人黏液表皮样癌裸鼠耐药移植瘤模型的建立及其生物学特性

目的:建立一种耐药性稳定的人涎腺黏液表皮样癌裸鼠移植瘤模型.方法:将人涎腺黏液表皮样癌多药耐药细胞接种于裸鼠皮下,成瘤后经腹腔注射小剂量5-FU进行体内诱导,建立稳定的黏液表皮样癌裸鼠移植瘤模型.结果:裸鼠移植瘤原代培养的MEC/5-FU/NU细胞与体外培养细胞结构类似,MEC/5-FU/NU细胞对5-FU的耐药指数为27.82.RT-PCR显示耐药相关基因ABCB1、ABCB11、GSTA1在MEC/5-FU/NU细胞中明显高表达(P<0.05).免疫荧光显示多药耐药蛋白MDR-1在MEC/5-FU/NU细胞中高表达.结论:以MEC/5-FU建立的黏液表皮样癌裸鼠皮下移植瘤模型仍保持MEC/5-FU细胞的形态学特征和多药耐药性,可为耐药性人涎腺黏液表皮样癌耐药机制和逆转的研究提供较理想的动物模型.     

腺样囊性癌和黏液表皮样癌耐药性研究进展

肿瘤细胞多药耐药性产生的主要机制是细胞膜上存在转运蛋白,RNAi技术既可以用来研究耐药机制,又可以用于逆转细胞耐药性.国内已建立了人涎腺腺样囊性癌和黏液表皮样癌耐药细胞系,多药耐药基因MDR1或多药耐药相关蛋白基因ABCC1可能发挥重要作用.用RNAi技术可以抑制耐药细胞中MDR1和 ABCC1基因及其蛋白表达,从而逆转细胞的耐药性.     

高转移人涎腺黏液表皮样癌耐药细胞系的建立及其生物学特性

目的:建立人涎腺黏液表皮样癌细胞系耐药细胞株并观察其生物学特性及耐药性能.方法:采用裸鼠体内成瘤加药诱导然后在体外用恒定浓度间歇法持续加药,建立高转移人涎腺黏液表皮样癌细胞系MC3的耐药细胞系,应用MTT法,细胞计数法,免疫组化,电镜,RT-PCR等方法观察及检测细胞的生物学特性及耐药性.结果:MC3细胞经过5-FU在体内、体外反复作用产生了多药耐药性,耐药细胞系命名为MC3/5-FU.MC3和MC3/5-FU细胞均为单层贴壁生长,局部可见重叠生长,增殖活跃,2种细胞形态及超微结构未见明显差别.MC3/5-FU,MC3细胞的群体倍增时间分别为55 h和60 h.MC3/5-FU细胞对于5-氟尿嘧啶(5-FU)、博莱霉素(BLM)、长春新碱(VCR)、长春花碱(VBL)、顺铂(CDDP)的耐药倍数分别为13.3、4.2、6.5、6.9、0.7.免疫组化结果显示:P-gp(P蛋白)在MC3/5-FU呈阳性表达,而在MC3则未见表达.PCR结果显示MDR-1基因在MC3/5-FU中表达高于MC3.结论:MC3/5-FU具有多药耐药性.     

黏液表皮样癌中CEACAM5和CEACAM6的表达及意义

目的检测癌胚抗原相关细胞黏附分子5(CEACAM5)和癌胚抗原相关细胞黏附分子6(CEACAM6)在涎腺黏液表皮样癌(MEC)组织中的表达情况,分析二者与涎腺黏液表皮样癌发生发展的关系。方法 60例黏液表皮样癌标本,以30例癌旁正常涎腺组织作对照,通过免疫组化法分别检测CEACAM5和CEACAM6在标本中的表达情况。结果 MEC组中CEACAM5和CEACAM6的蛋白阳性表达率分别为(68.3%,65%),明显高于正常涎腺组织中的表达率(40%,36.7%)(P<0.05),MEC组中CEACAM5和CEACAM6蛋白的阳性表达与MEC的分化程度、临床分期及颈部淋巴结转移密切相关(P<0.05),与患者的性别和年龄无关(P>0.05)。CEACAM5和CEACAM6在MEC组织中的阳性表达呈正相关。结论 CEACAM5和CEACAM6在黏液表皮样癌组织中的异常表达促进肿瘤的发生,均参与肿瘤的进展,联合检测可能与患者的预后密切相关。     

