siRNA 抑制胃腺癌VEGF2C 表达和淋巴管生成

 目的　研究瘤内注射VEGF2C siRNA 抑制胃癌移植瘤VEGF2C 表达和肿瘤淋巴管生成的有效 性。方法　建立裸鼠胃癌皮下移植瘤模型随机分为4 组:VEGF2C siRNA 脂质体混合液组、单脂质体 组、单siRNA 组和PBS 组,对肿瘤进行原位注射干预,记录各实验组肿瘤体积变化,免疫组织化学法检 测各实验组肿瘤组织VEGF2C 的表达,并通过抗人CD31 和抗人L YVE21 单克隆抗体检测瘤体内血管 和淋巴管生成情况。结果　免疫组化显示干扰组肿瘤细胞VEGF2C 染色减弱,和对照组相比VEGF2C 表达下调68. 3 %( P < 0. 01) ,而胃癌组织中淋巴管密度(LVD) 值干预组和对照组分别为3. 2 ±1. 3 、9. 8 ± 2. 7 ,VEGF2C siRNA 干预组LVD 值下降至对照组的32. 7 %( P < 0. 01) ,而MVD 值无明显差异( P > 0. 05) 。结论　瘤内注射VEGF2C siRNA 能显著下调肿瘤组织内VEGF2C 的表达,有效抑制肿瘤生长 和瘤内淋巴管生成,而对肿瘤血管生成无影响。     

血管内皮生长因子-C干扰对人类结肠癌裸鼠移植瘤模型淋巴管生成的影响

 目的　构建携带有RNA干扰片段的腺病毒载体Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP,探讨人类结肠癌BALB／c裸鼠皮下移植瘤模型瘤内注射腺病毒载体Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP抑制血管内皮生长因子-C（VEGF-C）表达、结肠癌生长以及结肠癌淋巴管生成的效果。方法　选择针对人类VEGF-C mRNA的特异性siRNA靶序列,设计合成其相应的双链DNA,利用 BamHI、HindⅢ双酶切插入pDC316-EGFP-U6载体后构建穿梭质粒pDC316-VEGF-C siRNA-EGFP-U6,再与骨架质粒pBHGF35共转染293细胞,同源重组,酶切鉴定,包装扩增后得到重组腺病毒Ad5F35-VEGF-C siRNA-EGFP-U6。裸鼠皮下注射LoVo细胞构建人类结肠癌皮下移植瘤模型24只,随机分为4组（每组6只）：以腺病毒、空病毒、裸siRNA以及PBS分别进行瘤内原位注射干预,计算肿瘤体积变化并绘制生长曲线,使用抗LYVE-1单抗和抗CD34单抗分别染色瘤内的血管和淋巴管,检测瘤内淋巴管和血管生成情况,计算微血管密度（MVD）,微淋巴管密度（LVD）。结果　腺病毒组肿瘤体积明显小于其他各组,腺病毒组与PBS对照组LVD 分别为8.47±2.1,17.35±4.7（P＜0.05）,腺病毒组与PBS对照组MVD分别为22.65±6.04,23.19±7.63（P＞0.05）。结论　实验设计并合成的腺病毒载体介导的VEGF-C siRNA,在人类结肠癌裸鼠移植瘤模型中,瘤内注射腺病毒载体能显著抑制移植瘤的生长和肿瘤淋巴管生成,而对肿瘤血管生长无显著影响。     

VEGF-C反义寡核苷酸抑制人胃癌裸鼠移植瘤淋巴管生成的实验研究

目的:探讨VEGF-C反义寡核苷酸(VEGF-C-ASODN)对人胃癌裸鼠移植瘤淋巴管生成的影响。方法:构建人胃癌裸鼠移植瘤模型,反义组在接种部位皮下注射VEGF-C-ASODN,正义组和对照组分别注射VEGF-C正义寡核苷酸和生理盐水,观察移植瘤生长变化。半定量RT-PCR检测移植瘤VEGF-CmRNA表达,酶组织化学方法(5'-Nase-ALPase)染色行淋巴管计数。结果:反义组移植瘤生长缓慢,体积和重量分别为(387.57±166.29)mm³、(1.4±0.7)g,较正义组和对照组显著下降(P<0.01)。反义组VEGF-CmRNA表达的相对系数为(0.35±0.12),淋巴管计数为(14.37±4.21),较正义组和对照组均显著降低(P<0.01)。结论:VEGF-C-ASODN可抑制人胃癌裸鼠移植瘤的生长及淋巴管的生成。     

