环丙沙星间接竞争ELISA(ic-ELISA)检查方法的建立

目的:建立环丙沙星残留的间接竞争ELISA检测方法.方法:用卵清白蛋白与环丙沙星偶联物做包被抗原,标准环丙沙星做竞争抗原,建立间接竞争ELISA方法,并用数学方法对结果进行了分析.结果:所建立的ELISA检测方法,最低检测限为2.77 ng/rnl,检测范围为2.77～500 ng/ml.曲线回归方程为Y=-36.458X 110.98,相关系数r2=0.9946.结论:该ELISA方法可以用于环丙沙星残留的快速检测.     

对硫磷酶联免疫吸附检测法的建立

目的建立对硫磷酶联免疫吸附检测法。方法以间接竞争ELISA法为基础,对包被原浓度、抗对硫磷抗体浓度及酶标二抗浓度进行条件优化,建立间接竞争ELISA法检测对硫磷。结果通过对间接竞争ELISA的一系列条件优化,建立了检测对硫磷的间接竞争ELISA标准曲线,标准曲线的相关系数r=0.999 9,IC_(50)=0.542μg/ml。本标准曲线的最低检出限LOD=0.003 43μg/ml。结论建立的检测对硫磷的间接竞争ELISA方法特异性好,准确性和精密度高,有望用于实际样品检测。     

氯霉素竞争ELISA检测试剂盒的研制

目的应用抗氯霉素多克隆抗体,建立竞争ELISA分析方法,研制氯霉素残留快速检测试剂盒,并对其性能进行测定。方法选用抗氯霉素高特异性抗体,直接包被抗体后,将酶标记氯霉素和氯霉素标准品或样品加入预先包被了特异性抗体的孔内,建立直接竞争ELISA检测试剂盒。结果所选用的抗体对氯霉素亲和力高,与链霉素、四环素、土霉素、青霉素4种抗生素及克伦特罗的交叉反应率均小于0.01%;抗体的特异性强;检测质量浓度为50、10.5、0.5mg/ml样本时,平均变异系数为11.4%;对氯霉素残留检测的标准曲线为y=-14.843logx+56.692,R2=0.9965,线性范围为0.02～64.0ng/ml,检测限IC10为0.451ng/ml,灵敏度IC50为2.82ng/ml,样品的加标回收率为72%～113%。结论试剂盒检测的准确性和重现性较好,可用于批量虾肉、鸡肉、牛奶等样品中氯霉素残留的检测。     

醋酸甲羟孕酮间接竞争ELISA检测方法建立

目的建立以单抗为基础的醋酸甲羟孕酮间接竞争ELISA检测方法。方法将羧甲基羟胺盐酸盐和醋酸甲羟孕酮(MPA)反应生成MPA-3-(O-羧甲基)肟(MPS),MPS与牛血清白蛋白(BSA)偶联生成免疫原,采用淋巴细胞杂交瘤技术制备MPA单克隆抗体(MPA-McAb),建立水产品中MPA残留的间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法。结果经飞行质谱法测得MPS-BSA分子量为76 045.656 3,MPS与BSA偶联比为25.17;MPA-McAb最佳稀释倍数为1∶400 00;包被抗原最佳质量浓度为1μg/mL;标准曲线呈线性,相关系数R2=0.983 7,IC50=3.630 ng/mL;最低检测限为0.133 ng/mL;批内和批间变异系数分别为3.125%和3.557%;黄鳝鱼肉样的平均添加回收率为80.46%~101.00%;检测方法与甲羟孕酮、甲地孕酮的交叉反应(CR%)分别为0.26%,10.67%,与其他抗生素药物无交叉反应。结论醋酸甲羟孕酮间接竞争ELISA检测方法可用于水产品中醋酸甲羟孕酮残留量检测。     

β-内酰胺酶广谱特异性抗体制备及免疫分析方法建立

目的制备能够识别多种β-内酰胺酶结构的广谱特异性抗体,并初步建立用于检测牛奶中违法添加β-内酰胺酶的间接竞争酶联免疫分析方法(ELISA)。方法以混合β-内酰胺酶作为全抗原,免疫动物获得β-内酰胺酶广谱特异性多克隆抗体,分离纯化后进行详细表征,确定最佳使用条件,并开发适用于牛奶样品中β-内酰胺酶检测的免疫分析方法。结果获得了能够识别多种β-内酰胺酶的多克隆抗体,血清中抗体浓度达到17.9～18.9mg/ml,抗体重链和轻链分子量分别为55和25kD,总分子量为160kD,亲和常数为3.6×108L/mol,以该抗体为基础建立了检测β-内酰胺酶的间接竞争ELISA法,方法检出限为0.2ng/ml,线性范围0.2～200ng/ml,平均回收率在80%～115%之间,相对标准偏差小于20%。结论获得了β-内酰胺酶多克隆抗体,并建立了间接竞争ELISA方法测定牛奶中β-内酰胺酶含量。     

