骨髓干细胞移植治疗对肝豆状核变性早期TX小鼠脑肾铜代谢的影响

【目的】 探讨骨髓干细胞移植对于疾病早期肝豆状核变性模型鼠———TX小鼠脑、肾组织铜代谢的影响。【方法】4~5周龄的雄性DL小鼠50只为供体;2月龄的TX小鼠50只为受体(雌∶雄=3:2),随机分为移植组和对照组各25只(雌∶雄=3:2)。分离供体小鼠骨髓干细胞并标记CM-DiI荧光,经尾静脉注入移植组TX小鼠体内,每只小鼠0.2 mL(1.2 × 107个细胞),对照组动物注入等量平衡盐液体。移植后的1、2、4、8、12周处死动物检测脑、肾铜含量情况,并以CM-DiI荧光示踪技术考察干细胞在受体鼠脑、肾组织的分布情况。【结果】 移植治疗后脑和肾脏铜含量(脑铜平均28.7 mg/kg,肾铜平均31.7 mg/kg)较对照组(脑铜平均34.5 mg/kg,肾铜平均36.9 mg/kg)均有下降趋势,达到对照组铜含量的70% ~ 98%;移植后第4周时治疗组脑铜含量(28.4 ± 5.5) mg/kg,仅为对照组(40.1 ± 6.9) mg/kg的70%, 改变有统计学意义(P < 0.05)。示踪研究在移植后各时间点均可于脑内检测到供体细胞,肾脏未检测到供体细胞。【结论】疾病早期TX小鼠接受骨髓干细胞移植治疗,对脑内铜代谢有一定改善作用,对肾脏铜代谢无明显改善作用。     

317L-Cu抗菌不锈钢对小鼠成纤维细胞生物学行为的影响

目的 探讨317L-Cu抗菌不锈钢(317L-Cu SS)对小鼠成纤维细胞(L-929细胞)增殖、黏附、凋亡等生物学行为的影响,评价抗菌不锈钢材料的细胞毒性;同时观察不同浓度Cu2+对细胞毒性的影响.方法 检测L-929细胞在普通医用不锈钢(317L SS)、317L-Cu SS、医用纯钛(Ti)及纯铜(Cu)材料浸提...     

TX小鼠的铜代谢特点和肝脏病理学特征

【目的】对TX小鼠的铜代谢特征和肝脏的组织病理学及超微结构进行研究。【方法】TX小鼠16只以及同系DL小鼠16只分别作为病例组和对照组,测定各自的血清铜、铜蓝蛋白等铜生化指标,用光学显微镜常规HE染色及电镜观察肝脏病理学特点。【结果】按于体质量的肝铜含量成年TX小鼠显著高于对照小鼠,[(701.9±234)mg/g vs.(15.6±3.8)mg/g,P<0.01]。光镜下肝细胞排列紊乱,细胞肿胀,部分胞核增大呈空泡状,伴有大量的炎性细胞浸润,同时可见活跃增生的卵圆细胞。电镜下可见多数肝细胞的溶酶体结构有较多的颗粒状电子致密物沉积,伴有线粒体增多肿胀。【结论】TX小鼠铜代谢特点和肝铜沉积的组织病理学特征与Wil-son病相符,是Wilson病研究较理想的动物模型。     

小鼠骨髓基质成纤维细胞与成骨关系的实验研究

目的：研究骨髓基质成纤维细胞与成骨的关系。方法：Luria多器官培养器体外器官培养法，肾被膜下移植技术以及石蜡切片技术，结果：移植物在移植处形成软骨细胞团及骨基质，结论：骨髓基质成纤维细胞集落形成细胞（CFU－F）为基质多能干细胞，能增生分化为成骨所必需的基质细胞。     

亚砷酸对小鼠成纤维细胞凋亡的影响

目的 研究亚砷酸对成纤维细胞株增殖和凋亡的作用.方法 运用镜下观察细胞生长形态、MTT比色法测定细胞增殖,流式细胞术测定细胞Annexin V的表达.结果 在4.0 mg/L的亚砷酸作用下,成纤维细胞不呈现典型的梭形贴壁细胞形态,增殖受抑制,并明显诱导细胞Annexin V的表达.亚砷酸低于2.0 mg/L时,对成纤维细胞无明显的凋亡诱导作用,而且细胞抑制不明显.结论 高剂量的亚砷酸能改变成纤维细胞的细胞形态,并具有诱导细胞凋亡和抑制增殖的作用.     

