小檗胺对人慢性粒细胞白血病细胞发生凋亡的诱导机制研究

目的 研究新型p210 bcr/abl抑制剂小檗胺诱导人慢性粒细胞白血病细胞凋亡分子的机制.方法 培养表达内源性p210 bcr/abl蛋白的Ph＋人慢性粒细胞白血病细胞系K562,用小檗胺按指定时间和剂量干预细胞.应用膜联蛋白荧光素（Annexin-V-Fluos）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）试剂盒和流式细胞术定量分析凋亡细胞百分比;用cytoperm/cytofix和天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白水解酶-3-McAb-PE定量检测含活化天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）细胞百分比;以免疫共沉淀技术（c-abl抗体）和Western印迹[p-Tyr（pY99）抗体]定量分析p210 bcr/abl蛋白磷酸化;p210 bcr/abl蛋白总量直接用Western印迹（c-abl抗体）检测;Hsp90和Hsp70等分子伴侣蛋白水平的变化用Western印迹（Hsp90和Hsp70抗体）.结果 48 h IC50浓度小檗胺（8μg/ml）作用48 h后,45.69% K562白血病细胞表达活化的Caspase-3凋亡分子和48.43%白血病细胞发生凋亡.免疫印迹和免疫共沉淀结果显示,低剂量小檗胺可明显抑制白血病细胞内p210 bcr/abl磷酸化：8μg/ml浓度小檗胺处理6 h后,白血病细胞磷酸化p210 bcr/abl蛋白含量仅为对照组的8.41%,而p210 bcr/abl蛋白总量并无变化.小檗胺还能直接下调p210 bcr/abl分子伴侣Hsp90蛋白水平：白血病细胞经8μg/ml浓度小檗胺处理24h时的Hsp90水平只有对照组的18.37%,而且对能诱导白血病细胞产生凋亡抵抗的Hsp70蛋白水平影响不明显.结论 （1）小檗胺是一种新型p210 bcr/abl蛋白磷酸化抑制剂,能通过抑制p210 bcr/abl蛋白磷酸化和诱导Caspase-3通路介导的Ph＋白血病细胞发生凋亡;（2）与已知Hsp90抑制剂格尔德霉素（GA）不同,小檗胺能直接下调Hsp90蛋白水平,而对与肿瘤细胞凋亡抵抗有关的Hsp70蛋白表达影响不大,这提示小檗胺可能还是一种新型蛋白分子伴侣Hsp90抑制剂,值得进一步研究.     

bcr/abl基因在慢性粒细胞性白血病中的发病作用及bcr/abl反义基因治疗

慢性粒细胞性白血病(CML)最有效治疗手段为骨髓移植(BMT)。但异体BMT供髓者缺乏，且有发生移植物抗宿主病的危险。自体BMT常因骨髓净化不彻底导致复发。所以探讨CML细胞生物学行为改变的原因，是探索CML病因进而力争治愈CML的关键。 　　1　bcr/abl表达产物及功能 　　90%以上CML患者骨髓全部造血细胞内出现Ph1染色体，由位于9号染色体q34.11的c-abl基因与位于22号染色体q11.21的c-sis基因相互易位，形成t(9;22)(q34.11;q11.21)所致。22号染色体上断裂点集中在约5 800 bp的区域内，称M-bcr。CML中bcr/abl融合方式有2种：bcr第3及第2外显子分别与abl第2外显子融合成b3a2及b2a2型，二者差75 bp，均表达210 000的蛋白，即p210bcr/abl (p210)。此外还有bla2型(p185)，主要见于ALL。     

bcr/abl融合基因在慢性粒细胞白血病中的表达及临床意义

目的 探讨bcr/abl融合基因的表达在慢性粒细胞白血病(CML)中的诊断、疗效及预后观察中的意义.方法 采用荧光定量逆转录多聚酶链反应(FQ -PCR)技术,对8例复治CML患者和作为对照组的2例急性非淋巴细胞性白血病患者的骨髓或外周血进行bcr/abl融合基因检测;同时比较患者的血象、骨髓象等相关实验室指标.结果 CML中7例慢性期(CP)和1例急变期(BC)患者,均不同程度地表达了bcr/abl融合基因,而对照组该融合基因的表达为阴性.结论 bcr/abl基因是CML发病的分子基础,定量检测bcr/abl融合基因对于CML的诊断、临床分型、疗效观察及预后判断有重要意义.     