XIAP在涎腺黏液表皮样癌中的表达及意义

目的检测X染色体连锁凋亡抑制蛋白(x-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)在涎腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma,MEC)中的表达,探讨XIAP的表达在涎腺黏液表皮样癌发生发展中的作用。方法采用免疫组织化学法检测25例涎腺黏液表皮样癌中XIAP的表达,分析其与临床病例的关系。结果 XIAP在MEC中呈高表达,在正常涎腺组织中不表达或低表达;MEC和正常涎腺组织XIAP阳性检出率分别为84%(21/25)和0.00%(0/10)(P<0.01);XIAP表达与MEC组织病理分化程度呈正相关关系(P<0.05),而与肿瘤部位、临床分期、远处转移无相关性(P>0.05)。结论 XIAP在MEC中高表达,可能在MEC发生过程中具有重要的作用。     

涎腺肿瘤组织TN－CmRNA和CDgmRNA的表达及其意义

目的：探讨Tenascin-C（TN－C）mRNA和CD9mRNA在涎腺肿瘤的表达及其对涎腺肿瘤鉴别诊断的价值。方法：采用原位杂交技术检测10例正常涎腺组织、25例多形性腺瘤（PA）、25例腺样囊性癌（ACC）、20例黏液表皮样癌（MEC）、10例腺泡细胞癌（ACCa）中TN-CmRNA和CD9mRNA的表达。结果：TN-CmRNA在正常涎腺组织中呈阴性表达;CD9mRNA在正常涎腺组织中的阳性率为100％;TN-CmRNA、CD9mRNA在4种涎腺肿瘤中均有表达,TN-CmRNA在多形性腺瘤中的阳性表达率显著高于腺样囊性癌和黏液表皮样癌,差异具有统计学意义,而在多形性腺瘤与腺泡细胞癌中的表达差异无统计学意义。CD9mRNA在多形性腺瘤中的阳性表达率高于腺样囊性癌,差异有统计学意义,而在多形性腺瘤和黏液表皮样癌、腺泡细胞癌中的表达差异无统计学意义;在多形性腺瘤中TN-CmRNA和CD9mRNA的表达呈正相关,在腺样囊性癌、黏液表皮样癌和腺泡细胞癌中TN—CmRNA和CD9mRNA的表达无相关性。结论：TN-CmRNA和CD9mRNA与涎腺肿瘤的发生有一定相关性,对涎腺肿瘤之间的鉴别诊断有一定意义。     

趋化因子受体CXCR4 shRNA真核表达载体的构建

目的：构建趋化因子受体（CXCR4）特异的RNA干扰质粒载体。方法：根据GenBank数据库提供的CXCR4基因核苷酸序列,选择设计能转录短发夹状RNA（short hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pWH1质粒载体连接,用酶切的方法进行鉴定;将构建成功的特异性表达载体（pWH1-CXCR4）稳定转染至人涎腺黏液表皮样癌Mc3细胞系,并应用RT-PCR和流式细胞术对细胞CXCR4的表达进行检测。结果：与Mc3细胞和转染空白质粒pWH1 Mc3细胞相比,转染pWH1-CXCR4表达载体的Mc3细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达明显降低。结论：构建的CXCR4特异性shRNA表达载体可有效的沉默CXCR4基因,为进一步研究CX-CR4表达对涎腺黏液表皮样癌增殖和转移的意义及治疗涎腺黏液表皮样癌奠定了基础。     