小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的 探讨影响小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）分离和培养的一些因素，以建立稳定的MEF培养体系。方法 取BALB／c小鼠胚胎分离成纤维细胞，利用体外培养体系，对MEF的生长形态，生长曲线及细胞周期进行观察，并对不同胚胎日龄以及不同胰酶作用时间对MEF分离及培养的影响进行研究。结果 13.5d胎龄鼠胚的MEF分离效果优于10.5d,18.5d胎龄鼠胚；MEF在体外为贴壁生长型细胞，第三代细胞增殖旺盛;在室温条件下，0.25%胰酶消化MEF时间以3－5min为宜。结论 MEF在第3代增殖旺盛，最适宜作胚胎干细胞的饲养层。     

pcDNA3.1载体对内参基因表达影响分析

目的:研究转染质粒pcDNA3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcDNA3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考.方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcDNA3.1空载体质粒,转染后48 h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异,提取细胞总蛋白,检测GAPDH、β-actin表达水平差异.结果:5种细胞在转染质粒pcDNA3.1后,内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降,其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转录水平下降幅度小,且下降程度接近.结论:pcDNA3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制,其中对管家基因β-actin影响较大,因此在应用pcDNA3.1来源载体进行基因功能分析时,不推荐使用β-actin作为内参基因.     

重组体pcDNA3.1(+)-tyr的构建及在小鼠NIH3T3细胞中的表达

[目的]克隆酪氨酸酶基因(tyr),构建pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞表达。[方法]用RT-PCR法从小鼠B16黑色素瘤细胞中克隆tyr全长cDNA片段,利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒pcDNA3.1(+)的T7启动子下游,并用脂质体法导入NIH3T3细胞,RT-PCR,酪氨酸酶活性测定及多巴染色法检测tyr的表达。[结果]成功克隆1.74kb的全长tyr cDNA片段,经测序证实与GenBank所报道的序列完全一致,tyr准确克隆入pcDNA3.1(+)的多克隆位点,RT-PCR及酪氨酸酶活性测定等方法检测到转染了重组体的NIH3T3细胞中有tyr的表达。[结论]本实验成功构建了pcDNA3.1(+)-tyr真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中表达。     

pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体内表达的实验性研究

目的 获得重组pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达.方法 采用流体动力法将表达mB7-H4-hIg融合蛋白的真核表达载体输注小鼠体内,通过酶联免疫吸附测定(ELISA)和实时定量PCR(RT-PCR)的方法,定量检测pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在小鼠体的内表达.结果 经尾静脉注射的pcDNA3.1/mB7-H4-Fc能在肝组织中稳定表达,在48 h时间点分泌的量达到最高,最大量约120 ng/mL.结论 成功将pcDNA 3.1/mB7-H4-Fc表达载体导入了小鼠肝脏,并获得了pcDNA3.1/mB7-H4-Fc在肝内的高效稳定表达.     

流体动力学法表达乙肝病毒X蛋白小鼠模型的建立

目的 建立表达乙肝病毒X蛋白的小鼠模型.方法 实验动物分成模型组和对照组,模型组利用已构建的含有HBX基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HBX,对照组以等量生理盐水代替,采用流体动力学法将质粒经尾静脉高压注入小鼠体内,24 h后取小鼠肝组织,行免疫荧光、RT-PCR和Western blot法从不同水平检测HBX在小鼠肝组织内的表达情况.结果模型组小鼠RT-PCR显示肝组织内有HBX mRNA的存在,免疫荧光和Westernblot检测均有HBX蛋白的表达;对照组小鼠则无HBX表达.结论 成功建立了表达乙肝病毒X蛋白小鼠模型,为进一步探讨HBX蛋白在动物体内的生物学作用提供实验基础.     

ING4基因的克隆和真核表达载体的构建

目的 分离小鼠ING4(inhibitor of growth family，member 4)基因并构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4。方法 从小鼠肝组织中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出ING4cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4，分别用双酶切、PCR、基因测序进行鉴定。结果 RT-PCR产物为约750bp的条带，构建的真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4经双酶切、PCR鉴定均出现750bp大小的条带，基因测序正确。结论 分离得到了小鼠ING4基因并成功构建真核表达载体pcDNA3．1( )-ING4。     