VEGF-C基因沉默对裸鼠移植乳腺癌淋巴管和血管生成影响的观察

目的:探讨血管内皮生长因子C(VEGF-C)基因沉默对裸鼠移植乳腺癌淋巴管和血管生成的影响.方法:构建VEGF-C小分子干扰RNA(VEGF-C/SiRNA)慢病毒载体,转染靶细胞MCF-7,Real-time PCR检测VEGF-C敲减效率,将其接种于裸小鼠背部皮下(KD组),并设置MCF-7细胞对照组(CON组)及空载体对照组(NC组),观察裸小鼠的成瘤情况,通过免疫组化检测VEGF-C表达、微血管密度(MVD)及微淋巴管密度(LVD).结果:VEGF-C/SiRNA转染MCF-7细胞后,与对照组相比,VEGF-C表达显著降低,敲减效率为49.2％,P=0.017.接种后各组细胞均能成瘤,KD组6只,NC组7只,CON组8只,成瘤情况差异无统计学意义,P=0.631.HE染色结果显示,KD组可见肿瘤细胞明显减少,出现较多凋亡和坏死细胞.免疫组化检测显示,CON组VEGF-C蛋白表达(+)1只,(++)1只,(+++)4只:NC组表达(++)1只,(+++)5只;KD组表达(+)5只,(++)1只,KD组移植瘤VEGF-C蛋白表达显著低于对照组,P=0.02.肿瘤组织内LVD计数,KD组5.33±1.63,CON组8.50士1.05,NC组8.17±1.83,KD组显著低于NC组和CON组,差异有统计学意义,P=0.005;MVD计数,KD组8.83±1.72,CON组11.02±1.41,NC组11.17±2.48,KD组MVD略低于CON组及NC组,但差异无统计学意义,P=0.097.结论:慢病毒介导的VEGF-C/siRNA可有效敲减VEGF-C表达,显著减少乳腺癌组织的淋巴管生成,但对血管生成无显著影响.     

肾细胞癌组织VEGF-C表达与淋巴管生成和淋巴转移的相关性

目的:应用特异的淋巴管内皮标志podoplanin检测肾细胞癌(RCC)组织中淋巴管,用淋巴管密度(LVD)表示淋巴管生成情况, 探讨RCC 内VEGF-C表达与淋巴管生成和淋巴转移的关系.方法:收集45例RCC和10例肾外伤致肾切除的正常肾组织标本,应用免疫组化检测VEGF-C、podoplanin 的表达,计算VEGF-C阳性表达率及淋巴管密度值,分析两者的关系.结果:RCC 组织内VEGF-C 阳性表达率(71.1%) 显著高于正常肾组织(10.0%),P<0.01,高中分化(70.6%) 和低分化(72.7%) 之间差异无统计学意义,P>0.05,淋巴结阳性组中VEGF-C阳性率(81.3 %)显著高于淋巴结阴性组(65.5%),P<0.05.RCC组织内LVD(6.8±1.3) 显著高于正常肾组织(1.2±0.3),P<0.01;VEGF-C阳性组LVD(7.6±1.5)显著高于VEGF-C 阴性组(4.7±0.9),P<0.05, 淋巴结阳性组LVD (8.3±1.4) 显著高于淋巴结阴性组(5.1±1.1),P<0.05.结论:淋巴管生成可能是RCC淋巴结转移的重要因素,VEGF-C参与RCC淋巴管生成,从而促进淋巴结转移.     

