IL-12双亚基共表达载体的构建及其在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建人IL-12（hIL-12）p40和p35双亚基真核共表达载体并转染人骨髓间充质干细胞（hMSC）。方法根据hIL-12p40和p35亚基全长cDNA序列分别设计合成引物行PCR扩增，将扩增所得p40和p35片段采用overlap PCR法拼接，获得的rhIL-12融合基因与pGEM—TEasy质粒连接，将鉴定正确的pGEM—T／rhIL-12重组质粒克隆至pcDNA3．1（＋）真核表达质粒中，构建pcDNA3．1（＋）／rhIL-12真核表达载体，并进行测序鉴定。将鉴定正确的pcDNA3．1（＋）／rhIL-12经脂质体介导转染hMSC，同时以转染pcDNA3．1（＋）空质粒作为对照组，在倒置显微镜下观察细胞生长形态；在转染后第4天采用蛋白质印迹法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达；另分别在转染后第2、4、6、8、10、12、14天，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中rhIL-12融合基因的表达水平。结果PCR扩增结果显示特异性扩增出p40（1000bp）、p35（600bp）、rhIL-12（1600bp）片段，均与预期DNA表达片段大小一致。pcDNA3．1（＋）／rhIL-12测序显示克隆的rhlL-12基因序列与报告序列完全相同。倒置显微镜下观察，可见转染pcDNA3．1（＋）／rhIL-12的hMSC生长形态和生长速度与对照组hMSC相比均无明显差异。蛋白质印迹和ELISA检测显示，转染pcDNA3．1（＋）／rhIL-12的hMSC培养上清液中可见rhIL-12融合蛋白的持续表达；而对照组中均未检测到rhIL-12融合蛋白表达。结论成功构建了hIL-12p40和p35双亚基真核共表达载体pcDNA3．1（＋）／rhIL-12，为利用hIL-12进行非病毒载体抗肿瘤基因治疗奠定了基础。     

IL-12基因不同亚基真核表达载体的构建及表达

目的:克隆并构建含人白介素12(hIL-12)基因p35、p40不同亚基的真核表达载体,瞬时转染真核细胞并诱导IL-12的表达。方法:人单核细胞白血病细胞株(THP-1)和人白血病细胞株(HL-60),经DMSO、IFN-γ和LPS诱导后,用RT-PCR及SOEPCR扩增IL-12p40、p35及p40-p35融合基因;并构建pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达载体。以3种重组质粒分别瞬时转染COS-7细胞后,通过RT-PCR及ELISA法检测目的基因的表达。结果:经诱导后,从HL-60细胞中扩增到IL-12p40和p35基因片段;但从THP-1细胞中只扩增到p35基因片段,未能扩增到p40基因片段;经酶切鉴定、PCR扩增及序列测定表明pcDNA-p35、pcDNA-p40及pcDNA-IL-12真核表达质粒构建成功;并在COS-7细胞中可检测到IL-12的表达。结论:含hIL-12基因不同亚基的真核表达质粒的成功构建,对进一步研究IL-12在免疫应答中的调节作用以及作为免疫佐剂改善BCG免疫保护效果的研究奠定了基础。     

