抗T-2毒素单克隆抗体的制备及特性

目的 :建立敏感、特异和快速的针对T 2毒素的ELISA检测方法 ,形成具有我国自主知识产权的快速检测试剂盒。方法 :利用B细胞杂交瘤技术 ,建立抗T 2毒素的单克隆杂交瘤细胞株。结果 :用T 2 羊免疫球蛋白 (T 2 GIgG)偶联物免疫 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠后 ,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系Sp2 /0融合 ,经过 3～ 4次亚克隆建立了 2个稳定分泌抗T 2毒素抗体的杂交瘤细胞株 ,分别命名为 2A7和 6E4。将上述 2株杂交瘤细胞分别注入BALB/c小鼠腹腔 ,获得含抗T 2毒素单克隆抗体的腹水 ,并将腹水用饱和硫酸铵法进行纯化 ,得到 2A7和 6E4单克隆抗体。两株单克隆抗体的Ig亚类为IgG1,腹水中抗体的滴度分别为 6 .4× 10 6和 1.1× 10 7,参考工作浓度分别为1.0× 10 6和 3.2× 10 6。纯化后 2A7抗体的IgG含量为 16 .4g/L ,亲和常数为 8× 10 -8mol/L。 2A7抗体与其他结构类似物无交叉反应 ,具有较高的特异性。结论 :制备了具有高特异性和亲和力的抗T 2毒素单克隆抗体 ,初步建立了针对T 2毒素的ELISA检测方法。     

抗PSMA7单克隆抗体的制备和初步鉴定

目的制备抗蛋白酶体α7亚基(PSMA7)的单克隆抗体,为PSMA7的功能研究奠定基础。方法以纯化的重组蛋白PSMA7为抗原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备PSMA7单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定。结果成功建立两株稳定分泌抗PSMA7蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B013和B001。检测杂交瘤细胞培养上清抗体效价为1∶128和1∶256,腹水效价为1∶25600和1∶32000。两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1。Westernblot及免疫组化实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性PSMA7蛋白。结论成功建立了两株效价高、特异性好的抗PSMA7单克隆抗体杂交瘤细胞,制备的单克隆抗体可用于PSMA7蛋白的鉴定,为其生物学功能研究奠定了基础。     

分泌抗HIVp24单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及其初步鉴定

以含人免疫缺陷病毒（ＨＩＶ）核心抗朱ｐ２４全部氨基酸序列的重组蛋白ｐＧ１免疫小鼠，用免疫脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合，成功地建立了５株分泌抗ＨＩＶｐ２４单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株。经鉴定，这５株ＭｃＡｂ与乙肝核心抗原（ＨＢｃＡｇ），丙肝Ｃ区，ＮＳ－３区抗原不发生交叉反应，而与重组ｐ２４抗原产生特异反应，本组单抗的研制成功为建立检测ＨＩＶｐ２４抗原的方法奠定了基础。     

抗Rh（D）抗体制备的研究进展

RhD抗原是表达在人类红细胞表面的血型抗原,其在免疫原性和临床上的应用仅次于ABO血型系统,相应的抗Rh（D）抗体在血型鉴定和预防新生儿溶血等方面均具有重要意义。传统的抗Rh（D）多克隆抗体来自健康人的血清,由于来源受限和血浆制品的安全问题,人们开始了抗Rh（D）的单克隆抗体和基因工程抗体的研究。国外研制的抗Rh（D）的单克隆抗体已成功用于血型鉴定,但到目前为止,还没有一个单克隆或者基因工程抗Rh（D）抗体作为多克隆抗Rh（D）抗体的替代品,在临床上用于预防Rh（D）免疫和新生儿溶血。本文对抗Rh（D）抗体制备的研究进展进行了综述。     