ET-1和VEGF-C在喉癌中的表达及临床意义

目的:研究血管内皮素-1(ET-1)和血管内皮生长因子-C(VEGF-C)在喉癌组织中的表达规律,探讨两者与喉癌发生、发展和淋巴结转移的关系及在预后中的意义。方法:选择45例经病理确诊的喉癌组织为实验组,20例喉良性病变组织为对照组,免疫组化法和实时荧光定量PCR法检测ET-1和VEGF-C蛋白和mRNA的表达,5’-核苷酸酶染色法(5’-Nase)计数淋巴管密度(LVD),CD34染色计数微血管密度(MVD),并结合临床病理特征和生存资料进行相关分析。结果:喉癌淋巴结转移组ET-1、VEGF-C蛋白和mRNA表达显著高于未转移组(P<0.05),二者均显著高于良性喉组织(P<0.01)。喉癌组织中ET-1蛋白表达与瘤内和瘤周LVD、MVD、淋巴结转移、淋巴管浸润、TNM临床分期显著相关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤部位及组织学分级无关(P>0.05)。VEGF-C蛋白表达与瘤内和瘤周LVD、淋巴结转移、淋巴管浸润、MVD显著相关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤部位、TNM临床分期及组织学分级无关(P>0.05)。ET-1和VEGF-C在肿瘤组织中的蛋白表达正相关(r=0.456,P=0.001)。生存分析显示ET-1蛋白阳性表达与生存率无关(P>0.05),ET-1+/VEGF-C+、VEGF-C蛋白阳性表达与生存率负相关(P<0.05),其中ET-1+/VEGF-C+阳性表达更具有显著高危死亡率(P=0.000)。Cox回归模型显示ET-1+/VEGF-C+可以独立影响预后(P<0.05)。结论:ET-1和VEGF-C均能促进喉癌淋巴管生成和血管生成。在喉癌组织中ET-1过表达可能通过诱导VEGF-C表达上调促进喉癌淋巴管生成和淋巴结转移。联合检测ET-1及VEGF-C的表达可成为判断喉癌预后的新的生物学指标。     

姜黄素对宫颈癌裸鼠移植瘤淋巴管生成及淋巴转移的影响

目的:探讨姜黄素对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤淋巴管生成及淋巴道转移的影响。方法:取对数生长期CaSki细胞接种于裸鼠右腋窝皮下,建立人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤模型,免疫组化方法检测移植瘤组织中VEGF-C和VEGFR-3蛋白表达情况。结果:免疫组化显示姜黄素处理组的肿瘤组织VEGF-C、VEGFR-3蛋白表达水平较阴性对照组降低(P<0.05)。可见姜黄素能下调肿瘤细胞中VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表达。结论:姜黄素具有抗宫颈癌淋巴管生成的作用,对宫颈癌淋巴道转移具有抑制作用,其主要机制与抑制VEGF-C和VEGFR-3蛋白的表达有关。     

Ⅱ、Ⅲ期直肠癌组织中肿瘤淋巴管生成与COX-2和VEGF-C表达的关系

目的 探讨Ⅱ、Ⅲ期直肠癌组织中肿瘤淋巴管的生成与环氧化酶-2 (COX-2)和血管内皮生长因子-C (VEGF-C)表达的关系.方法 应用免疫组化方法测定肿瘤淋巴管密度(LVD)及Ⅱ、Ⅲ期直肠癌组织COX-2和VEGF-C的表达.结果 (1)直肠癌肿瘤旁LVD为15.3±5.8,显著高于直肠癌肿瘤周边区LVD(P<0.01),并且与淋巴结转移及预后相关;(2)直肠癌肿瘤旁LVD与VEGF-C、COX-2的表达不相关.结论 直肠癌肿瘤旁LVD与直肠癌的淋巴结转移和预后密切相关.     