谷氨酸脱羧酶65片段与IL－10双基因真核表达载体的构建与鉴定

 目的 优化以往构建的以预防 1 型糖尿病为目的的全长谷氨酸脱羧酶（GAD）65 DNA疫苗，尝试构建GAD 65片段与IL-10双基因真核表达载体。方法 从GAD65质粒中扩增出GAD190-315片段和GAD490-570片段的cDNA，以overlap PCR法将之分别与hIL-2信号肽cDNA拼接，得到SGAD190-315、SGAD490-570融合基因。以p43.2-mIL-10质粒为模板，用PCR方法扩增出IL-10基因。将SGAD190-315、SGAD490-570融合基因分别与IL-10基因依次克隆入双启动子真核表达载体pBudCE4.1中，构建出2种双基因重组真核表达载体pBud-SGAD190-315/IL-10和pBud-SGAD490-570/IL-10。2种重组真核表达载体经测序鉴定正确后，用脂质体介导的方法转染COS-7细胞，转染后48和72 h以蛋白质印迹法检测细胞裂解产物及上清液中SGAD190-315和SGAD490-570融合基因的表达，ELISA方法检测细胞上清液中IL-10的表达。结果　核酸序列测定表明克隆的SGAD190-315、SGAD490-570融合基因和IL-10基因序列与报告序列一致。蛋白质印迹法和ELISA方法均检测到SGAD190-315/IL-10和SGAD490-570/IL-10重组真核表达载体在COS-7细胞中的表达。结论　成功构建了2种GAD65片段与IL-10双基因真核表达载体，为1型糖尿病的基因疫苗预防研究提供了实验基础。     

稳定表达膜结合型 CD40L 配体 CHO 细胞系的建立和鉴定

 目的 建立稳定表达膜结合型 CD40 配体（CD40L）的 CHO 细胞系。 方法 将编码膜结合型 CD40L 的重组质粒 pcDNA3.1- fCD40L 用 BgI Ⅱ 和 XhoⅠ 酶进行双酶切鉴定。电穿孔法向 CHO 细胞转染该重组质粒，G418 筛选抗性克隆，有限稀释法获取单克隆阳性细胞后扩大培养，获得 2 个整合了 fCD40L 基因的 CHO 细胞（CHO-fCD40L）克隆。用 RT-PCR、流式细胞仪分别从 RNA 和蛋白质水平对 2 个CHO-fCD40L 克隆细胞中膜结合型 CD40L 的表达进行检测；ELISA 法检测 2 个 CHO-fCD40L 克隆细胞培养上清液中可溶性 CD40L（sCD40L）的含量。 结果 重组质粒 pcDNA3.1-fCD40L 经双酶切和电泳检测到符合预期大小的基因片段。该重组质粒转染 CHO 细胞后经克隆化培养获得 2 个 CHO-fCD40L 克隆，分别命名为 C10、E11。RT-PCR 检测显示 C10、E11 细胞中有膜结合型 CD40L mRNA 的转录；流式细胞仪检测显示 C10、E11 细胞表达 CD40L 蛋白达 90% 以上；ELISA 法检测到显示 C10、E11 细胞培养液上清中有 sCD40L 蛋白表达。 结论 成功获得稳定表达膜结合型 CD40L 的 CHO 细胞系，为比较膜结合型 CD40L 与 sCD40L 的生物学功能奠定了良好基础。     

eglA P-Her2/neu-IL-12融合基因穿梭载体的构建

目的:构建重组厌氧芽胞梭菌saccharobutylicum内源性β-1,4葡聚糖酶启动子(eglA p人)-表皮生长因子受体2胞外区(hHer2/neu ECD人)-白细胞介素12(rhIL-12)融合基因穿梭表达载体(pIMP1 eglA p-hHer2/neu ECD-rhIL-12),为进一步制备eglAp-hHer2/neu-rhIL-12融合基因修饰的厌氧芽胞梭菌,并探讨其对Her2/neu+实体肿瘤的基因治疗作用奠定基础。方法:以含有全长hHer2/neu序列的真核表达质粒(pcDNA3.1 hHer2/neu)为模板,采用PCR方法,扩增hHer2/neu ECD基因片段;将其插入重组rhIL-12真核表达质粒pcD-NA6 rhIL-12(p1)中的rhIL-12基因上游,获得pcDNA6 hHer2/neu ECD-rhIL-12(p2)真核表达质粒;设计合成eglAp基因中一段55 bp序列作为模板,通过连续PCR的方法,扩增eglAp片段(335 bp),并构建T-eglA p(p3)亚克隆质粒;通过酶切连接的方法,将eglA p片段插入p2质粒中的hHer2/neu ECD基因上游,...     

