miR-200通过上皮间质转化途径促进乳腺癌细胞迁移

[目的]探讨miR-200在乳腺癌发生发展过程中的作用机制.[方法]采用RT-PCR方法检测miR-200在6种不同类型乳腺癌细胞系中的表达水平及上皮间质转化(EMT)相关marker的表达水平;利用划痕实验验证miR-200对乳腺癌细胞迁移能力的影响.[结果]三阴及Her2类型的乳腺癌细胞系miR-200的表达水平显著高于Luminal类型(P<0.05).[结论]miR-200促进乳腺癌细胞迁移可能是通过EMT途径实现的.     

白藜芦醇通过上调miR-186-5p表达抑制肝癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化

目的：探讨白藜芦醇抑制肝癌细胞转移的分子机制。方法：利用CCK-8法检测白藜芦醇对肝癌细胞HepG2和Huh7存活率的影响,筛选后续实验适合的浓度;实时定量RT-PCR检测肝癌组织和肝癌细胞中miR-186-5p的表达;细胞划痕实验、Transwell小室实验和蛋白质印迹法分别检测白藜芦醇或miR-186-5p表达变化对肝癌细胞HepG2和Huh7迁移、侵袭和上皮-间质转化相关蛋白表达的影响。结果：6.25?μmol/L白藜芦醇对肝癌细胞HepG2和Huh7的存活率无显著影响,遂后续实验中白藜芦醇的浓度选择6.25?μmol/L。实验结果显示, 白藜芦醇可以抑制肝癌细胞的迁移和侵袭,并增加上皮钙黏素表达,降低波形蛋白和Twist1表达（均P<0.05）。与癌旁组织和正常肝细胞相比,肝癌组织和肝癌细胞中miR-186-5p表达均下调（均P<0.05）。白藜芦醇能诱导肝癌细胞中miR-186-5p的表达（均P<0.01）。上调miR-186-5p表达可显著抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和上皮-间质转化（均P<0.05）,而敲低miR-186-5p表达能阻断白藜芦醇对肝癌细胞迁移、侵袭和上皮-间质转化的抑制作用。结论：白藜芦醇能体外抑制肝癌转移,其机制可能与上调miR-186-5p表达有关。     

IBP通过上皮间质转化促进结肠癌细胞迁移和侵袭

目的 探讨干扰素调节因子4结合蛋白(interferon regulatory factor-4 binding protein,IBP)能否影响结肠癌细胞上皮间质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)的发生,观察IBP在肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭中作用.方法 干预结肠癌细胞中IBP的表达,构建IBP过表达的HT-29-IBP细胞株与IBP沉默的HCT116-shIBP细胞株;干预IBP表达后,采用Western blot检测结肠癌细胞EMT相关分子的蛋白表达;Transwell实验检测结肠癌细胞迁移、侵袭能力的改变;MTT实验检测结肠癌细胞增殖能力的改变.结果 HT-29-IBP细胞中上皮相关分子E-cadherin和ZO-1表达水平降低,间质相关分子Fibronectin表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭能力增强(P＜0.05);HCT116-shIBP细胞则E-cadherin、ZO-1表达水平升高,Fibronectin及Snail表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭能力降低(P＜0.05).结论 IBP通过调节EMT促进结肠癌细胞增殖、迁移和侵袭.     

LINC00511通过靶向对滋养层细胞迁移侵袭和上皮间质转化的影响

目的 LINC00511对滋养层细胞的影响及其机制是否与miR-16-5p有关尚未完全明确.文中旨在探讨LINC00511对人绒毛膜滋养层细胞HTR-8/Svneo迁移侵袭和上皮间质转化(EMT)的影响及其分子机制.方法 选取2016年1月至2019年1月安徽医科大学第二附属医院妇产科60例剖宫产产妇的的胎盘组织.检测...     

调控Smad7基因对瘢痕疙瘩角质形成细胞上皮-间质转化的影响

  目的  阐述Smad7对瘢痕疙瘩角质形成细胞上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的影响。  方法  培养瘢痕疙瘩角质形成细胞（KK细胞）和正常皮肤角质形成细胞（NK细胞）,构建Smad7过表达慢病毒载体及Smad7干扰慢病毒载体,筛选最佳过表达和干扰慢病毒以及对照载体分别感染NK和KK细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,将培养细胞分为8组:NK-Control（正常培养的NK细胞）;NK-NC（对照慢病毒筛选的NK细胞）;NK-shSmad7（干扰慢病毒筛选的NK细胞）;NK-mSmad7（过表达慢病毒筛选的NK细胞）;KK-Control（正常培养的KK细胞）;KK-NC（对照慢病毒筛选的KK细胞）;KK-shSmad7（干扰慢病毒筛选的KK细胞）;KK-mSmad7（过表达慢病毒筛选的KK细胞）。CCK-8法观察细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞的凋亡,Transwell小室检测细胞的迁移能力,Western blot检测上皮-间质转化的关键蛋白（N-cadherin和Occludin）表达情况。  结果  成功构建Smad7干扰慢病毒载体和Smad7过表达慢病毒载体。干扰Smad7可促进NK细胞和KK细胞增殖和迁移能力,并抑制KK细胞的凋亡,但对NK细胞的凋亡无明显影响（P>0.05）;过表达Smad7可抑制NK细胞和KK细胞的增殖和迁移能力,并促进其凋亡。干扰慢病毒感染后,与NC组比较,NK细胞和KK细胞Occludin蛋白表达减弱（P<0.01）,KK细胞N-cadherin蛋白表达增多（P<0.01）,但NK细胞N-cadherin蛋白表达无明显变化（P>0.05）;过表达慢病毒感染后,与NC组比较,NK和KK细胞Occludin蛋白表达增多（P<0.05）,NK细胞的N-cadherin蛋白表达降低（P<0.05）,但KK细胞N-cadherin蛋白表达无明显变化（P>0.05）。  结论  Smad7基因的调节可以影响正常皮肤角质形成细胞和瘢痕疙瘩角质形成细胞中的EMT,进而调控细胞的增殖、迁移、凋亡的能力。Smad7基因的调节对瘢痕疙瘩角质形成细胞中EMT的影响大于对正常皮肤角质形成细胞中EMT的影响。     

