新基因pp3774的亚细胞定位以及在肝癌细胞系和组织中的表达谱研究

目的探讨新基因pp3774在肝癌细胞系、人肝癌及癌旁肝、肝硬化以及正常肝组织中的表达差异及其生物学功能.方法脂质体转染-荧光观察pp3774-GFP融合蛋白的亚细胞定位;合成新基因pp3774特异性多肽,制备兔源性多克隆抗体;用RT-PCR、蛋白印迹、免疫细胞化学及免疫组化方法检测pp3774基因在7个肝癌细胞系及214例肝细胞癌、18例肝硬化及10例正常肝组织中的表达差异.流式细胞术检测转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡率.结果 pp3774蛋白主要定位于细胞质(内质网为主);RT-PCR检测结果表明pp3774 mRNA在肝癌细胞系BEL-7402、Huh-7、MHCC-97L及HepG2中高表达,SMMC-7721、MHCC-LM3及人永生化肝细胞系L-02中度表达,而在Hep3B中低表达;肝癌及癌旁组织中pp3774 mRNA的表达表现为癌旁高于癌(P<0.05);免疫组化结果显示pp3774蛋白表达程度依次为正常肝≥肝硬化≥癌旁肝组织>肝癌.转染pp3774基因的SMMC-7721细胞的凋亡发生率高于对照组约10%.结论 pp3774基因是一个具有抑制肝癌细胞生长功能的新基因.     

肝细胞癌差异表达基因P-02反义寡核苷酸抑瘤作用的体外实验研究

目的：通过全硫代修饰的肝细胞癌差异表达基因P-02反义寡核苷酸对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖活性的影响，探讨P-02基因的功能。方法：以脂质体为载体，采用MTT法、RT-PCR、流式细胞术检测P-02 AS-ODN(antisense oligonucleotide)对SMMC-7721细胞生长、增殖、细胞周期的作用。结果：脂质体介导的P-02基因反义寡核苷酸可抑制SMMC-7721增殖，RT-PCR结果显示P-02基因的扩增条带明显减弱，流式细胞术显示G1期细胞增多，M期及S期细胞数减少。结论：脂质体介导的AS-ODN可抑制SMMC-7721的恶性表型，证实P-02基因在肝细胞癌的发生发展中可能有重要作用。     

人肝癌相关基因ANGPTL4的克隆及鉴定

目的获取人肝癌相关基因血管生成素样4（angiopoietin-like4，ANGPTL4）cDNA克隆，构建重组逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4，为进一步相关研究打下基础。方法以人肝细胞株HL-7702的总RNA为模板，用RT-PCR方法体外扩增出人肝癌相关基因ANGPTL4 cDNA，将其亚克隆至逆转录病毒载体pMSCV，测序鉴定。结果所克隆的ANGPTL4基因cDNA与文献报道的ANGPTL4基因完整编码区cDNA一致，成功构建重组逆转录病毒载体pMSCV-ANGPTL4。结论从人肝细胞株HL-7702中可以稳定克隆出ANGPTL4基因cDNA，成功将ANGPTL4 cDNA亚克隆至逆转录病毒载体pMSCV。     