GM-CSF与IL-21基因共转染卵巢癌细胞及其对NK细胞活性的影响

 目的 探讨粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与 IL-21 基因共转染的体外抗肿瘤效应。 方法 制备 pRSC-GM-CSF- IL21 重组质粒，再用脂质体将 质粒 pRSC-GM-CSF、pRSC-IL21 和 pRSC-GM-CSF-IL21 分别转染人卵巢癌 SKOV3 细胞（依次命名为 SKOV3/GM- CSF、SKOV3/IL21、SKOV3/GM-CSF-IL21 细胞）。以 RT- PCR 方法检测 GM-CSF 与 IL-21 表达；倒置相差显微镜观察各组细胞形态学变化；噻唑蓝法测定各组细胞增殖活性；流式细胞仪检测各组细胞细胞周期分布，细胞表面 HLA-ABC、主要组织相容性复合体 I 类相关基因（MIC A/B）、细胞间黏附分子 1（ICAM-1）的表达，以及各组细胞培养上清液对 NK 细胞活性的影响。以未转染的 SKOV3 细胞和转染空质粒 pRSC 的细胞（SKOV3/Neo）为对照。 结果 经酶切与测序鉴定，pRSC-GM-CSF-IL21 重组体构建正确，共转染 SKOV3 细胞中有目的基因 GM-CSF、IL-21 的表达。各组细胞的形态学、增殖特性、细胞周期分布及 HLA-ABC 表达无明显变化。SKOV3、SKOV3/Neo、SKOV3/GM-CSF、SKOV3/IL21 和 SKOV3/GM-CSF-IL21 细胞的 MIC A/B 表达量分别为 19.24% ± 2.31%、31.11% ± 3.76%、37.27% ± 3.04%、54.97% ± 4.77% 和 63.94% ± 5.90%；ICAM-1 表达量分别为 35.88% ± 3.06%、37.75% ± 4.09%、68.59% ± 4.84%、78.53% ± 5.78% 和 84.10% ± 3.98%；加入各组细胞培养上清液后 NK 细胞活性分别为 31.8% ± 3.6%、42.7% ± 3.3%、54.7% ± 7.4%、55.9% ± 4.4% 及 63.4% ± 6.4%。SKOV3/GM-CSF-IL21 细胞分别与 SKOV3、SKOV3/ Neo 细胞比较，3 项指标的差异均有统计学意义（P < 0.01）。 结论 GM-CSF 与 IL-21 基因共转染可上调 SKOV3 细胞表面 MIC A/B 与 ICAM-1 表达，表达产物可增强 NK 细胞活性，这有助于免疫细胞激活，增强抗肿瘤效应。     

pGenesil-siHBV X 对 HepG2.2.15 细胞 HBV 表达和复制的抑制效果研究

 目的 研究针对HBV X基因区设计的小干扰RNA（siRNA）表达载体质粒pGenesil-siHBV X 对HepG2.2.15细胞HBV表达和复制的抑制效果及特异性。方法 针对HBV X区设计siRNA表达载体质粒pGenesil- siHBV X。分别用培养液（空白对照）、脂质体Metafectene、pGenesil 空载体、pGenesil-siHK（阴性对照）、pGenesil-siAFP（特异性对照）、pGenesil-siHBV X处理或转染HepG2.2.15细胞各3次。于每次转染后24 h，取各组细胞培养上清液，用时间分辨荧光免疫测定技术检测上清液中HBsAg和HBeAg含量，用化学发光法检测AFP含量，用PCR荧光定量技术检测HBV-DNA复制水平。 结果 pGenesil-siHBV X转染能抑制HepG2.2.15细胞对HBV标志物的表达，且抑制作用随转染次数增加而增强。第3次转染后，pGenesil-siHBV X组细胞上清液中 HBsAg、 HBeAg和HBV-DNA检测结果分别为（6.26 ± 1.07）ng/ml 、（0.13 ± 0.05）Ncu/ml和（3.01 ± 0.40）×107拷贝/ml，与空白对照组的（22.50 ± 1.39）ng/ml、（1.12 ± 0.11）Ncu/ml和（12.33 ± 1.28）×107拷贝/ml比较，差异有统计学意义（t值分别为12.80、12.21、9.71，P < 0.05）；pGenesil-siHBV X 转染不影响细胞对AFP的表达（t = 0.18，P = 0.86）。结论 pGenesil-siHBV X可以有效和特异地抑制HepG 2.2. 15细胞HBV-DNA的复制及HBsAg和HBeAg表达。     