人ATP7B基因在转基因大鼠的铜代谢通路中的功能分析

目的　利用转基因大鼠模型 ,研究人Wilson病致病基因ATP7B在铜代谢通路中的功能。方法　将构建的 7 1kb含有鸡 β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA ,经显微注射法导入Wilson病动物模型LEC(long_evanscinnamon)大鼠受精卵的雄性原核。以RT_PCR和Westernblot分析其在转基因大鼠各组织内的表达谱 ;用抗大鼠铜蓝蛋白抗体检测肝细胞全铜蓝蛋白 (holoceruloplasmin)的合成 ;同时对 6～ 30周龄的转基因大鼠血清铜蓝蛋白亚铁氧化酶活性、血清铜浓度、胆汁的铜分泌量、以及肝、肾和脑组织中的铜含量进行分年龄段连续测定和统计学分析。结果　在转基因大鼠体内 ,ATP7B在各种组织中获得广泛表达 ,其中肝和肌肉中的表达水平较高 ,肝细胞恢复了全铜蓝蛋白的合成 ,血清中的铜含量及胆汁的铜排泄量增加 ,肝、肾组织中的铜蓄积减少。结论　完整表达人ATP7B基因产物的转基因大鼠的肝细胞 ,通过CPN介导的铜向血清的分泌和调节铜向胆汁的排泄 ,恢复了ATP7B参与铜转运功能 ,Wilson病的铜蓄积与ATP7B基因的突变直接相关。     

真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA的建立及其在人皮肤成纤维细胞的表达活性

目的：建立在人皮肤成纤维细胞中稳定表达的细胞株,为组织型纤溶酶原激活因子（TPA）功能分析和对缺血性心脏疾病基因治疗提供理论依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1（+）TPA,然后将其转入人皮肤成纤维细胞,经G418筛选后,用RT PCR,ELISA和发色底物法观察外源性TPA表达情况。结果：真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为每24小时643.5ng/106个细胞,高于未转pcDNA3.1（+）TPA的皮肤成纤维细胞每24小时19.2ng/106个细胞;发色底物法测得外源性TPA活性为每24小时122.6U/106个细胞,亦高于未转pcDNA3.1（+）TPA的皮肤成纤维细胞每24小时5.8U/106个细胞。结论：pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后,外源性TPA基因获有效表达,该细胞模型将成为TPA功能研究和缺血性心脏病基因治疗的重要方法。     

日本血吸虫pcDNA3.1(+)/MLP核酸疫苗诱导家兔免疫应答的初步检测

目的 初步检测日本血吸虫pcDNA3．1( )／MLP(SJP)核酸疫苗是否诱导家兔免疫应答的产生。方法 将24只新西兰家兔随机分为2组，每组12只；实验组每只家兔SJP的免疫剂量为500μg/次，后腿肌肉注射，对照组注射空质粒pcDNA3．1( )，隔周免疫1次，共4次；于0周、8周、16周采血2mL，制备血清，做环卵沉淀反应，并做血清抗体及细胞因子分析。结果 实验组环卵沉淀反应0周结果阴性，第8、16周结果阳性，对照组家兔环卵沉淀反应结果阴性，实验组可诱导IgA、IgG1变化，诱生INF-γ应答。结论 SJP核酸疫苗免疫家兔可产生体液免疫及细胞免疫。     

人ATP7B转基因大鼠模型的建立及其在转基因大鼠体内的表达分析

目的利用受精卵的雄性原核显微注射法,建立人ATP7B转基因大鼠模型。方法将构建7.1kb含有鸡β肌动蛋白启动子的人正常ATP7BcDNA,经显微注射法导入Wilson’s病动物模型LEC(Long-Evans Cinnamon)大鼠的受精卵,利用PCR法筛选、鉴定阳性转基因大鼠,以RT-PCR和Western bolt检测人ATP7B在转基因大鼠体内的表达,并从血液生化指标和临床症状上对16周龄内的阳性转基因大鼠进行分析。结果建立了3株独立的转基因大鼠株系,其中2株转基因大鼠的肝组织中可检测到完整的人ATP7B基因表达产物,血液生化和临床指征显示2株转基因大鼠具有明显的ATP7B相关功能恢复表型。结论人ATP7B在转基因大鼠的肝组织中获得完整和正确的表达,其弥补了转基因大鼠内源性Atp7b基因功能的缺陷。     

中国人Wilson病ATP7B基因启动子区的研究

目的研究中国人Wilson病（WD）ATP7B基因启动子区的序列和结构,发现存在的多态和突变情况。方法检测60例无亲缘关系的WD患者和20例正常人的基因组DNA序列并进行分析。结果（1）在正常对照和WD患者的启动子区-190位和-78位（转录起始点为＋1）均发现存在单个碱基的不同;（2）60例WD患者中,3例发现存在-504位G→C的突变,其中2例为纯合突变,1例为杂合突变,在正常对照中未发现此改变。（3）60例WD患者中,2例发现存在-782位A→G的突变,其中1例为纯合突变,另1例为杂合突变,在正常对照中未发现此改变。结论WD基因的转录直接受铜或其他重金属的调节。中国人WD基因启动子区序列存在的2个多态位点均位于已知的转录调控元件结构之外,提示核苷酸多态对启动子调控基因的表达不会产生影响。启动子区的突变也是WD的分子发病机制之一。提示WD基因的分子发病机制是多样又复杂。