TC21/R-Ras 2在肝癌中的表达、亚细胞定位及意义

目的:探讨TC21基因在肝癌细胞、肝癌及癌旁组织中的表达、亚细胞定位及意义。方法:用RT-PCR检测TC 21在肝癌细胞系及人肝癌及癌旁组织中mRNA水平的表达,用免疫组化及Western印迹检测TC21蛋白在肝癌相关组织中的表达差异,用组织芯片技术结合免疫组化检测TC21蛋白的亚细胞定位。结果:RT-PCR检测结果表明TC21 mRNA在SMMC-7721、BEL-7402、Huh-7、Hep3B、HepG2、MHCC-97L、MHCC-LM3 7个肝癌细胞系及L-02和Chang liver 2株永生化人肝细胞系、7对肝癌及对应癌旁肝组织中均有较高表达;Western印迹结果表明上述细胞系中TC21蛋白表达与mRNA表达一致,TC21在4对肝癌及癌旁组织中均呈较高水平的表达;免疫组化检测结果表明TC21在人原发性肝癌、癌旁组织、硬化肝组织与正常肝组织中的表达阳性率分别为84.2%、77.2%、41.7%、0%,肝癌与肝硬化、正常肝相比显著高表达(P<0.05,P<0.01),与癌旁组织比无统计学意义(P>0.05);统计学分析结果表明TC21蛋白表达与肿瘤大小呈正相关(P<0.05),与是否肝硬化呈负相关(P<0.05);肝癌组织中TC21主要定位于肝癌细胞核,部分定位于胞质,膜定位不明显,TC21蛋白在肝癌细胞中的核定位显著高于癌旁肝细胞(P<0.001)。结论:本研究首次揭示TC21蛋白在肝癌组织中的高表达及核定位预示其在肝细胞恶性转化及肝癌发生发展中发挥重要作用。     

肝癌相关新基因HC6的全长cDNA克隆及分析

目的：染色体17p13.3区域内多态性位点D17S926是肝细胞肝癌（HCC）杂合性缺失热点,PAC579克隆含有D17S926位点,本实验目的在于从PAC579克隆中寻找与肝癌相关的表达序列（ESTs),对有意义的EST片段克隆其全长cDNA。方法：根据PAC579克隆中现有的9个代表新基因的 EST序列设计引物,对正常人肝cDNA文库作多聚酶链式反应（PCR）扩增检测,确定在肝组织中表达的EST,然后采用Southern杂交检测肝组织中表达的EST在27对肝癌和癌旁标本中杂合性生缺失（LOH）频率,选择缺失频率最高的EST克隆其全长cDNA,Nothern杂交验证后测序并作进一步分析。结果：PAC579现有9个代表新基因的EST中有3个在肝组织中表达,其中EST6有肝癌中LOH频率高达54．6％（6／11）,通过PACE－PCR方法,得到约1．8kb全长cDNA克隆,与Northern杂交结果一致,结构及同源性分析显示该基因是一新基因,编码一个包含134个氨基酸,分子量约为14．7kD的蛋白质,另外发现碱基序列313－592属于ALu同源序列,重新命名为肝癌相关基因6（HC6）。结论：通过定位克隆方法从肝癌杂合性缺失热点得到一个新基因HC6,该基因与肝癌的关系有待进一步研究。     

生物节律相关基因 Cry1与肝癌的相关性探讨

目的研究生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展的相关性.方法逆转录PCR、Northern blot和免疫组织化学方法检测Cry1在各种肿瘤细胞系、人正常组织及人肝癌与配对的癌旁组织中的表达.构建Cry1重组的真核表达质粒并转染肝癌细胞SMMC-7721.生长曲线和软琼脂克隆形成试验检测Cry1过表达的SMMC-7721细胞的体外增殖速度.逆转录PCR检测与Cry1相互作用的生物节律基因在Cry1过表达的SMMC-7721中的表达.结果Cry1在人各种正常组织中均有不同程度的表达.Cry1在人肝癌癌旁组织中的表达水平高于癌组织中的表达.过表达Cry1对SMMC-7721细胞的体外增殖没有明显影响.结论生物节律相关基因Cry1与肝癌发生发展可能有一定的相关性.     