破伤风类毒素免疫定量检测

目的制备破伤风类毒素的单克隆抗体并建立竞争ELISA和双抗体夹心ELISA定量检测方法。方法用破伤风类毒素免疫小鼠,通过常规方法融合、间接ELISA筛选,有限稀释法克隆,制备破伤风类毒素的单克隆抗体。以制备的单克隆抗体进行竞争ELISA和双抗体夹心ELISA定量检测破伤风类毒素。结果应用制备的单抗进行的定量检测范围为0.003 2μg/ml~50μg/ml。2种方法对同一未知浓度样品的破伤风类毒素的检测结果分别为0.045 89μg/ml和0.045 94μg/ml。结论用制备的抗破伤风类毒素的单克隆抗体,建立了破伤风类毒素ELISA定量检测方法。     

应用随机肽库筛选展示河豚毒素模拟表位噬菌体

目的利用噬菌体随机肽库筛选展示河豚毒素(TTX)模拟抗原表位的噬菌体,并以其替代毒素建立免疫学检测方法。方法以抗TTX单克隆抗体为靶分子,从以融合蛋白形式表达在丝状噬菌体M13外壳蛋白Ⅲ表面的随机七肽库中进行生物亲和淘选,用ELISA法鉴定阳性克隆。结果通过4轮淘选,获得了7株能与抗TTX单克隆抗体特异性结合的噬菌体,采用间接竞争ELISA,筛选到3株能抑制TTX的阳性克隆。其中以4号噬菌体建立的免疫检测方法,线性范围为1～20ng/ml(TTX毒素浓度),R2=0.9947,检测下限为1ng/ml。结论从噬菌体七肽库筛选到了展示TTX模拟抗原表位的噬菌体,淘选出来的噬菌体粒子可作为毒素的替代品用于免疫学检测。     

离子色谱-荧光检测同时测定3种喹诺酮类药物

目的：建立一种离子色谱-荧光检测方法,用于同时测定3种喹诺酮类药物-诺氟沙星（Norfloxacin NOR）、环丙沙星（Ciprofloxacin CIP）和恩诺沙星（Enoxacin ENO）。方法：选用Dionex OmniPac PAX 500色谱柱,淋洗液为15 mmol/L H2SO4内含有35%（V/V）甲醇,流速1.0 ml/min,荧光检测激发波长和发射波长分别是347和420 nm。结果：在1-100μg/ml浓度范围内,各待测物线性关系良好（r〉0.9995,n=8）,NOR、CIP和ENO的检测限（信噪比S/N=3）分别是50、105、80 ng/ml,NOR和CIP片粉中加样回收率分别是103.5%和100.1%。结论：该方法准确、灵敏、快速,可用于药物制剂和食品中药物残留分析。     

麻痹性贝类毒素GTX2,3间接与直接竞争酶免疫学检测方法的比较研究

目的：初步比较麻痹性贝类毒素GTX2，3间接竞争酶免疫学检测方法（idc—ELISA）与直接竞争酶免疫学检测方法（de—ELISA）。方法：用高碘酸盐氧化法制备GTX2，3-HRP偶联物并用直接ELISA对其进行鉴定。分别用GTX2，3与葡萄糖氧化酶（GOX）的偶联物GTX2，3-GOX和兔抗小鼠IgG多抗做为包被抗原，用GTX2，3标准毒素作为抑制剂，做间接及直接竞争ELISA，确定并比较两种ELISA的特异性、灵敏度、检测限、工作范围。结果：成功制备出GTX2，3-HRP偶联物，间接和直接竞争ELISA灵敏度分别为10μg／ml和4μg／ml，检测限为6．25μg／ml和0．5μg／ml，工作范围为6—50μg／ml和0．5—50μg／ml。结论：两种竞争ELISA都能应用于麻痹性贝类毒素的快速检测，但dc—ELISA比idc—ELISA更加灵敏，更适合于进一步的研究。     

赭曲霉毒素A免疫学检测方法的研究

目的 建立敏感、特异和快速针对赭曲霉毒素A的酶联免疫吸附试验检测方法，研制具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 利用B细胞杂交瘤技术，建立能够分泌抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并获得抗赭曲霉毒素A单克隆抗体。结果 建立赭曲霉毒素A的间接竞争抑制性酶联免疫吸附试验测定方法(ELISA)。该方法的最低检出浓度为0.5ng/ml，线性范围2～500ng/ml，线性方程Y=0.272X 1.07(r=0.9978)。方法的加标回收率为79.0％～119.7％。利用该方法对北京市售的大米、小麦样品进行检测。结果表明．小麦样品的污染率为60.71％，最大值为8.26μg/kg；大米样品的污染率为17.86％，最大值为3.44μg/kg。结论 该方法简单、快速、灵敏。完全可以满足实际工作的需要。     