肝细胞生长因子基因转移预防术后肠黏连的实验研究

 目的 观察质粒DNA在大鼠术后肠黏连模型中的表达效率及肝细胞生长因子（HGF）基因转移对术后肠黏连的预防作用。 方法 以 pcDNA3-HGF 转染 CHO 细胞 24 h后收集培养上清，用 ELISA 测定培养上清中 HGF 的浓度；取培养的大鼠腹膜间皮细胞作划痕试验，观察表达 HGF 的培养上清对间皮细胞迁移的影响。利用无菌干纱布擦伤盲肠的方法建立 Wistar 大鼠术后肠黏连模型，将模型大鼠随机分为 5 组，每组 10 只。其中 4 组分别于创面涂布 pcDNA3-HGF 10、50、100 和 200 g，1 组于创面涂布绿色荧光蛋白（GFP）表达质粒 pcDNA3-GFP 200 g 作为对照。术后第2、14 天分别解剖 pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠各 2 只取腹膜组织，荧光显微镜下观察 GFP 的表达；术后第14天解剖各组动物，观察肠黏连的发生情况。 结果 pcDNA3-HGF 质粒转染CHO细胞后 24 h 培养上清的 HGF 浓度达 40 ng/ml，该上清能够促进大鼠腹膜间皮细胞的迁移。pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠术后第 2 天腹膜组织中观察到 GFP 的表达，并持续到术后第 14 天。术后第14 天各组大鼠中均有发生不同程度肠黏连者，pcDNA3-HGF 10、50、100 和 200 g 组和 pcDNA3-GFP 200 g 组大鼠肠黏连发生率分别为 9/10、7/10、6/10、4/10和 9/10，其中重度（3 ~ 4度）肠黏连发生率分别为5/10、5/10、2/10、3/10、7/10，pcDNA3-HGF对术后肠黏连的预防效果呈一定的量效关系。 结论 质粒DNA能有效转染损伤腹膜并介导外源基因表达；质粒载体介导 HGF 基因转移是预防术后肠黏连的有效手段。     

金黄色葡萄球菌 eap 基因的克隆与表达

 目的 构建携带 eap 基因的原核表达载体，诱导表达具有活性的重组 EAP 融合蛋白。 方法 PCR 法扩增金黄色葡萄球菌基因组 DNA，回收、 纯化的扩增产物与 pMD18-T 载体相连接得重组质粒 pMD18-T-EAP，转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，酶切鉴定；未酶切组作为对照组重组质粒 pMD18-T-EAP 和 pET28a（+）表达载体分别用 Nde I 和 Xho I 限制性内切酶双酶切、连接，转化 E.coli BL21（DE3）感受态细胞，酶切鉴定；空载体作为对照组。用不同浓度（终浓度 1、2、4、8 mmol/L）和不同诱导时间（1、2、3、4、5、6 h）的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）对阳性重组菌进行表达优化，分别取 E.coli上清液和沉淀做电泳分析。应用 MagneHis^TM 蛋白纯化系统纯化重组 EAP 融合蛋白，并通过薄层扫描测定蛋白质的浓度。 结果 所获 eap 基因与 GeneBank 的基因序列同源性 > 99%；氨基酸同源性达 100%。重组质粒经 IPTG 诱导，阳性重组菌转化子均有表达；当吸光度（A ）值等于 0.6 ~ 0.8 时，相对分子质量约 70 000 处出现目的蛋白条带。破碎的重组菌 pET28a-EAP上清液中目的蛋白条带较清楚，沉淀中几乎看不到。终浓度 1 mmol/L 为最佳蛋白表达工作浓度。IPTG 诱导 1 h 重组 EAP 融合蛋白有一定量的表达，随着时间的延长，表达量增加不明显，3 h 时的表达量达最高，之后，蛋白表达量变化不明显。表达的重组 EAP 融合蛋白含量占全菌体蛋白的 29.6%。 结论 成功地克隆和表达了金黄色葡萄球菌重组 EAP 融合蛋白，为进一步研究以 EAP 蛋白作为免疫原预防和治疗由金黄色葡萄球菌引起的疾病奠定基础。     

