将含有报告基因LacZ的重组腺病毒载体从大鼠鼻腔转移至脑的实验研究

目的 探讨将携带有报告基因的腺病毒载体由鼻腔转移至脑途径的可行性.方法 将携带半乳糖苷酶报告基因(LacZ)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMV LacZ)注入SD大鼠鼻腔黏膜,分别在注射3 d、7 d、14 d、21 d及28 d切取大鼠鼻腔黏膜以及与嗅觉信息传导途径相关的脑组织,进行冰冻切片和β-半乳糖苷酶(β-gal)免疫组织化学反应显色,判断该载体是否转染和表达蛋白质产物.结果 β-gal免疫组化染色反应显示,该病毒载体从第3天起即可在鼻腔黏膜与嗅球内的细胞转染和表达,在第7天至第21天病毒载体逐渐向颅内深部的室管膜下区、杏仁核及齿状回细胞转移和表达,持续性表达蛋白质产物达28 d之久.结论 经鼻腔黏膜注入腺病毒载体不仅可将外源性基因转移到脑实质内,还可确保外源性基因转染和表达成功.     

提高重组腺病毒载体提纯和滴定效率的研究

目的探讨提取、纯化和滴定重组腺病毒表达载体的有效方法.方法将已用含报告基因β-半乳糖苷酶基因(LacZ)的重组5型腺病毒载体(Ad5CMVLacZ)转染的人胚肾293细胞从-70℃转移至37℃,反复冻融使细胞发生破溃,病毒从细胞内释放至上清液.在上清液中加入氯化铯,进行密度梯度超速离心,收集和透析病毒液,用空斑形成实验确定病毒的滴度.结果经提取和纯化的Ad5CMVLacZ病毒液清晰无色,用系列稀释法将其配制成10-2～10-13的稀释度,分别转染100%汇合的293细胞,连续追踪观察空斑的形成及其数目变化,直至转染后第10天,10-10稀释度的空斑数不再增加为止,计数其空斑,从而确定出mL病毒的滴度,即空斑形成单位(pfu),最终测定得到的结果是3.0×1010pfu/mL.结论用上述方法能制备出优质的重组腺病毒载体,后者足以达到对中枢神经系统损伤和疾病进行基因治疗的要求.     

应用AdEasy腺病毒改良载体系统构建携带β-半乳糖苷酶基因重组腺病毒的实验研究

组腺病毒Ad-B-gal,病毒滴度达(2.5～4.0)×1011EFU/ml;感染复数(multiplicity of infection,MOI)为10时对HEK293细胞48 h转染率达70%,并在X-gaJ试剂作用下,细胞旱现蓝色.结论 成功构建了携带β-gal基因的重组腺病毒,能高效感染293细胞.并功能性表达β-半乳糖苷酶.     

成年大鼠腺病毒表达载体介导Lac Z基因从腓肠肌沿坐骨神经转移至脊髓的研究

目的 探索将具有报告基因的重组腺病毒载体从下肢效应器沿其支配的脊神经转移至脊髓的途径.方法 将携带半乳糖苷酶报告基因(Lac Z)的5型重组腺病毒载体(Ad5 CMV LacZ)注入到成年Wistar大鼠的腓肠肌(病毒滴度为1.01×105 pfu/mL),分别在注射后第3天、7天、14天、21天及28天灌注固定动物,选取腓肠肌、与腰骶神经丛相连的脊髓节段以及对应的脊神经节作为观察对象,用β-半乳糖苷酶免疫组织化学反应鉴定被转染和表达蛋白质的细胞.结果 在注射腓肠肌3 d后,该肌肉内有被转染及表达产物的细胞;7 d后在脊神经节内出现被转染和表达的细胞;14 d后在脊髓白质的后索及外侧索内出现上述细胞;21～28 d后在脊髓灰质的后角、中间带及前角出现被转染和表达的细胞.结论 随注射时间推移,腺病毒表达载体可从下肢骨骼肌沿着受支配的脊神经转移到脊髓,所携带的报告基因也成功地表达产物,故这是一条具有潜在应用价值的微创性基因治疗脊髓疾病的途径.     