干扰素α-2b治疗慢性粒细胞性白血病的前瞻性随机对照研究

目的比较高、低剂量干扰素(IFN)α2b治疗慢性粒细胞性白血病(CML)的效果。方法建立检测融合基因bcr abl的荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RQ PCR)方法,观察治疗后融合基因表达水平的变化。选择30例临床初诊的CML患者随机分为两组,先服用羟基脲控制外周血白细胞达20×109/L以下,然后分别给予IFNα2b300万IU隔日皮下注射(3MIU组)和500万IU每周6次(5MIU组)皮下注射,治疗3～6个月,每月抽取骨髓标本,检测融合基因bcr abl的表达情况。结果RQ PCR的灵敏度达50拷贝bcr abl;分别取1×103拷贝/μl和1×107拷贝/μlbcr abl质粒,以及1例CML患者的cDNA同时作8管平行扩增bcr abl融合基因,批内变异系数分别为2.35%、1.48%和1.17%,不同批次之间以K562细胞cDNA作重复性分析,批间变异系数为5.13%;CML初诊患者bcr abl/GAPDH水平介于0.010～5.799,中位值为0.098;治疗3个月后3MIU组和5MIU组患者骨髓bcr abl水平平均下降19%和24%,两组比较差异无统计学意义(P=0.398),但是3MIU组副作用相对较小。结论RQ PCR监测融合基因bcr abl表达可以有效观察CML患者使用IFN的治疗效果;不同CML患者白血病细胞的bcr abl表达水平有较大差异;隔日3MIUIFN皮下注射治疗即可有效抑制CML白血病细胞的增殖,且副作用较小。     

慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因的表达

目的：研究慢性粒细胞性白血病患者bcr／abl融合基因阳性率及其临床意义。方法：取慢性粒细胞性白血病(CML)患者骨髓或外周血，提取单核细胞的总RNA，用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，观察其ber／abl基因的表达。结果：9例CML患者中，8例ber／abl基因阳性，占88.9％。结论：bcr／abl基因检测可以用来辅助CML的临床诊断。     

应用实时定量PCR技术检测慢性粒细胞白血病患者p210~(bcr/abl)转录本的临床意义

目的 :研究 p2 1 0 bcr/abl融合基因转录本在慢性粒细胞白血病 ( CML)不同病程阶段的表达水平及其在病情进展中的意义。方法 :应用实时定量PCR( RQ- PCR)技术检测 68例CML患者骨髓单个核细胞中的 p2 1 0 bcr/abl转录本 ,并将其含量以看家基因 ABL表达量进行标化。结果 :本组中 p2 1 0 bcr/abl转录本绝对含量为 4.0 1× 1 0 2～ 8.90× 1 0 5拷贝 /5 0 ng(中位 1 .0 7× 1 0 5拷贝 /5 0 ng) ,ABL纠正后的相对含量为 0 .0 1～ 48.67(中位 5 .0 3)。加速期和急变期患者的p2 1 0 bcr/abl转录本水平较慢性期患者明显增高 (中位含量分别为 9.0 4、7.36和 3.5 3) ;干扰素治疗无效者较慢性期患者的 p2 1 0 bcr/abl水平则明显增高。结论 :p2 1 0 bcr/abl转录本过度表达可能与 CML病情进展相关 ,RQ- PCR可用于对 CML的病情监测。     

白血病患者融合基因检测

目的 测白血病患者融合基因水平,评估实时定量RT-PCR技术在辅助白血病临床诊断和药物疗效判定方面的价值.方法 30例慢性粒细胞白血病(CML)患者,15例急性早幼粒细胞白血病(APL)患者,实时定量RT-PCR技术检测骨髓或外周血单个核细胞中白血病融合基因M-bcr/abl或PML/RARα的表达,结合临床资料进行分析.结果 1)30例CML患者的 bcr/abl融合基因检测阳性率为93.3%(28/30);检测15例APL患者的PML/RARα融合基因检测阳性率为96.7%(13/15).2)3例CML患者应用甲磺酸-伊马替尼治疗后定量检测bcr/abl 融合基因的拷贝数较治疗前明显降低或转阴(2/3).15例APL患者融合基因检测阳性经亚砷酸+化疗治疗后PML/RARα融合基因的拷贝数较治疗前明显降低或转阴(7/15).结论 实时定量RT- PCR 技术操作简便,检测白血病融合基因的准确性高,在辅助临床诊断和白血病患者药物疗效判定方面都有较大的应用价值.     