P-gp170、cytokeratin及nm23在人涎腺粘液表皮样癌MEC-1/5Fu耐药细胞中的表达

目的 :探讨人涎腺粘液表皮样癌耐药细胞株MEC 1/ 5Fu细胞的耐药机制。方法 :应用免疫组织化学SP方法观察该细胞及其亲本细胞中P 糖蛋白 (P gp170 )、cytokeratin(CK)及nm 2 3的表达。 结果 :P gp170在MCE 1/ 5Fu细胞中的阳性表达率为 95 .1% ,明显高于亲本细胞的阳性表达率 12 .3 % (P <0 .0 5 ) ,而CK与nm2 3在MEC 1/ 5Fu细胞与亲本细胞中的表达率分别达 90 %以上 ,无显著差异 (P >0 .0 5 )。结论 :MEC 1/5Fu细胞具有多药耐药 (MDR)表型 ,其耐药性的产生主要是由P gp170高表达所介导     

转化生长因子β1在人涎腺黏液表皮样癌高低转移细胞系中的表达

目的探讨转化生长因子(TGF)βl在人涎腺黏液表皮样癌高、低转移细胞株的差异表达。方法应用基因芯片技术、反转录(RT)-PCR、免疫组化、免疫印迹杂交等方法从基因水平和蛋白水平检测TGF-βl的表达。结果基因芯片技术、RT-PCR、免疫组化、Western blot结果都证实TGF-β1在人涎腺黏液表皮样癌脊髓转移株高表达,在低转移株不表达。结论TGF-β1的表达上调可能与人涎腺黏液表皮样癌转移有关。     

涎腺透明细胞变异型黏液表皮样癌的临床病理研究

目的：报告10例涎腺透明细胞变异型黏液表皮样癌的临床病理及角蛋白表达特点。方法：回顾复习武汉大学口腔医学院1985～2006年收治、并经病理诊断为黏液表皮样癌的病例，确诊10例透明细胞变异型。全部病例行HE、PAS、AB—PAS、阿辛蓝和角蛋白免疫组织化学染色并随访。结果：本组病例约占同期所有涎腺MEC的4．7％（10／211），其中男女各5例，平均年龄42岁，腭部8例，舌根和腮腺各一例。镜下肿瘤主要由透明细胞组成的团块状或片状癌巢，其内混合少量非透明细胞（表皮样细胞或中间细胞），通常位于透明细胞的周边，呈逐渐的过渡。角蛋白免疫组化结果显示，CK7、CK8／18和CK19在所有病例中都呈强阳性表达，CK5／6、CK14、CK17和CK10／13大部分病例中呈局灶性或散在细胞表达。结论：透明细胞变异型黏液表皮样癌是黏液表皮样癌一种少见的变异，腭部多见。组织化学染色和CK10／13在透明细胞变异型黏液表皮样癌与非特异性透明细胞癌的鉴别诊断中有帮助。     

人涎腺粘液表皮样癌耐药细胞及其亲本细胞的线粒体分布及特点

目的 比较人粘液表皮样癌耐药细胞株(MEC—1／5—FU)及其亲本细胞(MEC—1)的线粒体数量和分布特点。方法 利用免疫荧光细胞化学染色结合激光扫描共聚焦显微镜、透射电镜观察两种细胞的线粒体分布及表达特征；细胞计数法观察细胞生长曲线及群体倍增时间。结果 MEC—1和MEC—1／5—FU细胞增殖活跃，细胞群体倍增时间分别为30h和28．8h；MEC—1／5—FU细胞线粒体的数量与分布较MEC—1细胞数量更多，多集中分布于细胞质内，且集中分布在粗面内质网附近。MEC—1／5—FU细胞线粒体外形较不规则，嵴较发达。结论 MEC—1和MEC—1／5—FU细胞线粒体数量和分布的不同以及线粒体嵴的数量、形态及排列方式、线粒体外形、嵴的发达程度等的差异均提示二者可能在能量消耗、细胞代谢及蛋白质合成功能方面存在差异。     