细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒

目的 :利用细菌内同源重组快速构建重组腺病毒质粒和制备重组腺病毒。方法 :制备感受态BJ5 183,将pAdEasy - 1转化BJ5 183,制备含 pAdEasy - 1的BJ5 183感受态 ,将线性化的 pShuttle -CMV -LacZ转化含 pAdEasy- 1的BJ5 183感受态菌。采用细菌中同源重组法构建重组腺病毒质粒 pAdEasy - 1-LacZ。pAdEasy - 1-LacZ用PacⅠ线性化后 ,再用LipoVec介导其转染至AD2 93细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒 ,采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。采用X - gal染色观察LipoVec介导的重组腺病毒质粒的转染效果及病毒包装情况。将纯化的AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC ,X -gal染色观察基因转染效率及基因表达情况。 结果 :pShuttle -CMV -LacZ成功地转化了含 pAdEasy - 1的BJ5 183,并在其内发生了同源重组。X - gal染色证实了 pAdEasy - 1-LacZ转染AD2 93后 ,产生了重组腺病毒AdEasy - 1-LacZ。病毒滴度为 3.9× 10 12 pfu/ml。AdEasy - 1-LacZ转染HVSMC后 ,β -gal在HVSMC中得到了有效表达。 结论 :细菌内同源重组法是一种快速构建重组腺病毒质粒的方法 ,AdEasy - 1-LacZ的制备为基因治疗研究提供了一良好对照载体。     

体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

目的:采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ,为构建具有治疗价值的重组腺病毒载体奠定基础。方法:PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒,回收4.6 kb的LacZ基因表达盒,与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接,连接产物用SwaⅠ酶切,最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后,用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒,采用CsC l密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。结果:PCR扩增可见312 bp特异性条带,PI-SceⅠ/I-CeuⅠ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Ad-eno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。结论:体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法,本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础,Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。     

重组β—半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管闰滑肌细胞中的表达

目的构建表达β-半乳糖苷酶(β-gal)的重组腺病毒,以期为再狭窄的基因治疗研究提供一个对照载 体和为腺病毒介导的基因转移的安全性、可行性、转染效率的研究提供一有用的工具。方法采用基因重组方法构 建穿梭质粒pAd-β-gal,通过同源重组法制备出重组腺病毒Ad-β-gal,转染的293细胞用X-gal染色鉴定Ad-β -gal的正确与否。通过测定260nm的紫外光吸收值估计病毒高度。原代大鼠血管平滑肌细胞采用组织块培养 法。Ad-β-gal以100moi感染VSMCs并行X-gal染色,以观察β-gal在VSMCs中的表达情况。结果成功构建了 pAd-β-gal穿梭质粒和Ad-β-gal重组腺病毒,转染的293细胞和VSMCs经X-gal染为蓝色,病毒浓度为9×l011 pfu/ml,以100moiAd-β-gal转染VSMCs,其转染效率接近l00%。结论表达β-gal的重组腺病毒构建成功,并在 VSMCs中得到有效表达,本研究为将来再狭窄基因治疗研究提供了一对照载体,也为腺病毒介导的基因转移的安 全性、可行性、有效性的研究提供了一有用的工具。     

带有荧光素酶报告基因的可调控重组腺病毒载体的构建及表达

目的:构建带有萤火虫荧光素酶报告基因的可调控腺病毒载体,并在SW620结肠癌细胞株中观察其调控表达.方法:将萤火虫荧光素酶luc基因和启动子,以及RU486调控系统构建成单一的穿梭载体PDC-RULUC,将其与Admax腺病毒包装系统的辅助质粒共转染293细胞后,构建出可调控的重组腺病毒载体.扩增后用最终稀释法测定了其滴度,并在SW620细胞中检测了其基因调控效果,结果:成功地构建了携带有RU486调控系统的可调控腺病毒载体Ad-RULUC,病毒滴度达到5.2×1013pfu/L.当给予诱导剂RU486后,腺病毒载体可以诱导表达荧光索酶,并在一定范围内两者呈正比,而没有RU486时,几乎没有报告基因的表达.结论:腺病毒Ad-RULUC能调控外源基因的表达,为基因调控研究和基因治疗提供了良好的工具.     