慢性粒细胞性白血病染色体畸变及其基因治疗的研究进展

慢性粒细胞性白血病(CML)起源于骨髓多能干细胞的恶性增殖,90%-95%的患者费城染色体阳性,并且检测到bcr/abl嵌合基因.bcr/abl编码的蛋白能抑制细胞凋亡,使白血病细胞过度增殖,在CML的发生、发展过程中起重要的作用.基因治疗(Genetherapy)指在基因水平上的治疗,通过基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活等手段以纠正或补偿致病基因所产生的缺陷,从而达到治疗疾病的目的 .本文综述近年来有关慢性粒细胞性白血病费城染色体嵌合基因bcr/abl及基因治疗的的研究报道,试图揭示慢粒的发生,发展与费城染色体及其嵌合基因bcr/abl之间的相关性,为找寻慢粒白血病基因治疗方法 提供一定的线索.     

ES探针荧光原位杂交法检测bcr/abl融合基因

目的探讨应用ES型bcr/abl探针(双色单融合)荧光原位杂交技术(FISH)在检测bcr/abl融合基因中的价值。方法慢性髓细胞性白血病(CML)初诊或复诊患者30例(骨髓标本43份),行普通染色体核型分析和ES型bcr/abl探针荧光原位杂交分析。结果 43份骨髓标本,6份未做骨髓培养,6份培养失败,在其余31份培养成功的标本中,找到Ph1染色体9份,另有1份标本多次检查都发现存在21p+染色体异常;43份骨髓都经FISH检测,13份标本发现bcr/abl融合基因。结论 ES型bcr/abl探针对CML初诊病例的bcr/abl融合基因有较高的检出率;对复发病例,不仅能辅助诊断CML,而且在监测白血病微小残留病灶、判断疾病的进展上均有较高的灵敏度。     

慢性粒细胞白血病骨髓细胞体外培养净化作用实验研究

目的 :采用 FISH方法直接在干细胞水平对慢性粒细胞白血病 (CML )患者自体骨髓体外培养前后的间期细胞进行 bcr/abl融合基因检测 ,从而探讨 CML 骨髓细胞体外培养对自体骨髓移植物的净化作用。方法 :分离初治的慢性期 Ph+ CML 7例骨髓单个核细胞 (MNCs) ,体外培养 10 d,用免疫磁珠 (MACS)富集培养前后的 CD34+ 细胞 ,通过流式细胞仪检测培养前后 MNCs中 CD34+ 干细胞比例 ,然后用 FISH方法检测其中 bcr/abl融合基因 ,同时分别用正常人细胞及 K5 6 2细胞株作阴性及阳性对照。结果 :(1) 7例患者骨髓细胞培养前后 CD34+ 细胞中 bcr/abl融合基因平均检出率分别为 85 .3%± 4 .9%和 78%± 5 .1% ,有统计学意义 (P<0 .0 5 ) ,(2 )培养前培养体系中 CD34+ 细胞数量为 (6 .0 6 0± 1.5 6 4 )× 10 5个 ,培养后体系中的 CD34+细胞数量为 (5 .974± 1.4 2 4 )× 10 5个 ,两者无明显差异 (P>0 .0 5 )。 (3)在对照组中假阳性率为 2 .5 % ,假阴性率为 2 %。结论 :自体骨髓细胞体外培养对 CML 病人的骨髓肿瘤细胞有一定程度的净化作用 ;FISH技术直接在干细胞水平检测 bcr/abl融合基因 ,且能定量分析 ,较传统方法更适合对骨髓净化进行评价 ,为骨髓净化提供了一种更方便、可靠的评定方法     

STI571、三氧化二砷和Velcade对bcr/abl+-CD34+细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究STI571、三氧化二砷(As2O3)和Velcade在单独及联合应用时对bcr/abl -CD34 细胞增殖、凋亡的影响.方法 提取慢性粒细胞白血病患者骨髓的bcr/abl -CD34 细胞,用STI571、As2O3、Velcade单独及联合处理96 h,通过CCK-8分析及流式细胞术分别检测细胞增殖、凋亡的变化,并用Hoechst33342染色及荧光显微镜技术观察凋亡细胞形态学改变.同时检测上述方案对正常骨髓CD34 细胞的抑制作用.结果 STI571、As2O3及Velcade对bcr/abl -CD34 细胞的作用呈剂量依赖性,其中在低浓度时以抑制增殖作用为主,促凋亡作用不明显.当0.25～2 μmol/L STI571分别与2.5 μmol/LAs2O3及15nmol/L Velcade联合后,抑制率和凋亡率均显著提高,呈相加或协同作用,且对正常CD34 细胞的抑制作用无进一步增强.结论 As2O3及Velcade与STI571联合能够增强对BCR/ABL -CD34 细胞的作用,具有一定临床意义.     