人舌癌耐药细胞株OSC-19/CDDP的多药耐药性检测及差异性表达microRNAs的筛选

目的:检测人舌鳞癌耐药细胞株OSC-19/CDDP是否具有多药耐药的生物特性,并筛选出与亲本细胞(OSC-19)显著差异表达的microRNAs(miRNAs),探讨其在舌癌耐药中的作用。方法:对前期实验建立的耐顺铂(cisplatin,CDDP)细胞株OSC-19/CDDP,采用CCK-8法检测其对不同化疗药物的耐药性;RT-PCR检测亲代与耐药株的多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1)表达。通过微阵列芯片筛查在OSC-19/CDDP与亲本细胞OSC-19中差异性表达的miRNAs,并通过RT-PCR进一步验证基因芯片的结果。结果:人舌癌多药耐药细胞株OSC-19/CDDP对CDDP的耐药指数为16.7,交叉耐药的紫杉醇(PTX)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、平阳霉素(PYM)耐药指数分别为7.93、5.31和3.01;RT-PCR结果显示OSC-19/CDDP细胞中MDR1的表达是OSC-19的15.23倍。微阵列芯片结果显示:OSC-19/CDDP与OSC-19比较,分别有17个miRNAs的表达增高程度和12个miRNAs的表达降低程度超过10倍。结论:人舌鳞癌耐药细胞株OSC-19/CDDP具有多药耐药的生物学特性,可作为舌鳞癌的顺铂耐药机制及多药耐药机制研究的理想细胞模型。显著差异表达的miRNAs可能在舌鳞癌耐药的发生、发展中发挥重要作用。     

六亚甲基二乙酰胺对MEC-1细胞体外粘附、移动和侵袭的影响

目的 研究分化诱导剂六亚基二乙酰胺（ＨＭＢＡ）对人粘液表皮样癌细胞系ＭＥＣ－１体外粘附、移动和侵袭的影响。方法 用２ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＭＢＡ体外诱导培养ＭＥＣ－１细胞,用ＭＴＴ（ｔｈｉａｚａｌｙｌ ｂｌｕｅ,噻唑蓝）比色法测定细胞在重构基底膜Ｍａｔｒｉｇｅｌ上的粘附,用Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ－ＰＣＦ培养系统测定细胞的移动性和侵袭性。结果 ＨＭＢＡ诱导的ＭＥＣ－１细胞在３０ｍｉｎ和９０ｍｉｎ粘附实验中的粘     

Survivin 和 PDCD5在黏液表皮样癌组织中的表达及临床意义

目的：探讨存活素（Survivin）和细胞程序性死亡因子5（PDCD5）在黏液表皮样癌组织中的表达及临床意义。方法：采用免疫组化 Elivision 二步法检测20例正常腮腺组织（A 组）、40例多形性腺瘤（B 组）及45例黏液表皮样癌（C 组）组织中 Survivin 和 PDCD5蛋白的表达情况。结果：（1）Survivin 在 A、B、C 组中表达阳性率分别为10％、27．5％、55．6％（χ2＝14．556,P ＜0．01）,PDCD 表达阳性率分别为85％、65％、33．3％（χ2＝17．439,P ＜0．01）;（2）Survivin 和 PDCD5的表达与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移及 TNM分期有关（P ＜0．05）;（3）Survivin 和 PDCD5在黏液表皮样癌中的表达呈负相关（χ2＝4．500,P ＝0．034,γs ＝－0．316）。结论：Survivin 高表达,PDCD5低表达在在黏液表皮样癌发生发展中可能发挥作用。     