IgY抗菌性能评价方法的研究

目的：对IgY抗菌药物的抗菌性能进行研究，为相关评价方法的建立提供依据。方法：以细菌抗原作为包被抗原，以酶标IgG作为标记二抗进行IgY药物针对不同病原菌抗体效价的间接ELISA检测。以改良方法进行IgY药物抑菌效率的检测，并采用竞争ELISA测定其中的氯霉素残留。结果：通过间接ELISA法用一种酶标二抗同时检测了IgY针对不同细菌的抗体的效价。平板涂布法检测IgY药物快速的抑菌效果，进一步验证了其在体外的生物学活性。氯霉素残留的测定可为IgY药物质量标准及评价方法的建立提供新的思路。结论：IgY药物抗体效价、抑菌性能及抗生索残留的检测方法简单可行，为相关行业标准的建立提供了实验室依据。     

海水和贝类中软骨藻酸的酶联免疫吸附分析方法研究

目的建立间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中赤潮毒素记忆缺失性贝毒主要成分软骨藻酸(DA)。方法采用碳二亚胺法,将半抗原DA分别与载体蛋白卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)偶联,得到包被抗原和免疫抗原。以DA-BSA做为免疫抗原,免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,建立间接竞争ELISA方法分析检测海水样品和海洋贝类中的软骨藻酸。结果最低检出限为10.0ng/ml(对于贝相当于4μg/g);海水样品回收率为83.2%～124.7%,批内变异系数在4.7%～5.9%之间;贝类样品回收率为85.9%～99.9%,批内变异系数2.4%～7.1%之间。结论建立的ELISA方法检测海洋贝类中DA可以满足国际规定的安全限值。     

抗有机氯农药DDT代谢物DDA多克隆抗体的制备及其在酶联免疫检测方法的应用

目的:制备抗有机氯农药DDT代谢物DDA的多克隆抗体,从而建立DDA的ELISA检测方法,并将其初步应用于贝类样品中的DDA检测。方法:采用碳二亚胺法制备DDA-BSA完全抗原,对兔进行免疫,得到兔抗DDA多克隆抗体,并应用于建立DDA的间接酶联免疫检测方法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)。结果:成功制备抗DDA多克隆抗体,其IC50为115.30 ng/ml,最低检出限(IC20)为20.88 ng/ml,回收率为90.05%～106.38%,批内变异系数为1.25%～6.77%。结论:制备的抗DDA多克隆抗体及建立的ELISA检测方法可用于贝类样品中DDA含量的检测。     

SPR免疫传感技术检测水中阿特拉津除草剂

目的利用表面等离子体共振(SPR)生物传感技术,对水样中的三嗪类农药阿特拉津进行检测,为研发相应快检技术与设备提供技术基础。方法以抗原或抗体作为传感器敏感识别元件,利用间接竞争法结合SPR传感技术对阿特拉津进行检测。结果方法最低检出限2.34 ng/ml(S/N=3),IC50=32.36 ng/ml,检测范围5.75~181.97 ng/ml,检测时间<30 min,回收率98.4%~104.2%,相对标准偏差1.9%。结论所建立方法对于检测水样中阿特拉津具灵敏性、准确性和精密性。     

酶联免疫吸附法分析法检测中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白方法学的建立及临床应用评价

目的建立ELISA分析检测NGAL的方法并应用于临床。方法采用ELISA免疫分析及双抗体夹心法,对检测体系的标准曲线、最低检测量、稳定性、精密度、回收率、干扰实验等相关性能指标进行评价,通过检测健康体检人员及临床急性肾损伤患者尿液标本并与目前应用于临床的较成熟的ELISA方法进行比对,评价ELISA方法的临床应用可行性。结果该方法检测NGAL的标准曲线为y=4.720 8x-0.404 9,线性范围为0.0 ng/ml~40.0 ng/ml,相关系数(r)为0.999 4,最低检测限为0.729 ng/ml。批内、批间精密度均10%。该方法的正常参考值为11.04 ng/ml,ROC曲线的AUC为0.995,敏感度为91.88%,特异度为85.71%,准确度为90.95%,阳性预示值为97.31%,阴性预示值为65.22%。该方法与化学发光法呈正相关(r=0.993)。结论 ELISA免疫分析法检测NGAL符合临床诊断的相关要求,可应用于临床急性肾功能损伤患者的诊断及疾病监测。     