鼻咽癌细胞中表达的人白细胞介素18(hIL-18)对鼻咽癌患者外周血 CD8+T细胞细胞毒活性增强作用的研究

目的探讨人白细胞介素18在鼻咽癌细胞中的表达能否提高鼻咽癌病人外周血CD8+T细胞的杀伤活性以及作用途径.方法构建人白细胞介素18的真核表达载体[pcDNA3.1(-)/hIL-18,转染人鼻咽癌细胞株SUNE;以转染的SUNE细胞和未转染的SUNE细胞为靶细胞,以鼻咽癌患者外周血的CD8+T细胞为效应细胞,混合培养12 h,用LDH释放法测定CD8+T细胞的细胞毒活性;用免疫组化法测定混合培养物中CD8+T细胞上Perlorin、Fas-L、Granzyme B的表达.结果所构建的真核表达载体在鼻咽癌细胞中能高效表达hIL-18;ELISA法测得转染阳性细胞培养上清液中hIL-18的含量为(85±10)pg/ml,而未转染的SUNE细胞的培养上清液中hIL-18的含量低于5 pg/ml.将表达hIL-18的SUNE细胞与鼻咽癌患者外周血CD8+T细胞混合培养12 h后,CD8+T细胞的细胞毒活性显著增强(P＜0.001),尤其是当效应细胞/靶细胞为101时,CD8+T细胞对转染的SUNE细胞的裂解率高达46.7%,而CD8+T细胞对未转染的SUNE细胞的裂解率仅为4.6%.免疫组化法表明,这种杀伤活性的增强与CD8+T细胞表达Perforin有关,而与Fas-L和Granzyme B途径无关.结论hIL-18能显著增强鼻咽癌患者外周血CD8+T细胞的体外杀伤活性,这种杀伤活性与CD8+T细胞表达Perlorin有关.     

卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与鼠 HSP70 融合蛋白的构建、表达及鉴定

 目的 构建卵巢癌抗独特型单链抗体 6B11ScFv 与小鼠热休克蛋白 70（mHSP70）融合蛋白 6B11ScFv/mHSP70,并初步鉴定其免疫活性。 方法 根据 Genebank 上已发表的 mHSP70 基因序列（NM_010478）合成引物行 PCR 扩增,以扩增所得 mHSP70 基因插入 pET30a（+）-6B11ScFv 质粒后转化入 E.coli DH5α,获得 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒。将鉴定正确的 pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70 重组质粒转化入 E.coli BL21（DE3）,获得 E.coli BL21（DE3）[pET30a（+）-6B11ScFv/mHSP70]重组菌株。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达并行 SDS-PAGE 分析,对表达产物进行复性和 Ni2+-NTA 柱亲和层析纯化后,采用蛋白质印迹法和 ELISA 方法进行鉴定和免疫活性检测。 结果 6B11ScFv/mHSP70 融合基因测序结果基本与理论序列相符。SDS-PAGE 分析显示,重组菌株表达产物相对分子质量与预期相符。复性、亲和层析纯化后的蛋白复性率达 20.9%,蛋白纯度达 95% 以上。蛋白质印迹分析证实 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白相对分子质量为 104 000,ELISA 检测表明其具有 6B11ScFv 和 mHSP70 的免疫 活性。 结论 构建表达的 6B11ScFv/mHSP70 融合蛋白具有良好的免疫活性,为进一步研究其体内外抗卵巢癌活性奠定了基础。     

