全长cDNA文库的构建和新基因全长cDNA克隆的策略

基因全长cDNA克隆是研究基因功能的前提之一。新基因全长cDNA克隆的方法很多，目前比较可行且应用较多的主要是cDNA库筛选。本主要介绍了近年来比较常用的全长cDNA库的构建及全长cDNA的克隆(包括“电子”基因克隆)的策略和方法及其进展。     

人肝癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

0　引言2 0世纪 90年代起 ,原发性肝癌已上升为我国第二位癌症杀手 ,加紧对其复发、转移机制及相关抗原的基础研究工作十分必要 [1] .我室多年来制备了数株肝癌特异性单克隆抗体 ,其中一株抗体与放射性核素的交联物治疗肝癌已处在临床验证阶段 .找到这几株单抗的相应抗原基因对肝癌的基础研究应很有意义 .利用抗体寻找抗原基因的最有效方法是构建c DNA文库 [2 ] ,继而进行筛选、克隆等 .我们选取与几株单抗的免疫荧光及 Western免疫印迹反应均呈阳性结果的肝癌细胞株 HHCC作为建库材料来源 ,以λgt11DNA为载体 ,构建了人肝癌细胞 c DN…     

人乳腺癌细胞cDNA文库的构建及鉴定

目的 :应用前期制备的一株乳腺癌单克隆抗体 (M4G3) ,筛选出高表达其相关抗原的乳腺癌细胞系T47D ,并利用此细胞系构建了以λgt11为载体的cDNA文库 ,为完成此乳腺癌特异抗原基因的克隆与表达奠定基础。方法 :在4株乳腺癌细胞中应用M4G3单抗进行免疫组化和WesternBlot检测 ,以其中一株T47D细胞为材料构建以λgt11为载体的cDNA文库 ,并进行文库质量鉴定。结果 :文库含有9 97×105个重组子 ,重组效率达到96 7 % ,插入的cDNA片段平均长度为1 0kb。结论 :与M4G3单抗结合的乳腺癌抗原分子量约为48000dalton。构建的T47D细胞cDNA文库完整 ,具有较好的质量 ,为进一步筛选奠定了基础。     

人胃癌组织和对应正常胃粘膜cDNA文库的构建

作者从一例人高转移型原发性胃癌组织及其对应的正常胃粘膜中分别提取总RNA和分离多聚(A)~+RNA,进而合成cDNA。cDNA第一条链合成效率前者为58.8%,后者为29.8%;第二条链合成效率前者为98.3%,后者为93.3%。cDNA分子大小在0.5～8Kb之间。cDNA接上含有NotI切点和EcoRI粘性末端的接头,重组到经EcoRI酶解5端脱磷酸化的pT7T318U质粒上,转化大肠杆菌NM522,构建了二个cDNA文库,文库的容量分别为1.2×10~5与1.0×10~5重组子,重组率均为80%,克隆效率分别为2.4×10~6克隆/lμg cDNA与2.0×10~6克降/lμg cDNA,插入片段的大小在0.5Kb～4Kb之间。     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

阴道毛滴虫cDNA文库的构建和鉴定

目的 :构建阴道毛滴虫(Trichomonasvaginalis,Tv)全长cDNA表达文库 ,筛选全长目的基因 ,研究与其细胞周期相关基因的结构和功能。方法 :从Tv中提取总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库试剂盒构建其全长cDNA表达文库。结果 :所建文库的初始滴度为6 78× 10 6 pfu mL ,经一次扩增后的滴度为 1 6 8× 10 9pfu mL ,重组率 >98%。结论 :成功构建Tv全长cDNA文库 ,并从该文库中筛选出了与细胞周期相关的基因     

cDNA文库的构建策略

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要作用．近年来，随着分子生物学技术的发展，cDNA文库构建方法有了很大改进和提高．就cDNA文库构建的方法作一综述，     

人胎肝cDNA文库的构建

从水囊引产的５＋月孕龄胎儿肝脏中提取ＲＮＡ，分离含ｐｏｌｙ（Ａ）尾的信使ＲＮＡ［ｏｐｌｙ（Ａ）＾＋ｍＲＮＡ］，合成双链ｃＤＮＡ，定向插入λｇｔ１１表达载体，转染Ｙ１０９０受体菌，构建了人胎肝ｃＤＮＡ库。该库有１．３５×１０＾６个噬菌体，重组率为８７．５％，可用核苷酸探针和单克隆抗体两种方法筛选目的基因。     

人胃癌组织定向cDNA文库的构建

目的快速构建成人胃癌组织cDNA文库。方法从人胃癌组织分离总RNA,以含有轴IB酶切位点的oligo（dT）引物合成第1链cDNA,以含蛳IA酶切位点的SMART寡核苷酸为引物经LD-PCR扩增双链cDNA,双链cDNA经sGI（IA＆IB）酶切,以CHROMA SPIN＋TE-1000柱分级分离cDNA,收集符合需要的cDNA片段并纯化,随后将之与λTriplEx2载体连接经体外包装成噬菌体λ文库。结果经检测共获得2．73×10^6个重组子,重组率约为94％,插入片段大小平均为1．2kb。结论用SMART方法构建的胃癌组织cDNA文库质量较高,为以后筛选胃癌相关基因奠定了基础。     

