三株登革2型病毒广东分离株结构蛋白E基因序列测定及分析

目的对广东省分离的3株登革2型病毒(DEN2)的结构蛋白E基因扩增、克隆、测定及分析,了解流行株之间的相互关系及基因型.方法应用RT-PCR技术扩增广东省不同年份流行的3株DEN2型病毒的结构蛋白E基因.分别克隆到PMD18 T载体,转化JM109宿主菌,挑取阳性克隆进行鉴定及序列测定.结果3株DEN2病毒结构蛋白E基因序列长度均为1 485 bp,编码495个氨基酸.其核苷酸(氨基酸)的同源性分别是GD06/93与GD19/2001为98%(98%)、GD06/93与GD08/98为92%(95%)、GD08/98与GD19/2001为91%(94%).3株DEN2与国际参考株比较表明GD06/93与澳大利亚TSV01株共享序列非常接近,核苷酸(氨基酸)的同源性为99%(99%);GD19/2001和澳大利亚TSV01株核苷酸(氨基酸)的同源性为98%(98%);GD08/98与泰国株ThNH-P28/93核苷酸(氨基酸)同源性为98%(98%).结论GD06/93、GD19/2001与TSV01亲缘关系较近,属同一基因型.GD08/98与TnNH-P28/93共享序列非常接近,属同一基因型.     

疏水性区域及稀有密码子对登革2型病毒E基因原核表达影响的分析

登革病毒E蛋白是病毒主要毒力蛋白,带有型特异及属特异抗原决定簇,既能诱导宿主产生保护性的中和抗体,又能诱导产生血凝抑制抗体,与登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)的致病机制有关[1].有学者已经利用包括大肠埃希菌、毕赤酵母、昆虫细胞等多种表达系统对其表达条件进行了探讨,由于受未知因素的影响,登革病毒E蛋白的原核重组表达一直不理想[2～4].本研究对登革病毒E蛋白不同区域的原核表达进行了较为系统的分析,探讨疏水性区域及稀有密码子登革病毒E蛋白表达的影响,并对部分区域进行了高效原核表达.广东省科技计划项目(20006836008005);全军医药卫生科研基金资助课题(06MA129)     

广东省2006年登革热流行病学分析

目的通过分析广东省2006年登革热的流行特点和流行因素,为今后进行有针对性的预防控制提供依据。方法通过广东省登革热疫情监测报告系统收集广东省2006年登革热的流行资料,并进行描述性流行病学分析。实验室资料来自广东省、广州市疾病预防控制中心微生物实验室。结果2006年广东省疫情监测报告系统共报告登革热病例1 010例,年发病率为1.10/10万,无死亡病例,其中发生10例以上的暴发疫情共14起。疫情涉及广州、汕头、佛山等7个市。全省从8月下旬至11月上旬共经历3个发病高峰,3个高峰依次降低。病例无明显性别差异,年龄以20~39岁为主(41.5%),职业以家务及待业人员、工人、农民、学生为主。14例输入性病例的输入地来自柬埔寨、越南、印尼、马来西亚等7个国家。实验室检测发现,2006年广东省登革病毒的流行株均为登革Ⅰ型,各1例输入性病例分别分离出登革Ⅰ、Ⅲ型毒株,其与本地检测的流行株无关联。结论广东省2006年登革热流行呈波及面广、输入病例与本地传播并存、散发与多点暴发并存及季节性等特点,尚无明确证据表明广东省已成为地方性登革热流行区。     

广东省2001-2006年登革热流行病学分析

目的分析广东省近年来登革热疫情特点及流行规律,为制定预防控制措施提供依据。方法收集广东省2001-2006年登革热疫情资料,用描述性流行病学方法分析其流行特征和流行因素。结果2001-2006年广东省共报告登革热本地病例2 897例,报告外地病例320例,年发病率在0.01/10万~1.77/10万之间。疫情涉及12个市,主要集中于广州(73.89%)、汕头(6.99%)、阳江(5.10%)、中山(4.78%)等市。3-12月均有病例报告,6-11月为流行期,8-10月为发病高峰期(占88.90%)。男女性别比例为1∶1.07;各年龄组均有发病,但发病数以15~54岁年龄组居多(占73.72%),发病率以20~44、60~69岁年龄人群居高;职业以家务及待业、农民、学生、工人和离退人员为主。每年均有国外输入病例报告,病例输入地主要以新加坡、印尼、柬埔寨等东南亚地区为主。51起本地暴发疫情中,除1起疫情为登革Ⅱ型病毒引起外,其余均为登革Ⅰ型病毒引起。结论广东省登革热仍为输入或输入引起的本地传播的传染病,珠江三角洲和粤东地区应为广东省登革热预防控制的重点地区。     