VEGF-A/VEGF-C反义脱氧寡核苷酸对乳腺癌生长及其脉管生成的影响

背景与目的:肿瘤脉管生成与肿瘤的生长和转移密切相关,血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor-A,VEGF-A)可能是最强的促血管生成因子,而VEGF-C是VEGF家族中最强的促淋巴管生成因子,在肿瘤血管生成中与VEGF-A具有协同促进效应.本研究旨在探讨VEGF-A/VEGF-C反义脱氧寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleoude,ASODN)对乳腺癌生长及其脉管生成的影响.方法:将VEGF-A/VEGF-C ASODN注入人乳腺癌裸鼠原位移植癌模型中,观察肿瘤生长;运用RT-PCR法检测肿瘤组织VEGF-A/VEGF-C mRNA表达,免疫组织化学法检测其蛋白表达情况;5'-Nase-ALPase双重酶组织化学染色标记肿瘤微血管和微淋巴管,并计算肿瘤微血管密度(microvessel density,MVD)和微淋巴管密度(lymphatic microvessel density,LMVD).结果:反义组成瘤时间较对照组长[(13.00±2.83)天vs.(7.67±1.63)天,P＜0.05],移植瘤生长速度较对照组缓慢,肿瘤重量明显低于对照组[(0.45±0.14)g vs.(0.92±0.37)g,P＜0.05],抑瘤率达51.09%;反义组VEGF-A和VEGF-C mRNA及蛋白表达较对照组明显减弱(P＜0.05),且MVD(21.83±2.86 vs.41.33±4.03)及LMVD(18.67±4.67 vs.31.83±2.33)显著低于对照组(P＜0.05).结论:VEGF-A/VEGF-C ASODN通过抑制VEGF-A及VEGF-C表达抑制乳腺癌脉管生成,进而抑制肿瘤生长.     

鼻咽癌组织VEGF-C和VEGFR-3表达与临床病理因素相关性分析

目的:探讨鼻咽癌(NPC)组织VEGF-C和VEGFR-3的表达,及其和淋巴管密度(LVD)与临床病理参数的关系。方法:采用免疫组织化学PV-9000二步法检测55例NPC患者放疗前活检组织石蜡标本中VEGF-C和VEGFR-3的表达及LVD,分析其与临床病理参数之间的关系。结果:NPC无淋巴结转移组VEGF-C阳性率(61.5%)低于淋巴结转移组(89.7%),P=0.01;无淋巴结转移组VEGFR-3阳性率(73.0%)低于淋巴结转移组(89.7%),P=0.011;无淋巴结转移组LVD(15.2±5.2)低于淋巴结转移组(19.3±6.6),P=0.013。VEGF-C和VEGFR-3的表达与临床分期有关,P<0.001;而VEGF-C和VEGFR-3的表达及LVD与年龄、性别和原发肿瘤T分期无关,P>0.05。VEGF-C和VEG-FR-3均与LVD呈正相关,r值分别为0.491和0.467,P值均为0.000。结论:VEGF-C可促进淋巴管生成和NPC颈淋巴结转移。针对VEGF-C/VEGFR-3信号传导系统的抗淋巴管生成的治疗,有望成为抗NPC淋巴结转移的有效途径。     

siRNA抑制食管癌EC9706细胞VEGF-C体内外表达的定量分析

目的观察小分子干扰RNA(siRNA)对人食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)体内外表达的抑制作用。方法根据VEGF-C cDNA已知序列,设计并体外转录合成3条siRNA,将它们分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染EC9706细胞,并以无关序列转染和正常EC9706细胞为对照。以免疫组化S-P法和定量分析技术,分别检测上述各组细胞中和荷瘤动物瘤组织中VEGF-C蛋白的表达强度(positive unit,PU)。结果未转染细胞对照组和无关序列转染组,均有大量VEGF-C蛋白阳性颗粒,两者之间PU差异无显著性;siRNA转染的3组中,仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒,与未转染细胞对照组和无关序列组相比,PU值差异均有统计学意义(P<0.01)。结论VEGF-C siRNA能有效抑制食管癌EC9706细胞中VEGF-C体内外的表达,可望成为一种抗食管癌淋巴管生成的新方法。     