人胎肝cDNA文库构建及鉴定

从人胎肝组织提取总ＲＮＡ并纯化出ｍＲＮＡ，经反转录合成第一、二链ｃＤＮＡ，去除小于２００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段后，连接ＥｃｏＲＩ人工接头，与去磷酸化的λｇｔ１１噬菌体长、短臂连接，体外包装后感染Ｅ．ｃｏｌｉＹ１０９０，成功构建含４．２×１０８重组子的人胎肝ｃＤＮＡ表达文库，重组子平均外源插入片段约１．５ｋｂ，适合用于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的　构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。　方法　提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。　结果　未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。　结论　已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD NA表达文库     

大肠癌抗原cDNA噬菌体表达库的构建及鉴定

目的 :构建人源性大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 .方法 :从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装 .转染E .coliXL1 Blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,确定文库容量大小 ,用ITPG和X gal测定重组率 .用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小 .结果 :构建成含 2 .39× 10 6重组子的人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 97.5 % ,插入外源cDNA片段大小范围从 1～ 4kb ,平均长约 2 .4kb .结论 :成功构建人大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因     

云南个旧肺鳞癌YTMLC细胞cDNA文库构建和鉴定

目的构建云南个旧人肺鳞癌YTMLC-90细胞cDNA文库。方法从培养的人肺鳞癌YTMLC-90细胞株中提取总RNA,利用经修饰的oligo(dr)引物(含S6 ⅠB酶切位点)合成cDNA第一链,同时根据真核生物mRNA5’端帽子结构特点。利用SMART寡核苷酸(含S6 Ⅰ A酶切位点)作为cDNA第一链在mRNA5’端延伸出去的模板,进而以此序列为引物,利用LD-PCR(long-distance PCR)合成双链cDNA,双链cDNA经S6Ⅰ(ⅠA和ⅠB)酶切和过柱分级分离后,克隆入经S6Ⅰ酶切的载体后经体外包装而成cDNA文库。结果人肺癌细胞YTMLC-90的cDNA文库获得1.01×10~6pfu/ml个重组子,重组率为93.2％,文库扩增后,滴度达5.24×10~6pfu/ml,插入cDNA的长度为750～3000bp。结论所构建的cDNA文库具有较好的质量,该文库为进一步筛选、克隆肺癌特异表达基因奠定了基础。     

人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库的构建

目的为进一步获得人卵巢癌相关抗原基因,构建人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库.方法从人上皮性卵巢癌组织提取总RNA,分离纯化mRNA,并以此为模板合成第1链cDNA,用置换法合成第2链cDNA.双链cDNA经末端削平、EcoR Ⅰ接头连接、XhoⅠ酶切、过柱分级分离,除去<400 bp片段,收集符合需要的cDNA片段与噬菌体ZAP Express载体连接,体外包装后获得人卵巢癌组织cDNA表达文库.结果经检测该原始文库滴度为5.5×106 pfu/ml,扩增后文库滴度为3.0×1011 pfu/ml,重组率96%.插入片段平均大小1.0 kb以上.结论所构建的人上皮性卵巢癌组织cDNA表达文库质量合格,为以后筛选获取卵巢癌特异性相关抗原基因或其它相关基因奠定了基础.     

HMy2细胞cDNA表达文库的构建和鉴定

目的 :构建人骨髓瘤细胞株HMy2cDNA表达文库 .方法 :提取HMy2细胞总RNA ,分离mRNA ,反转录合成双链cDNA ,消平cDNA末端 ,连接EcoRⅠ适配子 ,磷酸化EcoRⅠ适配子 5′端 ,Sephacryl S4 0 0柱除去小于 4 0 0bpcDNA片段 ,与去磷酸化的噬菌体λgt11连接 ,体外包装后建成cDNA文库 .取出一部分倍比稀释感染E .coliY10 90 ,测定文库大小、重组率 ,并以PCR鉴定cDNA插入片段的大小 .结果 :构建成含 1.5× 10 6重组子的人骨髓瘤细胞cDNA文库 ,重组子平均插入外源片段长约 1.4kb .结论 :所建文库合格 ,适合用于筛选目的cDNA克隆 .     

人源性大肠癌抗原基因噬菌体表达文库的构建及鉴定

目的构建人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库。方法从人大肠癌组织中提取总RNA,用RT-PCR合成cDNA第1链,用LD-PCR合成cDNA第2链,除去小于500 bp的小片段,与去磷酸化的λTriplEx2噬菌体左、右臂连接,体外包装,构建成cDNA噬菌体表达文库。转化E.coliXL1-Blue感受态细胞,滴定文库的滴度,确定文库容量大小;用ITPG诱导和X-gal显色测定重组率;用SfiⅠ酶切鉴定插入的cDNA片段大小。结果构建成含2.39×106 pfu/ml重组噬菌体的人大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,重组率为97.5%,插入cDNA片段大小范围从600~4 000 bp,平均长约1 400 bp。结论成功构建高质量人源性大肠癌抗原基因cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因。