广东省2006-2011年登革热时空分布特征

目的分析2006-2011年广东省登革热的时空分布特征,为登革热防控提供科学依据。方法计算2006-2011年广东省登革热县（区）级年发病率水平,利用空间自相关分析确定登革热高风险地区。结果广东省珠江三角洲和韩江三角洲登革热发病率分别为〉4/10万和〉2.5/10万,Moran’sⅠ统计量在2006-2007年（P=0.005）和2009-2011年（P=0.001）有统计学意义,2007-2008年无统计学意义（P=0.814）。结论广东省登革热分布是非随机的,珠江三角洲和韩江三角洲是登革热的高危地区。     

广东省麻疹病毒血凝素基因的序列分析

目的 探讨广东省麻疹病毒的基因型别和特征。方法 对2000年和2001年分别在广东省中山和韶关地区分离的两株麻疹病毒，通过RT－PCR方法扩增麻疹病毒血凝素（H）基因全序列，并克隆pMD18-T Vector进行序列测定；并分析这两株麻疹病毒和Genbank中麻疹病毒的各基因型代表株序列的同源性。结果 两株广东麻疹流行株H基因之间同源性为97％，和它们在核苷酸水平上同源性最高的毒株分别是China93-4和China94-7，达到99％。和其它已知麻疹病毒的21个基因代表株相比，广东省麻疹毒株在核苷酸水平上最大变异为7．0％，其中广东省2000年流行株在氨基酸240位由丝氨酸（S）突变成天门酰胺（N），造成一个N型糖基化位点丢失。结论 广东省麻疹流行株属于H1基因型。     

浙江省2006年乙型流感病毒的分子变异和抗原特性研究

2006年浙江省乙型流感的流行强度明显较往年增强,为明确2006年浙江省乙型流感病毒流行株的分子进化特征,分析其发生暴发的原因,我们对当年从各地市分离的乙型流感病毒进行了抗原及基因特征分析,并与2005年分离毒株进行比较.     

2019年广西7份本地感染登革病毒E基因特征分析

目的 了解2019年广西本地感染登革病毒(Dengue virus,DENV)E基因特性,探索可能的输入来源。方法 采用实时荧光定量PCR（real - time fluorescence quantitative PCR,RT - qPCR）方法对广西本地感染登革热病例急性期血清样本进行病毒核酸检测并分型,扩增登革病毒 E基因后测序,测序结果与不同地区和国家的参考株进行同源性比较和系统进化分析。结果 53份登革热病例血清标本经RT - qPCR分型,结果42份（79.2%,42/53）登革病毒核酸阳性,其中南宁9份、梧州10份、玉林17份、崇左6份,均为DENV - 1型,其余11份为登革病毒核酸阴性,42份DENV - 1型阳性核酸样本经过E基因扩增共得到7份,其中南宁市1份、梧州市1份、玉林市2份、崇左市3份,进化分析结果显示7份样本均为DENV - 1型Genotype Ⅰ基因型,其中DENV1/GXNN/007/2019、DENV1/GXWZ/009/2019、DENV1/GXYL/011/2019、DENV1/GXYL/012/2019与2019年广东株（序列号:MN921500）同源性99.94%～100.00%,DENV1/GXCZ/015/2019、DENV1/GXCZ/016/2019、DENV1/GXCZ/017/2019与 2015年印度尼西亚株（序列号:MG894852）同源性达99.60%,与1945年夏威夷参考株（序列号:AF425619）比较存在12处氨基酸位点变异。结论 2019年广西登革病毒是Genotype Ⅰ基因型,推测病毒从广东和东南亚国家输入导致的本地流行,应加强登革热跨省、跨境传播的防控。     