抗河豚毒素单克隆抗体的制备及其抗毒效应

目的 :为制备高毒性的小分子生物毒素河豚毒素 (TTX)的单克隆抗体 (mAb) ,探讨TTX中毒免疫抗毒的可能性。方法 :以TTX为半抗原 ,与中国鲎血蓝蛋白 (TTH)化学偶联制备人工抗原 (TTX_TTH) ;并以其免疫BALB c小鼠。用杂交瘤技术制备抗TTX的mAb ,用竞争抑制酶免疫分析法测定mAb对TTX结合活性 ,以mAb与检测抗原的结合被抑制 5 0 %时的TTX浓度 (IC50 )表示mAb的结合反应性。对小鼠预防注射抗体 ,测试抗体对抗TTX中毒的效果。结果 :建立了 2株对TTX_BSA阳性反应的mAb(1E4和 3C11) ,均属IgG1 亚类 ;具有TTX结合活性 ,其IC50 值分别为 3.2× 10 _6 mol L和 9.9× 10 _7mol L ;亲和力常数 (Kaff)分别为 3.0× 10 6 L mol和 2 .8× 10 6 L mol。小鼠预防给予mAbs ,可对抗 1×LD的TTX攻毒 ,动物存活率 71% ;抗 1.5×LD时 ,1 3存活 ;抗毒效果好于小鼠抗血清对照。结论 :用新的TTX人工抗原成功地制备了抗TTX的mAb ,具有一定的体内预防抗毒效价。     

抗人CD40功能性嵌合抗体的制备及其高效表达

目的构建抗CD40嵌合抗体的真核表达载体,实现在真核细胞中的高效表达。方法采用RT-PCR法,从分泌鼠源抗人CD40抗体的杂交瘤细胞系5C11中钓取其轻、重链基因,进行序列测定。将5C11轻重链可变区基因分别克隆入表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体（c5C11）的轻链真核表达载体5C11L-pCMV及重链真核表达载体5C11H-pCMV。将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,利用夹心ELISA法测定上清中c5C11的浓度,通过流式细胞术检测c5C11与膜抗原的特异性结合。通过生物信息学相关方法对c5C11的氨基酸序列进行合理改造,尝试在保持生物学功能的基础上提高c5C11的表达量。结果成功钓取鼠源单抗5C11的轻重链可变区基因并构建了真核表达载体,实现了c5C11的分泌表达;嵌合抗体较好地保留了鼠源母本抗体的抗原识别能力。利用计算机辅助设计,一定程度上提高了c5C11的表达量。结论为后续研究嵌合抗CD40抗体对B淋巴瘤等肿瘤的治疗提供了一定的依据。     

抗Erbin特异性单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗Erbin单克隆抗体.方法:应用基因工程技术构建含Erbin PDZ序列的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)以获得重组蛋白的表达;采用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白;通过质谱鉴定重组蛋白;利用纯化的重组蛋白免疫小鼠,通过细胞融合技术制备单克隆抗体.结果:构建了原核表达载体pET-28a(+)-Erbin PDZ,获得了重组蛋白在工程菌中的高效表达.通过对以包涵体形式存在的重组蛋白进行洗涤、溶解、复性和纯化,获得了纯度在90%以上的重组蛋白.经质谱鉴定确证表达的重组蛋白为Erbin PDZ.用重组蛋白免疫小鼠后,经细胞融合、筛选及鉴定,获得了高效价的单克隆抗体.讨论:该抗体可识别天然状态下的Erbin蛋白,可用于ELISA、免疫荧光和免疫沉淀实验.抗Erbin单克隆抗体的制备为研究Erbin的功能奠定了基础.     

尿激酶型纤溶酶原激活剂单克隆抗体的制备、鉴定及其在抗原纯化中的应用研究

以从ＣＨＯ工程细胞培液上清初步纯化的尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｕＰＡ）免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，通过杂交瘤技术制备出１１株抗ｕＰＡ单克隆抗体，经特异性实验表明，这些抗体特异性地识别高分子量ｕＰＡ（５．４×１０￣４ｕ），与低分子量ｕＰＡ（３．３×１０￣４ｕ）有不同程度结合，但都不识别１．８×１０￣４ｕ的ｕＰＡ片段。它们与牛血清白蛋白、ＣＨＯ细胞上清液及组织型纤溶酶原激活剂都无交叉反应。１１株抗体分别针对５个不同的抗原决定簇。以单克隆抗体偶联的ｓｃｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ亲和柱直接从培液上清纯化ｕＰＡ，并经ｓｅｐｈａｃｒｖ１Ｓ－２００分子筛进一步纯化，纯度达９５％以上，回收率为８５％，纯化倍数为１５７倍左右。     

