瘤体内注射肿瘤坏死因子重组腺病毒对大鼠乳腺癌的治疗作用

目的:观察腺病毒重组肿瘤坏死因子(TNF)基因转染对大鼠乳腺癌细胞Walker256体内致瘤性的影响及瘤体内注射TNF重组腺病毒对Walker256荷瘤大鼠的治疗作用.方法:Walker256乳癌细胞感染人TNF重组腺病毒后,观察其体外增殖能力、皮下致瘤性的变化及进行肿瘤局部病理学检查;瘤体局部注射TNF重组腺病毒(Ad.hTNF),观察荷瘤大鼠的肿瘤生长情况及生存期.结果:Walker256感染人TNF重组腺病毒后,培养上清中24 h TNF的分泌量达5.2 ng/106细胞,细胞形态学无明显变化,体外增殖能力和皮下致瘤性显著下降,瘤体周围有大量淋巴细胞及单核细胞浸润;肿瘤局部注射Ad.hTNF能显著抑制Walker256的生长,并延长荷瘤大鼠的生存期.结论:重组腺病毒能有效介导TNF基因转染Walker256细胞,瘤体内局部注射Ad.hTNF对Walker256荷瘤大鼠具有明显的治疗作用.     

人类可溶性TNFR Ⅰ-GFP融合蛋白重组体的构建、表达和特性分析

目的构建并表达hsTNFR Ⅰ(human solubletumor necrosisfactor receptor Ⅰ)-GFP(green fluorescence protein)-pET28a融合蛋白,用以检测跨膜型TNF-α(mTNF-α).方法用PCR从GFP-pKEN重组质粒中扩增GFP的cD-NA,将其插入hsTNFR Ⅰ-pET28a重组质粒中hsTNFR Ⅰ基因片段的下游,获得hsTNFR Ⅰ-GFP-pET28a重组体.转化大肠杆菌BL-21,用IPTG诱导重组蛋白表达,经镍金属螯合层析柱纯化.用MTT法检测重组融合蛋白对sTNF-α细胞毒效应的抑制活性,并用重组融合蛋白直接对转染TNF基因细胞表面的mTNF-α进行定性检测.结果hsTNFR Ⅰ-GFP重组融合蛋白可明显抑制sTNF-α细胞毒效应,且呈剂量依赖性;该融合蛋白不但可与NIH3T3细胞膜上鼠源性mTNF-α结合,而且也可与转基因NIH3T3细胞表面人mTNF-α结合.结论hsTNFR Ⅰ-GFP重组融合蛋白具有TN-FR的生物学活性,同时保留GFP的发光特性,可用来检测细胞表达mTNF-α的水平.     

人类可溶性TNFR I—GFP融合蛋白重组体的构建、表达和特性分析

目的 构建并表达hsTNFRI(human soluble tumor necrosis facto receptorI)—GFP(green fluorescence protein)—pET28a融合蛋白，用以检测跨膜型TNF—α(mTNF—α)。方法用PCR从GFP—pKEN重组质粒中扩增GFP的cDNA，将其插入hsTNFRI—pET28a重组质粒中hsTNFRI基因片段的下游，获得hsTNFRI—GFP—pET28a重组体。转化大肠杆菌BL—2l，用IPTG诱导重组蛋白表达，经镍金属螯合层析柱纯化。用MTT法检测重组融合蛋白对sTNF—α细胞毒效应的抑制活性，并用重组融合蛋白直接对转染TNF基因细胞表面的mTNF—α进行定性检测。结果 hsTNFRI—GFP重组融合蛋白可明显抑制RTNF—α细胞毒效应，且呈剂量依赖性；该融合蛋白不但可与NIH3T3细胞膜上鼠源性mTNF-α结合，而且也可与转基因NIH3T3细胞表面人mTNF—α结合。结论 hsTNFRI—GFP重组融合蛋白具有TN—FR的生物学活性，同时保留GFP的发光特性，可用来检测细胞表达mTNF—α的水平。     

重组膜型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST-TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体。方法：用RT-PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700 bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：建立了重组膜型TNF的GST融合表达及纯化优势,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

