA水平虽稍低于成骨诱导液组,但明显高于空白对照组,而10%PRP联合成骨诱导液诱导培养7 d和14 d的Col-3、OPN mRNA的表达量更高,与其他各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。另外各组诱导培养14 d的Col-3、OPN mRNA水平显著高于相应的7 d组(P<0.05)。扫描电镜结果显示PRP明显促进rBMSC在Bio-Oss骨粉上的粘附与伸展。结论:PRP对rBMSC的增殖、成骨分化,以及在生物材料上的粘附能力均具有明显的促进作用。     

PLGA/PCL/nHA生物支架复合兔BMSCs体外培养的实验研究

目的:研究新型复合支架聚乳酸-聚乙醇酸/聚己内酯/纳米羟基磷灰石(PLGA/PCL/nHA)的生物相容性,探讨其作为细胞培养材料和骨组织工程支架的可行性.方法:将兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)接种于PLGA/PCL/nHA复合支架上,体外共同培养后,MTT法检测BMSC...     

PLGA微囊支架材料的制备及对成骨细胞粘附和增殖的影响

[摘要]目的：制备一种新型结构的聚乳酸-羟基乙酸共聚物[poly（1actic—co—glycolicacid,PLGA]微囊支架,对其进行表征,并检测其对成骨细胞增殖与粘附的影响。方法：采用复乳法制备PLGA微囊,以激光粒度仪分析其粒径分布,筛选出合适的粒径大小,通过二氯甲烷蒸汽熏蒸使微囊结合,再经过烧结最终形成三维支架,通过扫描电子显微镜观察微囊及微囊支架形态。将MC3T3-E1成骨细胞接种到该支架上,通过扫描电镜观察细胞在支架上的粘附形态,通过CCK-8法检测细胞增殖的情况,并与无支架对照组进行比较。结果：制备的PLGA微囊支架具有一定孔径和孔隙率,具有三维连通的多孔结构,且孔隙结构均匀。细胞可在支架表面粘附生长。微囊支架上的细胞增殖活性高于对照组。结论：本方法制备的PLGA微囊支架具有一定的孔隙率和内部连通性,有利于细胞的粘附和增殖,在骨修复中有应用前景。     

应用珊瑚／骨髓基质细胞／富血小板血浆组织工程骨修复兔颅骨缺损

目的：评价珊瑚／骨髓基质细胞（MSCs）／富血小板血浆（PRP）组织工程骨修复骨缺损的效果。方法：将兔MSCs悬液与同一供体来源的PRP混合后滴加到珊瑚团片上,形成珊瑚／MSCs／PRP复合物,用其修复MSCs和PRP来源兔颅骨极限缺损。自体颅骨或单纯珊瑚植入作为对照。术后6周和12周,通过组织学观察和组织形态测量分析．评价其骨修复效果。实验数据采用SPSS11．0软件包处理,两组之间差异采用t检验。结果：组织学观察显示,珊瑚／MSCs／PRP组,术后第6周,在整个缺损区珊瑚表面及其孔洞内有大量新骨形成;第12周,缺损区珊瑚完全降解吸收,被成熟的板层骨取代,缺损表现为完全的骨修复.图像分析显示：术后第6周和第12周,珊瑚／MSCs／PRP组的成骨量显著多于珊瑚组（P〈0．01）;术后第12周,珊瑚／MSCs／PRP组成骨量与自体骨组接近（P〉0．05）。结论：应用珊瑚作为支架材料、MSCs作为种子细胞、PRP作为内源性生长因子构建的组织工程骨修复骨缺损效果良好,与自体骨移植相近．是较理想的骨移植替代材料．     

模拟微重力环境对人牙髓干细胞体外增殖能力的影响

目的：研究模拟微重力环境对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）在PLGA支架上体外增殖能力的影响。方法：将分离、鉴定后的人牙髓干细胞接种在PLGA支架上,采用MTT法检测普通环境和模拟微重力环境中培养24、48、72h的人牙髓干细胞在PLGA支架上的细胞活性。DAPI荧光染色和流式细胞术比较牙髓干细胞在两种环境培养3d的细胞数量以及细胞周期分布情况。结果：MTT显示模拟微重力组中各时间点的A值均高于普通环境培养组;DAPI荧光染色显示在模拟微重力下培养3d的人牙髓干细胞数量明显多于普通环境培养组;细胞周期分析结果表明模拟微重力组中S期细胞比例明显高于普通环境培养组（P〈0.05）。结论：接种在PLGA支架上的人牙髓干细胞在模拟微重力环境下较普通环境具有更高的体外增殖能力。     