贵州省B3基因型麻疹病毒分子特征

目的 分析贵州省2014年首次发现B3基因型麻疹病毒分子特征。方法 采集咽拭子经实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)筛查麻疹病毒核酸。用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增麻疹病毒核酸筛查阳性咽拭子,对麻疹病毒N基因羧基末端634个核苷酸片段进行扩增,对扩增产物进行序列测定和分析,构建基因亲缘性关系树。结果 Guizhou14-06(MVs/Guizhou.CHN/11.14/01)在亲缘关系上与WHO B3基因型参考株MVi/Ibadan.NGA/0.97/1(AJ232203)同属一个分支,与MVi/Ibadan.NGA/0.97/1(AJ232203)的核苷酸和氨基酸差异分别为2.00%和2.67%;与中国目前的优势流行参考株MVi/Hunan.CHN/0.93/7(AF045212)的核苷酸和氨基酸差异分别为10.8%和12.0%;与其他WHO 22个基因型参考株的核苷酸和氨基酸差异分别为4.40%~11.0%和4.67%~12.0%。结论 B3基因型麻疹病毒是贵州省首次发现的新基因型麻疹病毒,丰富贵州省麻疹病毒分子流行病学基线数据,并有助于麻疹病毒的控制和消除工作。     

2013-2016年广东省登革病毒血清I型分布特征

目的 对2013-2016年广东的登革病毒血清I型序列进行分子流行病学分析,研究血清I型登革病毒在广东省的流行特征。方法 分离获得2013-2016年登革病毒血清I型序列,建立全球登革病毒血清I最大似然树,预测第2簇病毒的进化速率、共祖位置;使用PAML软件计算选择压力。结果 2013-2016年的广东序列分别聚类在11簇分支中,其中8簇为基因I型毒株、1簇基因IV型毒株、2簇基因V型毒株,且与东南亚国家分离的序列聚类在一起。第2簇病毒表现出一定的独特性,最大置信树以及时空动态图显示这簇株系最早是由泰国传入广州,之后又在广东地区流行。第2簇病毒的相对进化速率要比文献报道的DENV-1基因I型的进化速率要大,但该簇病毒的序列不存在正选择压力。结论 广东地区流行的登革病毒主要是从东南亚国家输入,同时发现一簇疑似本地化的株系,具有部分本地化的特征,包括:跨年传播、独立成簇,但还需要更多的证据去判定登革热是否已形成本地化。     

福建口岸输入登革I型病毒E基因序列分析

目的研究分析福建口岸输入登革I型病毒E基因序列,为登革热诊断的分子溯源提供参考。方法收集2012—2013年福建口岸截获的7例入境Ⅰ型登革热病例资料及血清标本,用C6/36细胞培养分离病毒,提取病毒RNA,用RT-nested-PCR扩增包含E基因全长的核酸片段,扩增产物经纯化、测序,用生物学软件进行DNA序列比对分析。结果用C6/36细胞从7例登革热病例血清中成功分离出7株登革病毒株,经RT-nested-PCR证实均为DENV-Ⅰ型,构建E基因全长进化树分析发现,分离株与新加坡、越南和菲律宾等地的病毒株同源性最高,与病例入境时进行的流行病学调查资料完全吻合。结论从分子水平证明登革热病例血清中分离到的毒株为DENV-Ⅰ型病毒,结合流行病学调查资料,证实均为输入性感染病例,最有可能来源于东南亚一带。     

广东和香港地区2004-2006年输入性登革热病例流行病学分析

目的 对广东和香港(粤港)地区2004-2006年报告的输入性登革热病例情况进行流行病学分析及比较.方法 通过广东省登革热疫情监测报告系统收集广东省输入性登革热的流行资料,香港的资料由香港卫生署卫生防护中心提供;对收集到的两地资料进行描述性流行病学分析.结果 2004-2006年广东省报告输入性登革热病例数44例,香港报告93例;广东省病例的输入国主要是新加坡(13例)、印度尼西亚(9例)、柬埔寨(6例),香港病例的输入国主要是印度尼西亚(31例)、菲律宾(16例)、泰国(15例);两地发病高峰期均为7-9月,非高峰期香港的病例数高于广东省;两地病例的男女性别比:广东省1.2:1,香港1.1:1;广东省病例年龄从6～80岁,大部分为20～39岁(占63.6%,28/44),职业以商业及服务业、家务及待业为主(占40.9%,18/44);香港病例年龄从10～72岁,大部分为20～39岁(占58.1%,54/93),职业以商业及服务业、工人为主(占47.3%,44/93);广东省入境前发病的病例比入境后发病多(27:17),而香港入境前发病的病例比入境后发病少(35:57);两地病例从发病到诊断的平均时间间隔分别为7 d和9 d.结论 造成粤港两地登革热输入的主要原因是旅游及商务人员在夏季与东南亚国家之间的频繁往来.     