人白细胞介素12双亚基共表达载体的构建及表达

目的 :为了基因治疗研究的需要构建人白细胞介素 12 (hIL 12 )双亚基基因共表达质粒 [(P( ) IL 12 ) ],比较它与单个亚基基因表达质粒 [P( ) P4 0 和P(- ) P35]1∶1共同转染肝癌细胞HepG2后 4 8小时表达结果。方法 :分别克隆hIL 12P4 0 、P35亚基cDNA全长至pcDNA3 1(± )中构建P( ) P4 0 和P(- ) P35,再将两者串联克隆至pcDNA3 1( )中构建P( ) IL 12。脂质体转染 3种质粒至肝癌细胞HepG2 ,4 8小时后抽取细胞总RNA做半定量RT PCR ,同时取细胞上清做ELISA及Western杂交 ,结果进行比较分析。结果 :两种转染方式均可以表达hIL 12蛋白质且半定量RT PCR显示较未转染组hIL 12的mRNA水平均增加 ;转染后 4 8小时P( ) IL 12组细胞培养上清hIL 12表达量较 [P( ) P4 0 和P(- ) P35]按 1∶1比例共同转染组显著增高(P <0 0 5 )。结论 :人白细胞介素 12双亚基基因串联共表达质粒 [P( ) IL 12 ]能够转入HepG2并表达hIL 12蛋白质 ,并且转染后 4 8小时hIL 12表达量较单个亚基基因表达质粒 [P( ) P4 0 、P(- ) P35]1∶1共转染者显著高。     

人白细胞介素-3基因cDNA的克隆及其真核表达质粒的构建

目的:克隆人白细胞介素-3(hIL-3)基因cDNA,构建其真核表达质粒pcDNA3/hIL-3。方法:从人外周血单个核细胞中提取IL-3mRNA,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增IL-3基因cDNA,通过T/A克隆法,首先构建pUCm-T/hIL-3,然后构建其真核表达型载体pcDNA3/IL-3。结果:pUCm-T/hIL-3内插入片段序列与hIL-3基因序列一致;pcDNA3/IL-3经酶切鉴定与预期结果一致。结论:成功完成了hIL-3基因克隆和pcDNA3/IL-3真核表达质粒的构建。     

真核表达的重组猪单链IL-12生物学活性的研究

目的:真核表达重组猪单链IL-12(pscIL-12)并鉴定表达的pscIL-12的生物学活性。方法:采用梭华-SofastTM将pcDNA3.1(+)-pscIL-12转入CHO-K1细胞,ELISA法测定细胞培养上清中pscIL-12的表达水平;MTT法检测细胞培养上清对NK细胞杀伤作用的影响;ELISA法测定细胞培养上清刺激人PBMC分泌IFN-γ的水平;流式细胞术(FCM)检测细胞培养上清对人淋巴母细胞增殖水平的作用。结果:融合基因pscIL-12在CHO-K1细胞中表达产物pscIL-12融合蛋白含量较高;生物学活性鉴定表明:pscIL-12融合蛋白可增强NK细胞活性、提高IFN-γ的产生和促进人淋巴母细胞的增殖。结论:转染pcDNA3.1(+)-pscIL-12质粒的CHO-K1细胞成功表达了具有良好生物学活性的pscIL-12。     