不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石复合支架对人牙髓干细胞增殖及矿化能力影响研究

 目的　探讨不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石（PLGA/HA）复合支架的降解速率及其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）增殖及矿化能力的影响。方法    采用溶液浇筑/颗粒沥析技术构建含质量分数分别为10%、20%及30% HA的PLGA/HA复合支架的3个实验组，单纯PLGA支架作为对照组。采用降解实验检测支架的降解速率。将hDPSCs接种于不同比例的PLGA/HA复合支架进行培养，扫描电镜观察细胞形态，应用MTT法检测细胞增殖能力。hDPSCs接种于各组支架培养72 h后，将复合支架植入裸鼠体内，分别于饲养1个月及3个月后处死裸鼠取出支架，应用HE染色观察组织学形态，应用牙本质基质蛋白1（DMP1）免疫组化染色观察细胞的矿化程度。结果    10%HA组和20%HA组具有较适宜的降解速率。各组均具有较高的促hDPSCs增殖能力，促进效果随HA含量的增加而加强。HE染色和免疫组化染色结果显示，HA可促进hDPSCs在体内的成牙本质向分化，分化程度与HA含量成正比，20% HA组及30% HA组矿化程度均较佳。结论   含20%HA的PLGA/HA复合支架具有较佳的降解速率及促细胞增殖和矿化能力，是比较理想的细胞支架材料。     

不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石复合支架对人牙髓干细胞增殖及矿化能力影响研究

目的　探讨不同比例的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物与羟基磷灰石（PLGA/HA）复合支架的降解速率及其对人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）增殖及矿化能力的影响。方法    采用溶液浇筑/颗粒沥析技术构建含质量分数分别为10%、20%及30% HA的PLGA/HA复合支架的3个实验组,单纯PLGA支架作为对照组。采用降解实验检测支架的降解速率。将hDPSCs接种于不同比例的PLGA/HA复合支架进行培养,扫描电镜观察细胞形态,应用MTT法检测细胞增殖能力。hDPSCs接种于各组支架培养72 h后,将复合支架植入裸鼠体内,分别于饲养1个月及3个月后处死裸鼠取出支架,应用HE染色观察组织学形态,应用牙本质基质蛋白1（DMP1）免疫组化染色观察细胞的矿化程度。结果    10%HA组和20%HA组具有较适宜的降解速率。各组均具有较高的促hDPSCs增殖能力,促进效果随HA含量的增加而加强。HE染色和免疫组化染色结果显示,HA可促进hDPSCs在体内的成牙本质向分化,分化程度与HA含量成正比,20% HA组及30% HA组矿化程度均较佳。结论   含20%HA的PLGA/HA复合支架具有较佳的降解速率及促细胞增殖和矿化能力,是比较理想的细胞支架材料。     

应用富血小板血浆和骨髓基质细胞构建细胞-膜片及其异位成骨的实验研究

目的：探讨应用富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）和骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）构建细胞-膜片的方法并评价膜片包裹珊瑚支架后的异位成骨能力。方法：将体外培养扩增的兔MSCs悬液与PRP混合,滴加到6孔培养板上,再滴加牛凝血酶溶液,形成凝胶样MSCs／PRP混合物,置于孵箱内培养。第1周用DMEM完全培养液,后2周改用DMEM诱导培养液。用得到的细胞-膜片包裹珊瑚圆片后,植入裸鼠背部皮下,以单纯珊瑚植入作对照。术后4周和8周取材,通过组织学观察,评价其异位成骨情况。结果：细胞-膜片具有一定的韧性和可操作性。扫描电镜观察显示：膜片由大量的纺锤样成骨细胞有规律地密集在一起而形成。组织学观察显示：术后4周和8周,膜-支架复合体珊瑚支架的表面及其孔洞内有大量的软骨或骨形成,以软骨内成骨的方式成骨;单纯珊瑚植入组,珊瑚表面及其孔洞内有大量纤维结缔组织长入,未见软骨或骨形成。结论：用PRP和MSCs构建细胞-膜片的方法简便,膜片包裹珊瑚支架形成的膜一支架复合体具有良好异位成骨能力。     

富血小板血浆对珊瑚支架上骨髓基质细胞异位成骨的影响

目的：评价富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）对珊瑚支架上骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）异位成骨的影响。方法：将MSCs悬液与同一供体来源的PRP混合后滴加到珊瑚圆片上,形成珊瑚/MSCs/PRP复合物。以同样数量MSCs或PRP制备珊瑚/MSCs和珊瑚/PRP复合物。将3种复合物植入同一裸鼠的背部皮下。术后4周和8周取材,通过组织学观察和组织形态测量分析评价其异位成骨情况。结果：植入后4周或8周,珊瑚/MSCs/PRP组珊瑚表面及其孔洞内有大量的软骨或骨质形成;珊瑚/MSCs组珊瑚表面及其孔洞内也有软骨或骨质形成,并有纤维结缔组织长入;珊瑚/MSCs/PRP组形成的软骨或骨质的量明显多于珊瑚/MSCs组（P〈0.01）;珊瑚/PRP组珊瑚周围及其孔洞内有大量纤维组织,未见骨或软骨形成。结论：PRP促进了珊瑚支架上MSCs的异位成骨。