姜黄素与 STI571对慢性粒细胞白血病细胞株K562作用的体外研究

目的 研究姜黄素（Cur）、STI571以及二者联合应用对慢性粒细胞白血病细胞株K562的影响,探索两药的不同效果及联合应用机制.方法 锥虫蓝排染法计算K562细胞增殖抑制率;Western blot方法检测Cur、STI571以及二者联合应用对K562细胞P210bcr/abl蛋白含量及其下游信号蛋白激酶C（PKC）的影响;用金氏公式评价两药的协同效果.结果 Cur和STI571联合应用对K562细胞呈剂量依赖性的抑制作用,协同指数Q值均＞0.85;Western blot显示,Cur和STI571联合应用对P210bcr/abl及PKC的下调呈明显增强作用.结论 Cur与低剂量（0.1,0.15μmol/L）的STI571联合应用对抑制K562细胞增殖呈单独相加;而较大剂量则可明显协同下调P210bcr/abl和PKC的表达水平.     

bcr3/abl2和c-myb基因反义寡核苷酸联用对慢性髓细胞白血病的作用

探讨多癌基因反义寡核苷酸对慢性髓细胞白血病的作用及其相互作用的影响。方法用台盼蓝拒染,集落形成,逆转录－多聚酶链反应及流式细胞仪技术研究反义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞株和ＣＭＬ骨细胞的作用。结果ｃ－ｍｙｂ反义寡核苷酸通过促进ＣＭＬ,细胞凋亡,发挥对ｂｃｒ／ａｂｌ反义寡核苷酸的协同作用。结论多癌基因反义核酸的联合应用可为ＣＭＬ基因治疗提供一项新手段。     

STI571 combined with vincristine greatly suppressed the tumor formation of multidrug-resistant K562 cells in a human-nude mice xenograft model

Multidrug resistance (MDR), often associated with decreased intracellular drug accumulation in patient's tumor cells resulting from enhanced drug efflux,1 is a major obstacle to successful chemo- therapy in leukemia. It is related to the overexpression of a membrane protein, P- glycoprotein (P-170), thereby reducing drug cytotoxicity. For example, Philadelphia-chromo- some-positive (Ph+) chronic myelogenous leukemia (CML) is often resistant to chemotherapy in advanced phases because of the…     

双色ES探针检测慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因的应用研究

目的:探讨使用bcr/abl双色ES探针的荧光原位杂交(fluorescence in-situ hybridization,FISH)应用于慢性粒细胞白血病bcr/abl融合基因检测的意义.方法:使用荧光原位杂交方法对2005年1月至2006年2月本院收治的12例慢性粒细胞白血病患者之骨髓细胞进行检测分析.结果:12例CML均检出bcr/abl基因的存在,其中2例伴ASS基因缺失.结论:使用bcr/abl双色ES探针进行荧光原位杂交能为bcr/abl融合基因的检测提供准确直观的依据.     

bcr/abl反义寡聚脱氧核苷酸抑制慢性粒细胞白血病细胞生长的研究

目的：研究bcr/abl基因的反义寡聚脱氧核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASON）对K562细胞生长的影响。 方法：根据bcr/abl基因类型（b₃/a₂）的cDNA序列分析,以其 mRNA融合区的18个核苷酸为作用靶序列,人工合成了18聚ASON片段,同时合成18聚无义ASON片段,作为序列特异性对照。用ASON和无义ASON片段与K562细胞共同培养,同时设置空白对照组,作用一定时间后分别测定细胞动力学、³H-TdR掺入率、bcr/abl mRNA和P210蛋白的表达。 结果：3.5～30.0 μmol•L^-1的ASON对K562细胞生长有不同程度的抑制作用,ASON浓度低于10.0 μmol•L^-1 时抑制作用很小,大于10.0 μmol•L^-1时抑制作用显著,这种作用有浓度、时间依赖关系,而无义ASON与空白对照组比较差异无显著性(P<0.05)。同时发现ASON使细胞的 ³H-TdR掺入率下降, bcr/abl mRNA及P210蛋白的表达下降。结论：ASON的抑制作用是从基因水平上封闭了bcr/abl mRNA转录及P210蛋白的翻译,抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡。ASON对慢性粒细胞白血病(CML)细胞有抑制作用。     

bcr／ab1融合基因在慢性粒细胞白血病中的表达及临床意义

目的探讨bcr／ab1融合基因的表达在慢性粒细胞白血病（CML）中的诊断、疗效及预后观察中的意义。方法采用荧光定量逆转录多聚酶链反应（FQ-PCR）技术，对8例复治CML患者和作为对照组的2例急性非淋巴细胞性白血病患者的骨髓或外周血进行bcr／ab1融合基因检测；同时比较患者的血象、骨髓象等相关实验室指标。结果CML中7例慢性期（CP）和1例急变期（BC）患者，均不同程度地表达了bcr／ab1融合基因，而对照组该融合基因的表达为阴性。结论bcr／ab1基因是CML发病的分子基础，定量检测bcr／ab1融合基因对于CML的诊断、临床分型、疗效观察及预后判断有重要意义。     