肝癌细胞 67kDa层粘连蛋白受体的表达

背景与目的:本实验室最近发现人肝癌细胞 SMMC-7721表达的 67kDa层粘连蛋白受体( 67kDa Laminin receptor,67LR)与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞 L-02表达的 67LR,而 67LR在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达水平尚不清楚.本研究旨在探讨 67LR在肝癌细胞中的表达,及其与层粘连蛋白结合能力的关系.方法:以人肝癌细胞 SMMC-7721、 HepG2和正常肝细胞 L-02为材料,采用 131I标记的层粘连蛋白测定其与细胞的结合能力;采用流式细胞术和 RT-PCR分析 67LR蛋白和 mRNA的表达水平. 结果: (1)相同条件下 SMMC-7721、 HepG2 细胞与层粘连蛋白特异结合量分别为 (17.54± 0.49) ng/105 cell、 (11.18± 0.53) ng/105 cell,而 L-02细胞的特异结合量为 (8.36± 0.48) ng/105 cell,表明肝癌细胞与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞( P< 0.01) ;(2)流式细胞术分析, SMMC-7721细胞的 67LR阳性表达率为 34.7%, L-02细胞的 67LR阳性表达率为 55.3%,而 HepG2 细胞则几乎不表达 67LR; (3)RT-PCR产物进行半定量分析发现,两株肝癌细胞的 67LR mRNA表达水平明显高于 L-02细胞.结论:肝癌细胞与层粘连蛋白的结合能力明显高于正常肝细胞 L-02,而细胞膜表面的 67LR水平却低于 L-02细胞,提示 SMMC-7721细胞 67LR的亲和力可能高于 L-02细胞,而且还涉及其它层粘连蛋白受体.     

hAph2β和c-abl在肝细胞癌中的表达及其相互作用

目的:探讨hAph2β蛋白与c-abl蛋白在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的相互作用.方法:RT-PCR和Western 印迹法分析c-abl基因和hAph2基因在肝癌细胞株及永生化人肝细胞株中的表达.脂质体转染、免疫共沉淀和Western印迹法检测hAph2β与c-abl在SMMC-7721细胞中的相互作用.激光共聚焦-荧光显微镜观察hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中的定位.用组织芯片结合免疫组织化学法检测hAph2β和c-abl蛋白在肝癌和相应癌旁组织中的表达差异,统计学分析其表达差异的临床意义.结果:RT-PCR检测结果表明,c-abl mRNA在HepG2、L-02及MHCC-LM3细胞中高表达,在SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B和Chang's liver细胞中中度表达,而在Huh-7、MHCC-97L细胞中低表达.Western印迹法检测结果发现,hAph2总蛋白在HepG2、Huh-7、MHCC-LM3和MHCC-97L细胞中高表达,在BEL-7402、L-02细胞中低表达;c-abl蛋白在Huh-7细胞中低表达.免疫共沉淀观察发现SMMC-7721细胞中过表达的hAph2β-GFP和内源性c-abl相互作用.荧光免疫细胞化学检测发现hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中部分共定位.免疫组织化学检测结果表明,hAph2β/c-abl蛋白在人正常肝组织、硬化肝组织、癌旁肝及原发性HCC癌组织中的强阳性率分别为:100%/50%、91.7%/100%、100%/89.5%和50.9%/19.3%,其中hAph2β和c-abl在癌旁肝组织中的表达均明显高于肝癌组织(均P<0.001),2者在56.1%(32/57)的肝癌组织中同时高或低表达.结论:hAph2β和c-abl在SMMC-7721细胞中相互作用,在原发性HCC及相关组织中共表达.     

人TNFα真核表达载体的构建及其在人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM中的稳定表达

目的：构建可在真核细胞内表达人肿瘤坏死因子alpha （hTNF-α） 基因的真核表达载体,建立稳定表达hTNF-α基因的细胞模型.方法： 应用RT-PCR 的方法从分离的正常人外周血单核细胞（LPS刺激）中,扩增出hTNF-αcDNA ,连接至载体pMD18-T vector中,经酶切鉴定与序列测定证实;以亚克隆法构建于真核表达载体pBK-CMV的相应酶切位点, 转化至大肠埃希菌DH5α,最后将表达的pBK-hTNFα重组蛋白行SDS-PAGE电泳,并作考马斯亮蓝染色分析,Western blot鉴定;经脂质体Lipofectamine2000转染HepG2/ADM细胞后,经G418筛选,通过ELISA、RT-PCR方法检测其在体外转染肝癌耐药细胞HepG2/ADM后hTNFα基因和蛋白的表达.结果：自正常人外周血单核细胞中克隆的hTNF-αcDNA 成功连接到pMD18-T vector,用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切、经序列测定证实,与Genbank的序列完全一致;pBK-hTNFα的克隆表达重组蛋白经Western blot证实此蛋白为hTNFα.克隆基因正确插入载体pBK-CMV中.pBK-hTNFα经脂质体介导转染肝癌耐药细胞后, ELISA、RT-PCR方法检测到其在转染细胞中稳定表达.结论：通过DNA重组技术成功地构建了可在体外稳定表达hTNF-αcDNA 全长的真核表达载体pBK-hTNFα.     