腺病毒载体转染大鼠颈动脉的实验研究

目的观察腺病毒载体转染大鼠颈动脉的有效性和外源性基因表达的时间过程。方法用ＡｄＶ５－ＣＭＶ质粒（对照组）或Ａｄｖ５－ＣＭＶ／ＬａｃＺ质粒（治疗组）转染大鼠颈动脉３０分钟。术后２、７、１４、２８、６０及９０天取被转染的颈动脉,行β－半乳糖苷酶活性测定和组织化学染色。结果对照组所有颈动脉均无β－半乳糖苷酶活性,治疗组术后２天颈动脉即有β－半乳糖苷酶的表达,７～１４天为表达高峰期,２８天后表达量明显减少,但可持续表达３个月之久。治疗组术后２、７、１４、２８、６０及９０天每条颈动脉均可见蓝染,其中术后７及１４天每条颈动脉横切面的全周均有蓝染,血管壁内层、中层的大部分细胞被染成蓝色。对照组所有动脉均未见蓝染。结论腺病毒载体能高效转染大鼠在体颈动脉。转染后,外源性基因的高水平表达只能维持１个月左右。     

虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒表达载体的构建与鉴定

目的:构建表达虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为腺病毒中和抗体流行水平的定量检测奠定基础?方法:采用腺病毒表达系统(ViraPower Adenoviral Expression System)构建重组腺病毒表达载体?首先利用PCR的方法扩增虫荧光色素酶基因使其具备特定的CACC接头,以连接?转化?提取质粒等方法克隆入载体pENTR/D-TOPO以获得入门克隆,经PCR及测序鉴定正确后,用重组酶(LR ClonaseTMⅡ Enzyme Mix)进行入门克隆与表达载体(pAd-CMV/V5-DEST)间的重组反应,以获得表达克隆rAd-Luci?表达克隆鉴定后,用限制性内切酶PacⅠ线性化后转染HEK293A包装细胞得到重组腺病毒?经过扩增后,用极限稀释法检测病毒滴度,用Western blot法检测rAd-Luci载体是否能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并检测此酶蛋白的功能活性?结果:用PCR的方法扩增到具有CACC接头的虫荧光色素酶基因,其重组入门和腺病毒表达克隆经PCR和测序鉴定构建正确,重组表达克隆转染HEK293A细胞并扩增后获得的病毒滴度为1.8×1011 pfu/ml,此病毒能正确表达虫荧光色素酶蛋白,并且具有较强的功能活性?结论:成功构建了虫荧光色素酶报告基因重组腺病毒载体,为此重组载体用于腺病毒中和抗体的定量检测奠定基础?     

成年大鼠侧脑室注射与脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的比较研究

目的比较观察脑室注射和脑实质注射腺病毒表达载体转染脑细胞的范围及表达产物的程度。方法分别将Ad5CMV LacZ表达载体（20μl,病毒滴度为1．01×10^5pfu／ml）注入成年SD大鼠右侧脑室、尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,在注射后3～28d将大鼠脑制作成为切片,进行X-gal组织化学反应,观察被转染和表达的细胞形态和数目。结果在侧脑室内注射后3d,右侧侧脑室室管膜细胞及其下层开始有病毒载体转染和表达,继之向对侧侧脑室、第三脑室和第四脑室转染和表达产物,脊髓中央管壁偶尔有被转染和表达的细胞;而将等体积和等滴度的AdSCMV LacZ载体注入尾壳核、内侧隔核-斜角带复合体和背侧海马,则均出现直径约2～5mm的转染范围,表达产物的细胞离注射原位最远处约为5—6mm,细胞表达产物很局限并相对集中;而侧脑室注射病毒载体可以随脑脊液流动而使转染范围广,但被转染细胞主要集中在室管膜及其下层,离脑室壁最远处也只在0．5—2mm范围内。结论侧脑室注射病毒表达载体便于基因治疗弥漫性脑疾病;而脑实质注射病毒表达载体则利于基因治疗局部性脑疾病。     