大蒜素联合5⁃氟尿嘧啶对黏液表皮样癌MEC⁃1细胞增殖与凋亡的作用及机制

目的探讨大蒜素联合5⁃氟尿嘧啶(5⁃fluorouracil,5⁃FU)对黏液表皮样癌MEC⁃1细胞增殖抑制和凋亡的作用及机制,为临床药物应用提供相应基础。方法取对数生长期的MEC⁃1细胞,随机分成对照组和实验组,对照组为含有0.1%DMSO的PBS组,实验组为大蒜素组、5⁃FU组、联合用药组(大蒜素联合5⁃FU组)。用CCK8法检测不同浓度(0、25、50、75 mg/L)大蒜素、5⁃FU及大蒜素联合5⁃FU作用于MEC⁃1细胞24 h后细胞增殖抑制率并计算作用24 h后大蒜素及5⁃FU IC50值。用流式细胞仪检测不同浓度(0、25、50、75 mg/L)大蒜素、5⁃FU及大蒜素联合5⁃FU作用于MEC⁃1细胞24 h后细胞凋亡率。使用Western blot检测IC50浓度的大蒜素、5⁃FU单独及联合作用于MEC⁃1细胞24 h后Bax、Bcl⁃2蛋白表达量。结果联合用药组对MEC⁃1的增殖抑制率及凋亡率均强于大蒜素组和5⁃FU单独用药组(P<0.01)。大蒜素与5⁃FU单独及联合使用均可以下调Bcl⁃2蛋白和上调Bax蛋白表达量,且联合用药组Bax/Bcl⁃2比值最大(P<0.05)。结论大蒜素和5⁃FU单独及联合使用均对MEC⁃1细胞具有增殖抑制作用和诱导凋亡作用,且大蒜素增强了5⁃FU对MEC⁃1细胞的凋亡作用,其诱导MEC⁃1凋亡机制可能与Bax/Bcl⁃2信号通路相关。     

涎腺粘液表皮样癌中Caveolin-1、PCNA的表达及意义

目的：研究Caveolin-1、增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）在涎腺粘液表皮样癌中的表达,分析二者的关系及其与肿瘤生物学行为间的关系。方法：采用SP免疫组化技术检测75例涎腺粘液表皮样癌标本及20例正常涎腺组织中Caveolin-1、PCNA的表达,并行统计学分析。结果：Caveolin-1在20例正常涎腺组织中均呈阳性表达。Caveolin--1表达下调与病程短、病理级别及临床分期的增高有关,短病程组和长病程组间（42．1％VS67．6％）、低分化和高分化组问（38．5％VS63．3％）、Ⅲ＋IV期和I＋Ⅱ期组间（33．3％VS64．7％）比较差异有统计学意义（P〈O．05）。PCNA随着病理级别和临床分期的增高阳性表达率升高,低分化和高分化组间（33．38土11．98VS20．12士10．13）、HI＋IV期和I＋Ⅱ期组间（29．45土12．89VS22．49士11．73）比较差异有统计学意义（P〈O．05）。Caveolin--1与PCNA的表达呈负相关（rs－0．28,P－0．017）。Caveolin--1表达降低及PCNA表达增高与肿瘤复发显著相关（P〈O．05）。结论：Caveolin-1的表达对粘液表皮样癌细胞增殖起抑制作用,Caveolin--1是影响粘液表皮样癌发生发展的重要因素之一。     

HMBA对粘液表皮样癌P53蛋白表达和细胞增殖周期的影响

目的：研究六亚甲基二乙酰胺（ＨＭＢＡ）诱导人粘液表皮样癌（ＭＥＣ－１）细胞分化与细胞Ｐ５３蛋白表达和细胞增殖周期的关系。方法：ＭＴＴ比色法测定ＨＭＢＡ对ＭＥＣ－１细胞体外生长的作用;Ｆｅｕｌｇｅｎ染色测定细胞ＤＮＡ含量;ＡＢＣ免疫酶染色检测Ｐ５３蛋白;ＦＣＭ法测定细胞增殖周期。结果：ＨＭＢＡ对ＭＥＣ－１细胞的生长抑制作用呈剂量依赖性和时间依赖性;ＨＭＢＡ诱导的细胞与对照细胞比较,ＤＮＡ含量减少,Ｐ５３蛋白水平降低,Ｇ１期细胞数增加和Ｓ期细胞数减少。结论：ＨＭＢＡ对ＭＥＣ－１细胞的诱导分化作用与其调节Ｐ５３基因蛋白表达和细胞增殖周期有关。