云南省中缅边境2015年一起登革热暴发的分子特征分析

目的 对2015年云南省中缅边境一起登革热暴发查明病因,对流行的登革病毒(DENV)进行分子特征分析,为疾病防控提供病原学证据。方法 采用半巢式RT-PCR方法检测2015年7月云南省耿马县孟定镇DENV NS1抗原阳性血清中的DENV特异核酸(CprM基因),对阳性标本用DENV E基因特异引物进行扩增,并将PCR产物送测序,经拼接剪切后的序列在NCBI网站进行BLAST比对,在Megalign中计算核苷酸相似性;在GenBank中选出不同国家和地区不同年度的DENV E基因序列作为参考序列,在Mega 5.05 软件中采用邻接(NJ)法构建系统进化树。结果 对25份中国云南省耿马县孟定镇本地病例和14份缅甸输入病例DENV NS1抗原阳性的血清标本进行DENV特异核酸检测,共有21份本地和10份缅甸输入病例标本为DENV-1阳性,其余8份为DENV阴性。测序得到13株(8株来源于本地病例,5株来源于输入病例)1 485 bp的E基因序列,核苷酸相似性为100%,12株(9株来源于本地病例和3株来源于输入病例)406 bp的CprM基因序列,核苷酸相似性为100%。系统进化分析显示,13株E基因序列均属于DENV-1的基因Ⅰ型,位于独立的进化分支。结论 本次登革热暴发由DENV-1的基因Ⅰ型引起,该病毒与相邻缅甸区域流行的DENV进化关系最近,当地需加强对登革热防控的综合措施,以防止登革热疫情的进一步扩散。     

湖南省2018年登革热本地暴发流行病学和病毒分子特征分析

目的 对湖南省2018年登革热本地暴发疫情进行流行病学及病原学特征研究。方法 对报告的8例疑似登革热病例进行实验室诊断,对病例密切接触者搜索出的186例疑似登革热病例和发热病例开展病原学监测,应用C6/36细胞对病例急性期血清开展病毒分离,对15株登革病毒株E基因测序,分析病毒的血清型别和基因亚型,构建系统发生树,分析可能的传播来源。在疫点开展蚊媒密度应急监测和健康人群回顾性血清流行病学调查。结果 8例疑似病例血清标本,6例登革病毒核酸阳性,4例登革病毒NS1抗原阳性。186例疑似登革热病例,96例病原学检测结果阳性,分离到登革病毒株64株,经鉴定全部为登革病毒2型全球型,来源于广东和浙江省的可能性较大。应急蚊媒密度监测,疫点布雷图指数最高达65,具有极高的登革热传播风险。回顾性调查377名健康人群进行登革热抗体水平监测,IgG抗体阳性率为0.53%（2/377）。结论 现场流行病学调查和分子遗传分析提示,湖南省2018年本地暴发疫情由输入性病例引起,由单一的登革病毒2型全球型引起。     

浙江省2005-2010年风疹病毒分子流行病学研究

目的 分析2005-2010年浙江省风疹病毒流行株的病原学与分子流行病学特征。方法采集该期间风疹疫情中的疑似患者标本,于Vero细胞上分离病毒。采用巢式RT-PCR扩增流行株E1、E2和C三个结构基因片段,对扩增产物进行序列测定与分析。结果从52例临床标本中共分离到风疹病毒流行株7株,除Rvi/Zhejiang.CHN/23.08株为2B基因型外,其余6株均属于IE基因型。基因进化树上,IE基因型流行株分别与香港、海南地区流行株具有最近亲缘关系,而2B基因型流行株与BuenosAires.A RG/46.08位于同一分支。遗传距离分析表明,浙江2B型流行株与全球其他地区流行株间的遗传距离(0.011)小于与中国流行株(0.023)间的遗传距离。浙江风疹流行株与中国风疹疫苗株BRDⅡ在核苷酸水平上的同源性为C＞E2＞E1,而氨基酸水平上的同源性为E1 ＞C＞E2,对应存在3、11和23个氨基酸的变异。各位点氨基酸熵值表明,E1蛋白上仅存在一个易变位点（熵值＞0.600）,而E2蛋白上有7个易变异位点和1个高变异位点(熵值＞1.000)。结论2005-2010年浙江省存在两种基因型风疹病毒流行,IE为优势基因型,2B可能为境外输入株。流行株E1基因氨基酸序列相对保守,而E2基因氨基酸变异较大,在风疹病毒流行病学监测中除关注E1基因外,应开展对结构基因E2和C的研究。     