增殖诱导配体小干扰RNA对人结直肠癌裸鼠移植瘤细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究增殖诱导配体(APRIL)小干扰RNA(siRNA)对人结直肠癌裸鼠移植瘤细胞增殖和凋亡的抑制作用.方法 建立人结直肠癌裸鼠移植瘤模型,将裸鼠分为3组,瘤块内分别注射APRIL siRNA、空载体和PBS液,每2天注射1次,共2周.采用实时荧光定量PCR法和免疫组化SP法检测APRIL siRNA对APRILmRNA和蛋白表达的影响,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测肿瘤内增殖细胞核抗原(PCNA)含量的变化,采用免疫组化SP法检测肿瘤内bcl-2和bcl-xl蛋白的表达,采用原位末端标记(TUNEL)法检测肿瘤细胞的凋亡.结果 APRIL siRNA能敲低APRIL基因的表达水平,APRIL siRNA组移植瘤内APRIL mRNA的相对表达量为(0.13 ±0.05)×10-3,明显低于空载体组[(0.95 ±0.04)× 10-3]和空白对照组[(0.96±0.05)×10-3,P＜0.05].APRIL siRNA组APRIL蛋白的表达比空载体组和空白对照组降低了(87.5%±5.0%,P＜0.05).APRILsiRNA组裸鼠移植瘤生长缓慢,瘤块重量较空载体组和PBS对照组明显降低(P＜0.05).APRIL siRNA组移植瘤内PCNA的含量为(176.8±18.1)ng/ml,明显低于空载体组[(330.0±20.5)ng/ml]和空白对照组[(328.4±22.8)ng/ml,P＜0.05];bcl-2和bcl-xl蛋白的表达量也较空载体组和空白对照组明显降低(P＜0.05).APRIL siRNA组移植瘤内凋亡细胞的数量增多,凋亡率为40.1%±2.5%,明显高于空载体组(2.5%±0.1%)和空白对照组(2.5%±0.2%,P＜0.05).结论 APRIL siRNA能在裸鼠体内抑制人结直肠癌细胞的增殖,并促进细胞凋亡,达到显著的抑瘤效果.APRIL基因可能成为人结直肠癌基因靶向沉默治疗的重要候选基因之一.     

区域淋巴结切除对小鼠结直肠肿瘤CEA、VEGF-C表达的影响

目的:探讨区域淋巴结切除对小鼠结直肠肿瘤CEA、VEGF-C表达的影响。方法:将60只健康BALB/c小鼠分为3组,虚拟切口+PBS注射15只（A组）,虚拟切口+CT26.WT注射30只（B组）,模型组（区域淋巴结切除）+CT26.WT注射15只（C组）。再将B组分为B1组15只（未行区域淋巴结切除）、B2组15只（肿瘤埋植7天后行区域淋巴结切除）。用ELISA法检测各组小鼠血清CEA、VEGF-C浓度,并对各组小鼠的瘤块称重及测算体积。结果:A组、B1组、B2组、C组小鼠血清CEA浓度分别为（602.6±52.2）pg/mL、（640.3±37.6）pg/mL、（676.5±56.6）pg/mL、（698.9±45.7）pg/mL,四组小鼠血清VEGF-C浓度分别为（153.5±13.0）pg/mL、（164.6±14.6）pg/mL、（177.1±15.4）pg/mL、（186.0±17.2）pg/mL。B组、C组的小鼠血清CEA、VEGF-C浓度相比A组均有不同程度的升高（P<0.05）;与B1组相比,B2组、C组小鼠血清CEA、VEGF-C浓度均升高（P<0.05）;瘤块重量及体积均明显增大（P<0.05）。结论:区域淋巴结切除可能会使小鼠肿瘤CEA及VEGF-C的表达上调,促进移植瘤的生长和侵袭。     

RNAi-mediated gene silencing of vascular endothelial growth factor-C inhibits tumor lymphangiogenesis and growth of gastric cancer in vivo in mice