人胃印戒细胞癌组织差异表达基因克隆的研究

目的：分离胃印戒细胞癌组织差异表达基因。探讨人胃印戒细胞癌发生的分子机制。方法：采用抑制性消减杂交技术(SSH)．构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库；随机挑选部分阳性克隆测序，与GenBank中的已知序列进行基因同源性分析，并进一步探讨基因功能。结果：成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，并分离出多个差异表达基因片段：其中1条与染色体序列相似，可能代表未知的新基因序列，已被GenBank接收(注册号：CN446913)；其他多为已知的肿瘤相关基因的部分片段。结论：1)SSH技术是分离差异表达基因的有效方法；2)胃印戒细胞癌的发生发展与多种基因表达异常有关。     

ASSOCIATION OF DIFFERENTIALLY EXPRESSED cDNA FRAGMENT OF FGG WITH HEPATOCELLULAR CARCINOMA

Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most frequent human malignancies in many countries and areas of Asia and Africa. The annual number of deaths from primary liver cancer is about 110,000 in China, 45% of global total mortality, and HCC is up to 95% of all cases. Although the genetic basis of hepatocarcinogenesis is still poorly understood so far, it is becoming gradually evident that significant changes in gene expression occur during the course of HCC development. For better u…     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体诱导肝癌细胞凋亡的研究

方法 采用原位杂交方法检测肝癌组织、肝癌细胞株以及正常肝组织中TRAILR的表达。采用不同浓度TRAIL蛋白处理肝癌细胞株Hep2和SMMC7721,应用流式细胞仪和原位末端标记,观察经药物处理前后该细胞株的凋亡发生率。结果 60例肝癌组织及20例正常肝组织均表达死亡受体DR5和DR4,但肝癌组织DR表达量显著强于正常肝组织。54例(90．0％)肝癌组织不表达诱捕受体DcR1,25例(41．7％)肝癌组织不表达DcR2,而20例正常肝组织均表达DcR。肝癌组织中DR的高表达及DcR的低表达,不同于正常肝组织中DR的低表达及DcR的高表达,两者间差异有显著性。两种肝癌细胞株中均可检测到DR5、DR4、DcR2的表达,但DcR1表达缺失。肝癌组织中DR的表达与肿瘤的分化、肿瘤分期有关,低分化的肿瘤DR表达减少(P＜0．01),Ⅲ、Ⅳ期肿瘤DR表达显著低于I、Ⅱ期(P＜0．05)。DR表达与患者的性别、年龄、HBsAg阳性与否、AFP水平、肿瘤大小以及是否转移无关。经TRAIL(100ng/ml)处理24h,肝癌细胞凋亡发生率约10％,而Jurkat细胞凋亡率达70％以上,胆管癌细胞QBC939凋亡发生率约50％。结论 肝细胞肝癌普遍存在TRAILR的表达,并存在受体类型的表达差异。但单一的TRAIL治疗只能有限的诱导肝癌细胞HepG2、SMMC7721发生凋亡,HCC对TRAIL诱导的凋亡存在耐药现象。     