腺病毒载体介导的大鼠DNA多聚酶β重组体的构建及其在PC12细胞中的表达

[目的]为探讨DNA多聚酶β在神经细胞损伤中的作用与机制,构建其重组腺病毒载体,并在PC12细胞中表达.[方法]RT-PCR获取大鼠DNA多聚酶β(POLβ)的编码序列,TA克隆测序,酶切POLβ基因并连入穿梭质粒pAdTrack-CMV,电转至含腺病毒pAdeasy骨架质粒的大肠杆菌BJ5183.重组腺病毒质粒(pAd-polβ)和Lipofectamine2000转染293细胞,用重组腺病毒感染PC12细胞.[结果]10个TA克隆中有3个克隆的序列与GENE BANK中大鼠POLβ cDNA序列完全一致,同源重组检测时30个克隆中有8个含目标条带.DNA序列正确的POLβ重组腺病毒质粒转染293细胞后,感染Ad-polβ的293及PC12细胞荧光显微镜下可见绿色荧光,重组腺病毒Ad-polβPCR鉴定含目标条带,Ad-polβ感染PC12细胞Western Blot检测到POLβ蛋白表达.[结论]成功构建了大鼠DNA多聚酶β的腺病毒重组体并在PC12细胞中表达     

腺病毒载体介导的人类α1-抗胰蛋白酶过表达可促进伤口愈合

目的α1-抗胰蛋白酶（ATT）是一种存在于血浆与伤口处的丝氨酸蛋白酶抑制剂,本实验目的是研究ATT在伤口愈合过程中的重要作用。方法构建α1-抗胰蛋白酶转基因腺病毒（Ad-ATT）表达模型,并阐述其生物学功能。结果（1）在正常鼠实验中,与对照组LacZ（β-半乳糖苷酶）相比,过表达的ATT能够促进肉芽组织形成、胶原蛋白沉积和细胞增生;（2）正常鼠与（链脲霉素诱发的）糖尿病鼠对比实验中,Ad-ATT能明显增强伤口的弹性强度;（3）经药物诱发老鼠出现慢性伤口的实验模型中,组织学分析显示,伤口处注射Ad-ATT后炎性细胞浸润比注射Ad-LacZ明显减少。结论数据显示过表达的Ad-ATT通过降低炎症反应程度的方式促进伤口愈合。     

酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

目的 建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法.方法 采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定最佳酶活测定条件. 结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)＞8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109 中差异有统计学意义(P＜0.001),而在Y187中没有明显差异(P＞0.05). 结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定.     

酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶活性测定方法的研究

目的 建立标准的酵母双杂交系统报告基因表达的β-半乳糖苷酶活性测定方法.方法 采用o-硝基-β-D-半乳糖苷(ONPG)为底物,以液氮反复冻融破碎酵母细胞壁,通过比较不同测定时间、接种阳性克隆数目、转化方法以及酵母株对β-半乳糖苷酶酶活的影响,确定最佳酶活测定条件. 结果相同条件下,单个克隆之间的酶活有差异,相对标准偏差(RSD)＞8%;相同条件下,Y187酵母株比AH109酵母株酶活高18～20倍,并且本底水平很低甚至没有;双倍体酵母的酶活介于两个单倍体酵母之间,同预计一致;质粒顺序转化与共转化在AH109 中差异有统计学意义(P＜0.001),而在Y187中没有明显差异(P＞0.05). 结论测定酵母双杂交报告基因β-半乳糖苷酶的活性宜采用Y187酵母株,酶活变化范围大,本底小,受转化方法影响小,测定时选取5个以上阳性克隆混合培养更有利于酶活的准确测定.     

重组腺病毒转染兔心肌细胞的实验研究

目的:观察腺病毒载体转染兔心肌细胞的有效性和外源性基因表达的时相性.方法:用Adv5-CAG粘粒(对照组)或Adv5-CAG/LacZ质粒(治疗组)转染兔心肌,转染后第3、7、14、28天取被转染心肌组织行X-gal染色及β-半乳糖苷酶活性检测.结果:X-gal染色示,治疗组转染后第3、7、14、28天注射部位心肌均见蓝染,尤以第7、14天明显,而对照组所有心肌均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示治疗组转染后第3天心肌中即有β-半乳糖苷酶表达,第7、14天表达达高峰,28天表达量明显减少.结论:重组腺病毒载体可成功转染兔心肌细胞,外源性基因在兔心肌细胞中能有效地表达并能维持1个月左右.     