重组绿色荧光蛋白-肿瘤坏死因子融合蛋白的表达及应用

目的　为肿瘤坏死因子 α (TNF α)及其受体 (TNFR)的科学研究提供实验工具。方法　用基因克隆技术构建了人TNF α (rhTNF α)及绿色荧光蛋白 (GFP)与人TNF α的融合蛋白 (GFP TNF)的原核表达质粒pET2 8a/rhTNF及 pET2 8a/GFP TNF ,分别转化大肠杆菌BL2 1;用IPTG诱导重组蛋白的表达 ,超声裂菌 ,包涵体中的rhTNF α和GFP TNF用镍金属螯合层析柱进行纯化 ;用MTT法检测rhTNF α和GFP TNF的生物活性。结果重组表达的rhTNF α及GFP TNF均具有明显的细胞毒效应 ,GFP TNF还具有GFP的绿色荧光特性。结论　rhTNF α和GFP TNF具有生物活性 ,可用于TNF α和TNFR的实验研究。     

新型重组毒素hIL15M/TNFαM的构建、表达与活性测定

目的构建、表达hlL15M/TNFαM融合毒素,为研制可消除hIL15受体高表达细胞的特异性导向药物奠定基础.方法人白介素15突变体(hIL15M)对靶细胞不具有激动作用,将该突变体与TNFα突变体(TNFαM)编码基因直接融合克隆至pET表达载体,并纯化出融合蛋白hIL15M/TNFαM,MTr法测定该蛋白的细胞毒活性.结果SDS-PAGE分析表明,重组菌株诱导后可以表达出30×103与预期大小一致的特异蛋白带.纯化的hIL15M/TNFαM对PHA激活的T细胞的杀伤作用是静止性T细胞的13倍.结论hIL15M/TNFαM融合蛋白对高表达hiL15受体的细胞具有较强的杀伤性作用,提示其对由活化的异常T细胞增多所致的疾病具有潜在的治疗作用.     

TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白高效原核表达载体的构建

目的构建TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白的高效原核表达载体. 方法以人心肌cDNA文库为模板,PCR扩增TNF受体(P55)胞外区全基因(sTNFR-ED),亚克隆入pGEM-T/IgGFc中构建pGEM-T/sTNFR-ED∶IgGFc重组子,然后以其为模板,在上游引物中引入原核细胞高频密码子,再次PCR扩增去信号肽TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合基因(TNFR-ED∶IgGFc),亚克隆入pUC19载体,经序列测定正确后克隆入原核表达载体pBV220中.结果成功构建了TNF受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白高效原核表达载体,命名为pBV220/TNFR-ED∶IgGFc.结论 pBV220/TNFR-ED∶IgGFc表达载体的构建,为进一步表达TNF 受体(P55)胞外区和IgGFc嵌合蛋白及其在中和TNF毒副作用、治疗自身免疫性疾病中的作用机制研究奠定了基础.     

靶向递送人颗粒溶素与小鼠单链IL-12真核共表达质粒耻垢分枝杆菌的构建及鉴定

目的:构建携带编码人天然颗粒溶素(GLS)和小鼠单链IL-12基因的真核共表达载体pZM03,并构建可将其靶向递送入巨噬细胞中进行表达的重组耻垢分枝杆菌菌苗.方法:将人GLS,小鼠单链IL-12基因和分枝杆菌复制子OriM同时克隆进多启动子真核共表达载体pBudCE4.1中,得到穿梭质粒pZM03.以pZM03电转化耻垢分枝杆菌mc2-155,通过PCR方法检测重组菌中携带的真核共表达质粒;通过与小鼠巨噬细胞株RAW264.7共孵育检测重组菌的靶向性.结果:成功得到了可靶向递送GLS/IL-12真核共表达质粒pZM03进入巨噬细胞的新型重组菌.结论:利用耻垢分枝杆菌作为减毒生物体载体向巨噬细胞中靶向递送真核表达质粒是可能的.     

TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒载体的构建及其在人脐带间质干细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白的TNFα-Tumstatin融合基因腺病毒表达载体,转染人脐带间质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)。方法:设计含有GM-CSF信号肽序列和BglⅡ及HindⅢ酶切位点的引物,PCR扩增TNFα-Tumstatin,将扩增产物亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,重组穿梭质粒经PmeⅠ线性化后转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中同源重组。筛选获得含有融合基因的重组腺病毒质粒,酶切鉴定并测序。重组病毒质粒用PacⅠ酶切线性化后转染293A细胞,经过包装、扩增后感染hUCMSCs并检测细胞内融合基因的表达。结果:重组腺病毒质粒经PCR和PacⅠ酶切鉴定,证实含有TNFα-Tumstatin融合基因,测序结果和设计片段的序列一致。重组腺病毒感染的hUCMSCs表达绿色荧光蛋白和融合基因。结论:成功构建了TNFα-Tumstatin融合基因的腺病毒表达载体,能高效率感染hUCMSCs,为进一步研究融合基因修饰的hUCMSCs抗肿瘤效应奠定了基础。     

NOTCH2基因甲基化与幼年特发性关节炎的关系及其机制

目的:分析在抗重组全人源化肿瘤坏死因子α单克隆抗体(TNF)治疗停药前后对幼年特发性关节炎(JIA)患者NOTCH2基因甲基化的影响.方法:应用生物信息学分析抗TNF治疗前后JIA的基因组甲基化分布.采用甲基化特异性PCR(MSP)和实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别用于检测T0(抗TNF治疗前)和Tend(抗T...     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

正常增殖期子宫内膜细胞增生状态的定量观察

以＾３氢－胸腺嘧啶核苷放射自显影法及ＨＥ染色，观察并分别测定了１８例正常子宫内膜增殖中期，１５例增殖晚期的腺上皮细胞或间质细胞的标记指数、分裂指数。结果显示：子宫内膜增殖晚期腺上皮细胞或间质细胞之ＬＩ均明显高于增殖中期。同时，增殖晚间质细胞之ＭＩ也明显高于增殖中期，即此两种细胞在增殖晚期中增生明显，其增生状态初步获得了定位定量测定的正常值。     

人工全髋关节置换术的手术配合

目的：介绍人工全髋关节置换术的手术配合做法;方法：主要在手术配合的六个方面,解决防感染、防栓塞等问题。结果：30例人工全髋关节置换术均获成功,结论：手术配合是护士责任心和基本功的全面体现,对提高手术效果有至关重要的影响。     

80例局限性银屑病误诊原因分析

本文报告80例局限于小腿或手或足的银屑病。均经皮肤组织病理检查确诊。因部位比较特殊。受多种理化因素影响,使皮疹形态发生轻重程度不同的变化,常看不到典型损害,因而误诊为神经性皮炎,湿疹,慢性皮炎及癣等。作者对误诊原因进行了分析后,提出了鉴别诊断方法。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

妊娠晚期重度妊高征的监测

重度妊高征表现为高血压、蛋白尿、浮肿等症状 ,严重可以导致母婴死亡。对妊娠足月的重度妊高征 ,可以根据其临产与否及宫颈条件 ,立即决定其为阴道分娩或是剖宫产术。对于妊娠晚期的重度妊高征 ,因其胎龄不足月 ,胎儿生长发育及胎肺成熟度情况需通过一定时间的治疗 ,根据其病情变化来决定其治疗方案或终止妊娠的时机[1,2 ] 。这就需要我们对这一阶段的治疗进行监测 ,防止母儿并发症的发生。现将 2 0 0 0年至今我院收治妊娠晚期重度妊高征 30例的监测结果回顾分析如下。1　资料和方法1.1　研究对象　选择孕 31～ 36周重度妊高征 30例 ,其中 …     

尿微量白蛋白检测在继发性肾脏疾病中的临床意义

目的探讨尿微量白蛋白（m-Alb）检测在继发性肾脏疾病中的临床意义。方法采用Beckman Immage全自动特种蛋白分析仪对糖尿病组、高血压组、心脏病组患者进行了m-Alb测定,同时与健康组结果作对比。结果m-Alb检测糖尿病组为3.7±5.26mg/dl,高血压组为7.5±8.18mg/dl,心脏病组为7.8±3.76mg/dl,健康组为0.66±0.48mg/dl,各试验组m-Alb增高百分率为糖尿病组48.9%,高血压组37.5%,心脏病组26.9%。结论尿蛋白阴性的糖尿病、高血压、心脏病患者进行m-Alb检测,可以监测病程的进展。