抗A型肉毒毒素鼠源性单克隆抗体的制备和鉴定

目的：制备与鉴定抗A型肉毒神经毒素重链C端（ heavy chain of botulinum neurotoxin serotype A, BoNT／AHc）特异性鼠单克隆抗体。方法通过纯化BoNT／AHc抗原、免疫BALB／c小鼠并建立杂交瘤细胞以制备鼠单抗,用ELISA、Western印迹实验和抗体分型试剂盒进行分析鉴定,并通过ELISA检测鼠单抗与BoNT／AHc突变体结合,初步鉴定其在BoNT／AHc的结合表位。结果得到纯度较高的BoNT／AHc抗原,制备了4株特异性鼠单抗1A4、3H3、3H7、5H8。间接ELISA结果显示,单抗细胞上清效价均＞3．0×103;Western印迹检测结果显示,单抗均能与BoNT／AHc特异性结合;抗体亚型鉴定结果为1A4、3H7属于IgG1（Κ）,3H3属于IgM（Κ）,而5H8属于IgG2b （Κ）;叠加ELISA实验表明,4株单抗抗原识别表位相近;用ELISA检测单抗与BoNT／AHc突变体结合实验结果初步确定了4株单抗与BoNT／AHc的结合表位。结论对抗A型肉毒毒素鼠源性抗体完成了制备和鉴定,为肉毒毒素中和抗体的开发与阐明中和抗体的表位奠定了基础。     

盐酸克仑特罗单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗盐酸克仑特罗(clenbuterol ,CL)的单克隆抗体并进行免疫学特性鉴定.方法:用重氮化法将盐酸克仑特罗偶联于载体牛血清白蛋白(BSA),形成的结合抗原BSA-CL作为免疫原免疫BALB/c小鼠,同时将CL与卵清白蛋白(OVA)偶联制备检测原(OVA-CL).应用杂交瘤技术建立分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,体内诱生腹水并进行纯化.用竞争性ELISA法测定抗体的亲和常数及交叉反应性.结果及结论:获得了18株稳定分泌抗盐酸克仑特罗单克隆抗体的杂交瘤细胞株,挑选其中E9-C11、C11-E3、E7-G8三株高亲和力的细胞株进行免疫学特性鉴定.三株抗体的亚类均为IgG1.细胞上清的间接ELISA效价分别为1:1 280、1:1 000、1:800,三株腹水效价都约为1×10-6.亲和常数分别为2.4×10-8mol/L、2.83×10 -8 mol/L 、3.28×10-8 mol/L .E9-C11单抗对CL的IC50为6.1035μg/L;对沙丁胺醇的IC50大于781.25 μg/L,交叉反应性小于0.78%;对肾上腺素、去甲肾上腺素、异丙肾上腺素、莱克多巴胺及部分维生素和抗生素均无交叉反应性.蛋白免疫印迹分析证明三株单抗特异性均很高,可用于与其相关的免疫检测或应用研究.     

用杂交F1小鼠制备单克隆抗体腹水的研究

用ＢＡＬＢ／ｃ×ＬＡＣＡＦ＿１和ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ＿（５７）Ｆ＿１杂交小鼠与纯系ＢＡＬＢ／ｃ小鼠生产腹水制备单克隆抗体，观察各种小鼠对杂交瘤细胞的耐受性，产生腹水的能力及腹水中蛋白质含量和抗体效价。ＢＡＬＢ／ｃ×ＬＡＣＡＦ＿１鼠的平均腹水产量，雄鼠为ＢＡＬＢ／ｃ鼠的２～３倍，雌鼠为１．４倍左右。对杂交瘤细胞的耐受性，腹水中蛋白质含量及抗体效价与ＢＡＬＢ／ｃ小鼠比较均无显著差异。ＢＡＬＢ／ｃ×Ｃ＿（５７）Ｆ＿１小鼠的腹水产量明显低于ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，而且死亡率较高。ＢＡＬＢ／ｃ×ＬＡＣＡＦ＿１小鼠生长快，易于饲养繁殖，价格便宜，腹水产量高，是一种替代ＢＡＬＢ／ｃ小鼠生产单克隆抗体腹水较理想的鼠种。     