Autogeneic peripheral blood hemopoietic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia with imatinib mesylate-induced negative Philadelphia chromosome]

OBJECTIVE: To study the possibility of curing chronic myeloid leukemia with autogeneic hemopoietic stem cell transplantation in patients with negative Philadelphia (Ph) chromosome induced by imatinib mesylate (STI 571) treatment. METHODS: Two patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase, who had 90% Ph chromosome-positive cells and bcr/abl fusion gene-positive cells as shown by interphase fluorescence in situ hybridization (I-FISH), failed to respond favorably to interferon-alpha therapy in the treatment courses of 7 and 8 months, respectively. Treatment with STI 571 at a daily dose of 300 to 400 mg for 5 months to 8 months was subsequently implemented, after which the Ph chromosome and bcr/abl fusion genes became normal in detection for 3 times. Peripheral blood haemopoietic stem cell mobilization was then initiated by intravenous injection of cytarabine (2.0 g/d) for 3 days, etoposide (0.2 g/d) for 3 d and cyclophosphamide (1.0 g/d) for one day. When the white blood cell was below 1.0x10(9)/L, the G-CSF (300 microg/d) was administered subcutaneously for 5 or 6 d, and the peripheral blood mononuclear cells were collected by CS3000 Plus blood cell separator. The percentage of bcr/abl fusion gene-positive cells among CD34(9) cells enriched by MiniMAC ranged from 11% to 14%. After 3 or 4 weeks, the patients received total body irradiation at 9 Gy given in 2 fractions, with intravenous injection of cyclophosphamide (60 mg/kg daily) and etoposide (300 mg/d) for 2 d. On the day of transplantation, the collected mononuclear cells were 4.17x10(8)/kg and 3.9x10(8)/kg, with CD34(+)/ cells reaching 4.89x10(6)/kg.b.w and 4.89x10(6)/kg. CsA was also used since day -1 to day +13 of the transplantation for prevention of graft-versus-host disease. G-CSF was administrated daily at the dose of 300 microg subcutaneously from day +3 to +12. RESULTS: After the transplantation, the absolute neutrophil count (ANC) took a mean of 11 d to exceed 0.5x10(9)/L in these two patients, and 19 and 21 d, respectively, were needed for the platelet count to exceed 20x10(9)/L. The two patients showed cytogenetic relapse at 120 and 300 d after the transplantation, respectively. CONCLUSION: Autogeneic peripheral blood stem cells transplantation after Ph chromosome is negative in patients with chronic myeloid leukemia, who receive STI 571 treatment, may also relapse, and more radical elimination of Ph chromosome-positive cells is needed.     

研究慢性粒细胞性白血病病理发生中下游信号传导和分子调控的干细胞模型

获得慢性粒细胞白血病人原代干祖细胞模型 ,旨在研究慢粒白血病病理发生中信号传导的分子机制。方法　转导b3a2bcr/ablcDNA到正常人CD34 细胞中构建人原代慢性粒细胞性白血病模型。采用细胞免疫组化测定了p2 10 BCR/ABL在CD34 细胞中的表达 ;细胞粘附、迁移实验进行模型鉴定 ;FACS法测定了p2 10 BCR/ABL转导及对照CD34 细胞p2 7kip和MDR 1Pgp的表达。结果　相对于对照的CD34 细胞 ,转导了bcr/abl的CD34 细胞对纤粘连蛋白 (fibronectin ,FN)的粘附性下降 ;而在FN上的迁移能力增强 ;在低浓度细胞因子或血清条件下表现为凋亡延迟 ;细胞的粒系克隆形成单位数量明显增多 ,这一模型再现了原代慢粒白血病的异常表型特征 ,并以此模型发现p2 10 BCR/ABL转染CD34 细胞上调了p2 7Kip水平并可诱导MDR 1Pgp异常表达。结论　该模型适用于慢粒病理发生中的信号分子传导及分子调控研究 ,提示了慢粒耐药的分子机制。