pDC316-hIL-12-IRES-CKb双顺反子重组腺病毒载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的: 构建含肌酸激酶(CK)基因和人白细胞介素12(hIL- 12 )基因的双顺反子重组腺病毒载体pDC316-hIL-12-IRES-CKb,并包装成重组腺病毒,检测其在肝细胞中蛋白表达和肝脏中磷酸肌酸的水平。方法: 将PCR 扩增的产物CK片段和hIL- 12 片段顺次插入双顺反子腺病毒载体(IES)中,经同源重组、包装和扩增获得重组腺病毒子。再用该病毒感染体外培养的兔肝细胞,经Western blotting检测到 CK 蛋白的表达和ELISA检测培养液中hIL-12水平。结果: 体外实验在感染肝细胞后检测到CK和hIL-12蛋白的表达;同时体内实验应用核磁共振波谱(MRS)的方法能检测到肝脏特异性CK产物磷酸肌酸的水平。结论: 携带CK和hIL- 12 基因的双顺反子重组腺病毒能使CK 基因异源性地表达在肝脏并能用非侵袭性的MRS技术检测其表达。此载体的构建为进一步研究CK基因作为一个影像报告基因动态监测肝脏治疗基因hIL-12的表达奠定基础。     

人白细胞介素21在真核细胞中表达及其体外促T细胞增殖作用

目的：构建人细胞因子IL-21表达载体并在Hela细胞中稳定表达，分析rhIL-21体外促T细胞增殖作用。方法：以已构建的pMD-1121为模板，PCR扩增成熟IL-21 cDNA的编码框序列并构建到真核表达载体pCDNA3．1／hismye-B中。挑出阳性克隆进行扩增，脂质体转染入Hela细胞中并以G418加压筛选。有限稀释法、RT-PCR及Western blot筛选出稳定表达的细胞株。培养上清液经金属离子螯合层析分离纯化后，SDS-PAGE、Westem blot鉴定。MIT法测定其与抗CD3单克隆抗体共刺激T细胞增殖活性。结果：SDS-PAGE、Western blot显示Mr为18000的带有myc重组人IL-21融合蛋白(rhIL-21)；并成功地获得hIL-21稳定表达细胞株。rhIL-21融合蛋白具有与抗CD3抗体共刺激T细胞增殖作用。结论：获得具有生物学活性的rhIL-21细胞因子，为进一步研究其功能奠定基础。     

携带mIL-12基因逆转录病毒载体的构建与表达

目的：构建携带小鼠IL-12（ mouse IL-12, mIL-12）基因逆转录病毒表达载体pLXmIL-12SN并检测其在B16F10细胞中的表达。 方法： 应用限制性内切酶从载体pGCp35-IRES-p40SN中酶切p35-IRES-p40（mIL-12基因片段）及将逆转录病毒载体pLXSN切开，通过连接酶连接，通过序列测定确定p35-IRES-p40基因片段正向插入载体pLXSN中的重组子，将阳性重组子转染B16F10细胞并通过RT-PCR方法检测mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结果： 成功地构建表达载体pLXmIL-12SN并可在mRNA水平检测到mIL-12基因在B16F10细胞中表达。 结论： 载体pLXmIL-12SN的构建成功及可在B16F10细胞中表达，为mIL-12基因治疗眼部疾病的研究奠定了基础和提供了借鉴。     

极低密度脂蛋白对HK-2细胞hUAT基因表达的影响

 目的 观察不同浓度极低密度脂蛋白（VLDL）是否调节肾小管上皮细胞（HK-2细胞）人尿酸盐转运子（hUAT）mRNA的表达。方法 根据培养液中所含VLDL浓度的不同，将HK-2细胞分为：①仅使用DMEM/F-12组（对照组）；②DMEM/F-12+ 50 μg/ml VLDL组（V1组）；③DMEM/F-12+100 μg/ml VLDL组（V2组）；④DMEM/F-12+200 μg/ml VLDL组（V3组）；⑤DMEM/F-12+400 μg/ml VLDL组（V4组）。每组均培养 6瓶细胞。上述细胞在不同培养液中分别培养48 h。采用实时荧光定量PCR检测HK-2细胞中hUAT mRNA的相对表达量（2^ΔΔCt法）。结果 所有标本均能检测到hUAT mRNA的表达，但V1～V4组hUAT mRNA表达水平均明显低于对照组，其中，VLDL最低浓度（50 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平为对照组的64%，VLDL最高浓度（400 μg/ml）组hUAT mRNA表达水平仅为对照组的24%。结论 VLDL下调hUAT mRNA表达，VLDL的这种作用可能与脂代谢紊乱易合并高尿酸血症有关。     