DEN-2分离株E基因部分序列原核蛋白表达

目的 通过构建登革2型病毒(DEN-2)临床分离株(B株)E基因区1-476bp的原核表达载体,进行原核表达,为DEN-2E蛋白功能的研究提供基础依据。方法 将DEN-2B株E基因区部分序列克隆入原核表达载体pET28a(+),命名为pET28a(+)-Eb;经酶切、PCR及测序鉴定后转化BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)鉴定表达蛋白;对表达蛋白进行纯化,并滴定对C6/36细胞的细胞半数致死量(TCID50)。结果 成功构建了pET28a(+)-Eb原核表达重组质粒;SDS-PAGE分析表明,E基因区部分序列获得高效表达,其相对分子量约为23kDa,表达量约占菌体总蛋白的29%;Western blot表明,该目的蛋白可与DEN-2鼠单克隆抗体结合。用Ni柱亲和层析法纯化原核表达蛋白,纯度达90%。DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞的TCID50为10-5.31。结论 pET28a(+)-Eb可在BL21(DE3)菌株中高效表达;DEN-2B株E基因部分序列原核表达蛋白对C6/36细胞有明显的细胞毒作用。     

Isolation of ancestral sylvatic dengue virus type 1, Malaysia

Ancestral sylvatic dengue virus type 1, which was isolated from a monkey in 1972, was isolated from a patient with dengue fever in Malaysia. The virus is neutralized by serum of patients with endemic DENV-1 infection. Rare isolation of this virus suggests a limited spillover infection from an otherwise restricted sylvatic cycle.     

广东省流行的3株登革热2型病毒基因组全序列测定及分析

目的测定广东省3株登革热2型病毒的全序列,探讨其来源及基因型。方法运用RT PCR法扩增来自广东省的登革热2型GD09/93、GD05/98和GD19/2001病毒株的全序列,采用遗传距离法构建进化树。结果3株登革热2型病毒的全基因组长度均为10 723 nt,5′及3′端各有一非编码区,结构基因和非结构基因位于基因组97~10 269 nt之间,共编码3391个氨基酸,读码结构完全相同。GD05/98与GD09/93、GD05/98与GD19/2001、GD09/93与GD19/2001之间的碱基序列同源性分别为93.3%、92.4%和97.6%,氨基酸序列同源性分别为96.7%、96.5%和98.5%。结论3株登革热2型病毒均对乳鼠致病,与对乳鼠不致病的参考株（DEN2-04株）比较共有18个氨基酸位点的差异引起极性或电荷变化,PrM-134、NS2A-153、NS4B-102所带电荷的变化对抗原性影响较大。GD05/98株与泰国分离株同为Ⅱ基因型,GD09/93和GD19/2001株与印度尼西亚、澳大利亚、台湾株分在Ⅳ基因型;表明我国登革热2型病毒有不同的基因型,而不同时期也存在同一种基因型传播。     

New dengue virus type 1 genotype in Colombo, Sri Lanka

The number of cases and severity of disease associated with dengue infection in Sri Lanka has been increasing since 1989, when the first epidemic of dengue hemorrhagic fever was recorded. We identified a new dengue virus 1 strain circulating in Sri Lanka that coincided with the 2009 dengue epidemic.     

2020年广州市登革热流行状况和病毒E基因进化特征分析

目的:分析2020年广州市登革热流行状况和病毒E基因进化特征,探讨广州市登革热的流行特征和病毒传播特点。方法:通过中国疾病预防控制信息系统传染病报告信息管理系统收集登革热病例信息,采用荧光定量PCR检测血清标本并测定登革病毒E基因序列,运用MEGA 5.05软件构建最大相似度基因树,使用SPSS 20.0软件进行统计学...