Overexpression of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) has been implicated as a critical molecular signal in tumor development by promoting intratumoral lymphangiogenesis. The aim of this study was to explore whether small hairpin RNA (shRNA) targeting VEGF-C could inhibit gastric cancer lymphangiogenesis and tumor growth. Plasmid-mediated expression of VEGF-C–shRNA was employed to silence VEGF-C gene expression in human SGC-7901 cell lines. The inhibition of the target gene expression was quantified by real-time quantitative polymerase chain reaction, Western blotting, and enzyme-linked immunosorbent assay. In vitro, the cell viability was determined by MTT assay, flow cytometry analysis, and migration assay. After VEGF-C knockdown was confirmed, the stable cells were inoculated into nude mice. Tumor growth, lymph vessel density (LVD), and microvascular density were compared for mice administered either VEGF-C–shRNA or control. VEGF-C–shRNA causes effective and specific downregulation of VEGF-C expression (P?<?0.05). The migration activity of SGC-7901 cells was attenuated in vitro (P?<?0.05). Tumor growth rate and LVD was suppressed in vivo (P?<?0.05). VEGF-C–shRNA effectively suppressed gastric cancer cell migration in vivo, retards tumorigenicity, and lymphangiogenesis in nude mice.     

Down-regulation of vascular endothelial cell growth factor-C expression using small interfering RNA vectors in mammary tumors inhibits tumor lymphangiogenesis and spontaneous metastasis and enhances survival

Tumor production of vascular endothelial cell growth factor (VEGF)-C is associated with tumor lymphangiogenesis and lymph node metastasis. In this study, we examined the effects of small interfering RNA (siRNA)-mediated inhibition of VEGF-C on murine mammary tumor growth, metastasis, and survival. The mRNA and protein expression of VEGF-C in murine mammary tumor cells stably transfected with a VEGF-C siRNA vector were significantly lower compared with VEGF-C-control vector-transfected cells. Cl66-siVEGFC tumors had lower levels of lymphangiogenesis and lymph node and spontaneous lung metastasis than Cl66-control tumors. However, we did not observe significant differences in primary tumor growth and experimental lung metastasis between mice injected with Cl66-siVEGFC and Cl66-control cells. In addition, mice bearing Cl66-siVEGFC tumors lived significantly longer than mice bearing Cl66-control tumors. Furthermore, our data suggest that inhibition of VEGF-C modulates immune cell infiltration and their function, which might be critical in tumor immunity. In summary, our data show that inhibition of VEGF-C expression using siRNA-mediated gene silencing vectors reduces lymphangiogenesis and lymph node and spontaneous lung metastasis, and enhances survival.     

小干扰RNA沉默CXCR4和CXCR7对人子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的:探讨针对趋化因子受体基因CXCR4和CXCR7的小干扰RNA(siRNA)对人子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠移植瘤生长的影响.方法:将子宫内膜癌Ishikawa细胞株注射于裸鼠肩胛背部皮下建立动物模型,待肿瘤最长径达5～7mm后,将所有荷瘤裸鼠随机分组,分别给予CXCR4-siRNA和CXCR7-siRNA单独或联合瘤体内注射,并以阴性对照siRNA和生理盐水作为对照组,每3d治疗一次,共6个治疗周期.观察各组裸鼠移植瘤的生长,比较各组移植瘤的体积和质量的差异,并以实时荧光定量RT-PCR、Western blotting和免疫组化技术验证CXCR4和CXCR7的基因沉默效果.结果:成功建立Ishikawa细胞裸鼠移植瘤模型,与阴性对照siRNA组和空白对照组相比,CXCR4siRNA治疗组、CXCR-siRNA治疗组和CXCR4-siRNA+ CXCR7-siRNA治疗组的肿瘤的生长均明显受到抑制(均P＜0.05);CXCR4-siRNA和/或CXCR7-siRNA瘤体内直接注射能显著下调CXCR4、CXCR7 mRNA(均P＜0.05)和蛋白(均P＜0.01)的表达.结论:siRNA干扰CXCR4和CXCR7表达能够有效抑制人子宫内膜癌Ishikawa细胞裸鼠移植瘤的生长.