抗支原体单克隆抗体试剂盒的研制和应用

从20株抗支原体MAb中筛选出1株能够对各种支原体起反应的MAb(3D1)组成试剂盒,用间接免疫荧光法(IFA) 检查了35株传代细胞和6份动物标本,支原体检出率为83%,为了验证此方法的准确性,将其中部分细胞同时做常规培养检查,符合率为90%。结果证明,MAb试剂盒具有特异性高,敏感性强,速度快等优点。     

抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体的研制与鉴定

利用常规杂交瘤技术制备了２株抗人绒毛膜促性腺激素（ｈＣＧ）的杂交瘤细胞。ＥＬＩＳＡ结果表明，单克隆抗体ＩＤ５和４Ｄ５均与人ｈＣＧ有特异性反应，腹水效价分别为３．２×１０－５、６．４×１０－５，均属于ＩｇＧ１亚类。与人促卵泡激素（ｈＦＳＨ）和人促黄体激素（ｈＬＨ）的交叉反应呈阴性。免疫转印结果显示能识别相对分子质量为２４×１０３ｕ的ｈＣＧ－β链条带。亲和常数分别为１．０１×１０７Ｌ／ｍｏｌ、４．４３×１０７Ｌ／ｍｏｌ。     

131I标记的抗肝癌血管内皮细胞单克隆抗体对肝癌治疗的实验研究

目的运用131I标记的抗肝癌血管内皮细胞单克隆抗体,研究靶向血管内皮细胞治疗肝癌的可行性.方法 建立裸小鼠人肝细胞癌动物模型,取30只裸鼠随机分为3组,分别为实验A组、实验B组和对照组,每组各10只.实验A组在接种肝癌细胞的同时,经腹腔注射抗肝癌血管内皮细胞的单克隆抗体,每只200μg/200μl,2次/周;实验B组在接种肝癌细胞的同时,经腹腔注射同剂量的131I标记的抗肝癌血管内皮细胞的单克隆抗体;对照组在接种肝癌细胞的同时,经腹腔注射等量的生理盐水.观察肿瘤的生长情况,计算肿瘤的体积,计算抑瘤率.结果 实验A组的抑瘤率为74.55%,实验B组为86.36%;实验A、B组与对照组比较肿瘤明显受抑(P<0.05).实验B组与实验A组比较显示了明显的放疗作用(P<0.05).HE及免疫组化染色观察证实,经单抗治疗后肿瘤区微血管内血栓形成,血管内皮细胞变性、坏死,血管周围大片肿瘤细胞坏死,瘤内血管密度明显降低.结论 抗肝癌血管内皮细胞单克隆抗体在动物实验中有明显的抑瘤作用,以此抗体为载体与核素相结合,可明显提高治疗肿瘤的疗效.     

基孔肯亚病毒中和单克隆抗体的筛选与鉴定

目的 :建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体细胞株 ,筛选具有中和活性的特异性单克隆抗体。方法 :利用细胞融合技术建立抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,用细胞培养中和试验初筛具有中和活性的单克隆抗体 ,用固定单克隆抗体稀释病毒方法进行乳鼠中和试验 ,进一步验证单克隆抗体的保护作用 ;用中和交叉试验鉴定中和单克隆抗体反应的特异性。结果 :用免疫荧光法检测建立了 9株能稳定分泌抗基孔肯亚病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株 ,初筛出 4株具有中和活性的单克隆抗体 ,其中 1F1单克隆抗体稀释 2 0 0倍时可保护 50 %细胞不产生细胞病变 ;乳鼠中和试验1F1单克隆抗体中和指数为 10 3.3,对试验小鼠有较强的保护作用。中和交叉试验表明 ,1F1单克隆抗体只中和基孔肯亚病毒 ,与其他病毒无交叉反应 ,特异性较高。结论 :制备了 9株抗基孔肯亚病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 ,筛选得到了 1F1具有较强中和活性的特异性单克隆抗体 ,可望为基孔肯亚病毒病的诊断、紧急预防与治疗提供良好试剂