体内表达谷胱甘肽过氧化物酶-7型基因对骨髓抑制的防护作用研究

 目的 探讨体内表达谷胱甘肽过氧化物酶-7 基因（Gpx-7）对 5-氟尿嘧啶（5-Fu）引发小鼠骨髓抑制的防护作用。方法 以尾静脉注射5-Fu（250 mg/kg）的方法建立小鼠骨髓抑制和再生模型。5-Fu 注射后第 1 天，通过电穿孔转染法将 pcDNA3.1- Gpx7 重组质粒 50 μg 注入小鼠胫前肌（实验组），以 pcDNA3.1 空质粒载体 50 μg 电穿孔转染作为对照组，每组各 30 只小鼠。 5-Fu 注射前和注射后 3、7、11、14 d，2 组各断颈处死 6 只小鼠，计数小鼠外周血白细胞数、血小板数和单条腿骨髓细胞总数；然后分别取 5-Fu 注射后 7、14 d 断颈处死小鼠各 3 只进行骨髓细胞集落形成试验；并分别取 5-Fu 注射前和注射后 3、7、11、14 d 断颈处死的小鼠各 1 只制备完整大腿骨石蜡组织切片，观察骨髓组织形态学的变化。结果 注射 5-Fu 后 11 和 14 d，实验组外周血白细胞数分别为（3917 ± 733）和（6857 ± 1878）/μl，均明显高于同时点对照组[分别为（2683 ± 920）和（4017 ± 1011）/μl，均 P < 0.05）]；注射 5-Fu 后 11 d，实验组外周血小板数为（150.8 ± 64.3）万/μl，明显高于同时点对照组[（63.0 ± 60.3）万/μl，P < 0.05）]；注射 5-Fu 后不同时间 2 组间单条腿骨髓细胞总数差异无统计学意义。注射 5-Fu 后 7、14 d，2 组之间骨髓细胞集落形成数差异无统计学意义。 实验组注射 5-Fu 后 11 d 小鼠的骨髓组织形态恢复程度与对照组注射 5-Fu 后 14 d 小鼠类似；注射 5-Fu 后 14 d 小鼠的骨髓组织形态接近注射前。 结论 体内表达 Gpx-7 基因可以促进被化疗药物 5-Fu 抑制的小鼠骨髓再生。     

带c-Myc标签的Mdfic基因真核表达载体构建及其在成肌细胞中的表达

目的构建新型转录因子Mdfic和c-Myc标签融合表达的真核表达载体pcDNA3.1-Mdfic-Myc,实现其在成肌细胞C2C12中的表达。方法 PCR方法扩增Mdfic的开放阅读框,酶切后的PCR扩增产物和退火后的人工合成的c-Myc标签共同克隆至pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,构建pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒。重组质粒经过PCR、双酶切和测序鉴定后,脂质体法转染C2C12细胞。RT-PCR和Western blotting方法检测转染后细胞中Mdfic-Myc的表达。结果成功构建了pcDNA-Mdfic-Myc真核表达质粒;RT-PCR和Western blotting结果表明,Mdfic-Myc融合蛋白在成肌细胞C2C12中获得高效表达。结论 pcDNA3.1-Mdfic-Myc融合表达质粒的成功构建及其在成肌细胞中的表达为进一步体外研究Mdfic蛋白单独的功能及其与其他分子间功能性相互作用奠定了基础。