重组腺病毒载体介导FasL治疗人脑胶质瘤实验研究

目的:研究以重组缺陷型腺病毒为载体的Fas配体(Fas-Ligand,FasL)基因治疗人脑胶质瘤。方法:用RT-PCR方法构建携带人FasL cDNA的缺陷型重组腺病毒载体(Ad-FL),在体外转导5株人脑胶质瘤细胞;体外检测Ad-FL对人脑胶质瘤细胞生长的影响;建立裸鼠皮下人胶质瘤模型,给予体内治疗。结果:体外实验证实Ad-FL能显著诱导5株胶质细胞瘤在体外凋亡或抑制其生长;体内试验表明重组腺病毒可以在体内有效表达FasL,且能有效通过诱导凋亡和/或炎症反应抑制U251胶质瘤的生长,使荷瘤鼠存活90天以上,而Ad-LacZ和对照组分别为(19.6±2.4)天和(15.8±1.9)天(P<0.01)。结论:以重组腺病毒为载体的FasL基因治疗脑胶质瘤效果显著,将是一种基因治疗脑胶质瘤的新手段。     

含有人热休克蛋白基因的重组腺病毒转染乳鼠心肌细胞的实验研究

目的:研究含有人热休克蛋白70(HSP70)基因的重组腺病毒对乳鼠心肌细胞的转染效率以及基因转染后HSP70的表达。方法:体外原代培养乳鼠心肌细胞,以携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的腺病毒载体(Ad.EGFP)按不同感染倍数(MOI)体外感染心肌细胞,通过荧光显微镜、流式细胞仪观察所构建的腺病毒的感染力和安全性;应用含有人HSP70基因的重组腺病毒(Ad.HSP70)进行体外感染,采用ELISA法、Western印迹法及免疫组化染色法检测HSP70基因在心肌细胞中的表达情况。结果:Ad.EGFP感染心肌细胞的效率高于90%,在MOI值为200时,未见心肌细胞的生长明显受抑;ELISA法、Western印迹法以及免疫组化染色法证实转染的心肌细胞在正常生理状态下,可高水平表达HSP70。结论:重组腺病毒Ad.HSP70能够在体外高效、安全地感染心肌细胞,并成功地表达HSP70。     

关于E.Coli中alKA基因启动子突变点的研究

本文用人工突变的方法,获得E.coli.alk A基因启动子上游区的突变体,其中1个碱基置换的有73株,2个及2个以上碱基置换的有7株,缺失和插入的有11株。突变株β-半乳糖苷酶活性测定,观察到大部分酶活性低于野生型,仅1株高于野生型。     

大鼠BDNF基因复制缺陷型重组腺病毒的构建与鉴定

 【目的】构建携带大鼠脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并初步检测其体外表达目的基因的能力。【方法】提取大鼠脑组织总RNA，使用RT—PCR方法扩增BDNF目的基因并将其克隆入pMD18-T Simple载体测序，将测序完全正确的BDNF目的基因克隆入pShuttle2中，然后利用体外连接法将BDNF目的基因克隆入Adeno—X^TM腺病毒骨架中。Lipofectamine^TM 2000法转染HEK293细胞包装携带BDNF目的基因的重组腺病毒，少量提取重组腺病毒DNA检测证实为复制缺陷型BDNF基因重组腺病毒后大量扩增。蛋白电泳及Western blot法初步检测BDNF目的基因在HEK293细胞中的表达。【结果】成功构建了携带大鼠BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒。并证实其在HEK293细胞中可高水平表达BDNF目的基因。【结论】利用体外连接法可方便、快捷地构建携带BDNF目的基因的复制缺陷型重组腺病毒，并可在体外高水平表达表达其所携带的目的基因。