酶联免疫吸附法测定儿童血清中双酚A含量

目的应用抗双酚A单克隆抗体3H1,建立了间接竞争酶免疫吸附法(ELISA)检测血清中双酚A(BPA)浓度。方法按照间接竞争酶联免疫吸附法,2014年选取江西省南昌地区儿童人群作为研究对象,测定其血清中BPA浓度水平。结果该ELISA方法的检测限为0.43 ng/m L,血清的加标回收率为70.1%~87.8%,变异系数为4.79%~9.41%。176份血清样品中,95份可检出BPA,检出率为54%。全部样品的BPA的浓度范围为未检出(N.D.)至26.48 ng/m L。男童检出率高于女童,检出率在不同年龄组间差异不明显(P=0.195)。结论建立的ELISA方法能够满足检测儿童人群血清中BPA的要求。江西南昌地区儿童人群中血清中存在BPA污染,个别污染水平相对较高,需关注其来源。     

总黄曲霉毒素ELISA定量检测试剂盒研制

目的研究并建立敏感、特异和快速的针对食品中总黄曲霉毒素的ELISA检测方法,形成具有我国自主知识产权的快速定量检测试剂盒。方法在生产抗总黄曲霉毒素单克隆抗体基础上,利用间接竞争ELISA方法,研制出食品中总黄曲霉毒素快速检测试剂盒,并对试剂盒的各项技术参数进行测定。结果该试剂盒对黄曲霉毒素B G标准品的最低检出浓度为0.26 ng/ml,标准曲线的线性范围为0.26-20.00 ng/ml,线性方程y=-0.4463x 0.3532(R2=0.9915);对黄曲霉毒素B G50%的抑制浓度为2.08 ng/ml;试剂盒的条内变异系数为4.18%,条间变异系数为5.21%,抗体亲和力常数为1.52×10-10mol/L;对玉米3个加标水平的平均回收率分别为98.63%,94.56%和1 12.05%;对花生的3个加标水平的平均回收率分别为88.66%,87.50%和85.60%。试剂盒37℃可放置96 h以上;试剂盒对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的交叉反应率分别为100%,57.5%,104%和19%,与其他真菌毒素无交叉反应。结论研制出的ELIS试剂盒能定量检测食品中总黄曲霉毒素。     

环丙沙星免疫抗原的合成与鉴定

目的:合成和鉴定环丙沙星免疫抗原。方法:通过N-羟基琥珀酰亚胺活化酯法偶联免疫抗原。结果:经紫外光谱分析CIP-BSA偶联比(CIP:BSA)为6:1,紫外光谱峰形发生变化并位移。间接酶联免疫法分析证明其免疫兔所获得的抗体与环丙沙星有良好的特异性,半数抑制浓度为38 ng/ml。结论:成功合成了环丙沙星人工抗原,并获得了抗环丙沙星抗体,为ELISA或TRFIA等免疫方法的进一步研究提供了试验基础。     

对硫磷完全抗原的合成鉴定及其免疫效果

目的 合成免疫原性较强的人工抗原,为制备对硫磷单克隆抗体和建立免疫快速检测食品中农药残留方法奠定基础.方法 选用2种方法合成羧基化对硫磷:一种以对硫磷为原料,改造硝基一端;另一种以三氯硫磷为原料,改造磷硫键一端.EDC法偶联牛血清白蛋白(BSA)制备免疫原(PA-1-BSA和PA-2-BSA),并分别免疫Balb/c小鼠.间接ELISA测定抗血清效价,竞争ELISA测定检测灵敏度,比较免疫效果.结果 SDS-PAGE电泳表明,2种完全抗原均合成成功;质谱法鉴定免疫原的偶联比分别为:N(PA-1/BSA)=7.2,N(PA-2/BSA)=15.4;小鼠抗血清经间接ELISA检测表明,PA-2-BSA组效价明显高于PA-1-BSA组;间接竞争ELISA检测表明,PA-2-BSA组半数抑制浓度(IC50)为1μg/ml,明显优于PA-1-BSA组(IC50为＞100 μg/ml).结论 成功合成2种对硫磷完全抗原,免疫Balb/c小鼠PA-2-BSA组免疫应答效果好于PA-1-BSA组、     

水体中苯并芘检测试剂盒研制及效果评价

目的研制间接竞争酶联免疫吸附法(ELISA)检测苯并芘试剂盒。方法采用棋盘滴定法确定抗原抗体的最佳用量;采用间接ELISA分析法确定苯并芘检测的最适条件,包括p H值、盐离子浓度及甲醇浓度。结果抗原最佳包被浓度为10μg/m L,单克隆抗体稀释倍数为1:5 000;在最优p H值为7.4、盐离子浓度为0.01 mol/L及甲醇浓度为10%的条件下,检测方法在5~50 ng/m L范围内线性相关,线性方程为y=-28.105 Ln(x)+123.66,R2=0.9937,IC50为13.74 ng/m L,苯并芘的最低检出限为3.3 ng/m L;在水样中的加标回收率为94.8%~112.3%;变异系数为4.38%~9.72%。结论该方法适用于水体中苯并芘的检测,可用于大批量样品的快速筛查。