miR-223-3p 通过靶向RAC1 调控肝细胞癌SMMC-7721 细胞的增殖和凋亡

目的：探讨miR-223-3p 通过调控Ras 相关C3 肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，RAC1）对肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞增殖和凋亡的影响及其可能的作用机制。方法：选用2016 年8 月至2018 年8 月吉林市中心医院手术切除的30 例HCC 组织及其癌旁组织标本和人HCC 细胞系SMMC-7721、Bel-7402、HepG2 及人正常肝细胞QSG-7701，用qPCR检测HCC组织和细胞系中miR-223-3p的表达水平。分别将miR-223-3p mimics、miR-223-3p inhibitor 和siRAC1转染至SMMC-7721 细胞，通过CCK-8、克隆形成实验和Annexin V-FITC/PI 染色流式细胞术检测SMMC-7721 细胞的增殖、克隆形成和凋亡水平。用双荧光素酶报告基因实验检测miR-223-3p 与RAC1 的靶向关系，Western blotting 检测细胞中RAC1 蛋白的表达水平。结果：miR-223-3p 在HCC组织的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.01），其表达水平与肿瘤大小、TNM分期及肿瘤分化病理特征相关（P<0.05 或P<0.01）；miR-223-3p 在HCC细胞系表达水平显著低于QSG-7701 细胞（均P<0.01），以在SMMC-7721细胞中表达水平最低。双荧光素酶报告基因实验证实RAC1 是miR-223-3p 靶基因，miR-223-3p 靶向负调控RAC1 的表达。转染miR-223-3p mimics 显著抑制SMMC-7721 细胞的增殖和克隆形成能力（P<0.05 或P<0.01），并促进细胞凋亡（P<0.01）；转染miR-223-3p inhibtor 则逆转miR-223-3p mimics 对细胞的抑制作用。结论：过表达miR-223-3p 抑制HCC细胞增殖和克隆形成能力并促进细胞凋亡，其机制可能与靶向下调RAC1表达有关。     

肝细胞癌患者预后相关增强子RNA和对应靶基因的筛选及其预后预测 意义

目的：筛选与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）预后相关的增强子RNA（enhancer RNA,eRNA）及其对应的 靶基因,并探究其调控作用及功能。方法：通过UCSC数据库下载HCC的转录本数据和临床病例数据,提取eRNA及其预测的 相应靶基因表达矩阵,用Kaplan-Meier和Spearman相关性分析方法筛选HCC预后相关的eRNA和靶基因,并采用最小化绝对收 缩和选择算子回归分析及多因素 Cox 多元回归分析构建 HCC 预后风险评分模型。设计合成针对筛选所获关键 eRNA AP003469.2的小干扰RNA并转染肝癌 SMMC-7721 细胞,采用 RT-PCR方法验证敲减效率,qPCR 法检测 AP003469.2 靶基因 YWHAZ的表达水平,CCK-8法检测转染后SMMC-7721细胞的增殖情况。结果：筛选获得4个与预后相关基因,包括两个eRNA （AP003469.2 和 SPRY4-AS1）和 两 个 靶 基 因（PPARGC1A 和 SLC2A1）（P<0.05）,其中 PPARGC1A 高表达提示预后较好, AP003469.2、SPRY4-AS1和SLC2A1基因高表达则提示预后较差。基于4个基因构建的预后风险评分模型,第1、3和5年的AUC 分别为0.730、0.699和0.679,提示模型具备良好的预测效能。在敲减AP003469.2后,SMMC-7721细胞中YWHAZ的表达无明显 改变,且对细胞的增殖无影响。结论：基于生物信息学分析共筛选出4个关键基因,其中eRNA AP003469.2是HCC预后预测效 能较高的标志物,其无促癌功能且对YWHAZ基因无调控作用。     

下调MLLT3/AF9基因对肝癌SMMC-7721细胞增殖与侵袭能力的影响

目的 本文旨在研究组蛋白甲基转移酶MLLT3/AF9在人肝癌组织中的表达,观察体外下调MLLT3/AF9的表达对肝癌SMMC-7721细胞增殖与侵袭能力的影响。方法 应用Real-time PCR技术检测100例肝癌组织、癌旁组织和肝癌细胞系SMMC-7721、HepG2、Hu7、BEL-7402中MLLT3/AF9基因的表达水平;应用RNA干扰下调MLLT3/AF9的表达,采用CCK-8、Transwell实验和划痕实验检测MLLT3/AF9下调组和对照组SMMC-7721细胞的增殖及侵袭能力。结果 Real-time PCR检测结果显示肝癌组织中的MLLT3/AF9基因的表达量显著高于癌旁组织; Real-time PCR和Western blot检测到LVMLLT3-RNAi组中MLLT3/AF9 mRNA和蛋白的表达水平都降低,CCK-8、Transwell和划痕实验结果显示LV-MLLT3-RNAi组细胞的增殖和侵袭能力降低。结论 MLLT3/AF9在肝癌组织中表达水平明显升高,体外下调MLLT3/AF9的表达可以有效抑制肝癌SMMC-7721细胞的增殖与侵袭。     

Connexin43在肝细胞癌组织中的表达

目的 探讨缝隙连接蛋白（connexin, Cx）43在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中的表达和功能。方法 采用免疫组织化学法检测Cx43在20例正常肝脏组织及76例HCC组织中的表达及分布。采用RT-PCR和Western blot法检测正常肝细胞LO2和肝癌细胞SMMC-7721中Cx43的表达,免疫荧光法观察Cx43的分布,细胞接种荧光示踪法测定细胞缝隙连接（gap junction, GJ）功能。结果 Cx43在HCC组织中的阳性表达率较正常肝脏组织明显下调,且从细胞膜向细胞质定位的“内化”现象明显。体外实验进一步证实与LO2细胞相比,Cx43在SMMC-7721细胞上存在表达及分布的异常,并且功能性GJ明显下调。结论 Cx43蛋白数量改变及分布异常与HCC发生密切相关,Cx43有望成为治疗HCC新靶点。     

HuR基因克隆及其在肝癌细胞中的表达

目的:克隆人抗原R基因（HuR）的cDNA,构建重组真核表达载体pEGFP-HuR,并稳定转染肝癌细胞株。方法:应用逆转录聚合酶链反应技术,从肝癌细胞中扩增得到人HuR基因的cDNA序列,克隆至增强型绿色荧光蛋白表达载体中,经Xho I和EcoR I双酶切和DNA测序鉴定后,将重组真核表达载体通过脂质体法导入肝癌细胞中,利用新霉素(G418)筛选出稳定转染pEGFP-HuR的肝癌细胞株,并用Western blot技术检测HuR基因的表达。结果:Xho I和EcoR I双酶切和PCR结果证实真核表达载体pEGFP-HuR构建成功。Western blot结果显示,在稳定转染重组真核表达载体的肝癌细胞中HuR基因表达水平上调。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-HuR,并筛选获得其稳定转染后HuR表达上调的肝癌细胞株,作为进一步研究HuR基因生物学功能的前期工作。     

重组腺病毒介导突变型p27基因转移对肝癌细胞SMMC-7721生长的影响

 目的 探讨突变型p27基因（p27mt）对肝癌细胞SMMC-7721的细胞增生和凋亡的调节作用。方法 利用重组体腺病毒Ad-p27mt转染培养的人肝癌细胞SMMC-7721，用3H -TdR掺入法检测细胞增生；流式细胞术、DNA片段分析法、TUNEL法检测细胞凋亡。结果 重组体腺病毒Ad-p27mt在MOI≥ 50时， 可达到100 %的转导效率。Ad-p27mt转染肝癌细胞后，3H -TdR掺入检测发现细胞增生抑制；流式细胞术检测在G1期前出现亚二倍体凋亡峰；细胞DNA抽提电泳后发现凋亡特征性梯带。Ad-p27mt组及空白对照组TUNEL法检测凋亡指数分别为58.6±4.3及4.5±1.6，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 重组腺病毒介导的p27mt基因转移可抑制肝癌SMMC-7721细胞增生并诱导其凋亡。