miR-200a靶向上皮间质转化对卵巢癌细胞黏附与迁移能力的影响

目的 探讨miR-200a对卵巢癌细胞转移的调控作用及其机制.方法 利用慢病毒表达载体,在卵巢癌细胞株SK-OV-3和OVCAR-3中构建稳定上调miR-200a的卵巢癌细胞模型;采用细胞黏附实验和Transwell实验,分别检测miR-200a对卵巢癌细胞黏附和迁移能力的调控作用;利用蛋白印迹(Western blot)实验检测miR-200a对上皮间质转化(EMT)相关基因表达水平的调控作用.结果 成功构建了稳定上调miR-200a的卵巢癌细胞模型SK-OV-3和OVCAR-3;miR-200a过表达抑制了SK-OV-3和OVCAR-3卵巢癌细胞的黏附和迁移能力,上调了上皮细胞表型相关E-钙黏蛋白的表达,降调了间质细胞表型相关波形蛋白和纤连蛋白的表达.结论 miR-200a可能通过阻碍EMT抑制了卵巢癌细胞的转移.     

色素上皮衍生因子通过调控上皮间质转化抑制乳腺癌细胞侵袭和转移

目的探讨色素上皮衍生因子（PEDF）是否通过作用上皮间质转化（EMT）抑制乳腺癌浸润转移。方法免疫组化方法检测 119例浸润性导管癌组织中PEDF、vimentin、E-cadherin表达情况;构建PEDF-siRNA-vector干扰载体,应用RNA干扰技术阻断 乳腺癌SK-BR-3细胞中PEDF表达,并构建重组腺病毒载体构建（Lentivirus-PEDF-vector）,转染SK-BR-3细胞。采用细胞划痕 实验、细胞侵袭实验、Western bolt方法检测SK-BR-3细胞中PEDF表达变化,并釆用Western bolt方法检测乳腺癌细胞上皮性标 志物E-cadherin和间质性标志物vimentin的表达改变,并观察乳腺癌细胞的体外增殖、侵袭、粘附特性的改变。统计分析采用卡 方检验、Fisher精确概率法检验Spearman等级相关检验、配对计数资料检验。结果乳腺浸润性导管癌中PEDF阳性表达率明 显低于正常乳腺组织,PEDF阳性表达与肿瘤大小相关,与E-cadherin表达正相关（r=0.473,P<0.001）, 与vimentin表达呈负相关 （r=-0.412,P<0.001）。乳腺癌SK-BR-3细胞在PEDF条件培养基培养后：细胞形态学发生改变;Transwell侵袭实验表明：细胞 侵袭转移力减弱;PEDF-siRNA增加SK-BR-3细胞的迁移与侵袭,而Lentivirus-PEDF-vector抑制SK-BR-3细胞的侵袭与迁移 能力。Western blot结果显示：细胞中E-cadherin表达明显减少（P<0.05）,vimentin表达明显增多（P<0.05）。结论PEDF基因与 乳腺癌的浸润转移过程密切相关,PEDF可作用SK-BR-3细胞发生EMT进而抑制乳腺癌的浸润转移。     

过表达miR-4328抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化

目的 研究miR-4328在前列腺癌中的作用及分子机制.方法 采用CCK-8方法检测过表达miR-4328对前列腺癌细胞增殖能力的影响, 采用Transwell方法检测对迁移能力的影响, 采用Real-time PCR和Western blotting方法检测上皮间质转化标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及上皮间质转化相关转录因子ZEB1的表达水平.结果 miR-4328在前列腺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织 (P<0.001) .在前列腺癌细胞中, 转染miR-4328 mimics后, 肿瘤细胞的增殖能力显著降低 (P<0.001) .同时过表达miR-4328可以显著降低前列腺癌细胞的迁移能力 (P<0.001) .在前列腺癌细胞中, 过表达miR-4328后, 上皮细胞标志物E-cadherin的表达水平显著上升 (P<0.001) , 而间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的含量显著降低 (P<0.001) .进一步研究发现过表达miR-4328可以下调上皮间质转化相关转录因子ZEB1的表达水平 (P<0.001) .结论 过表达miR-4328显著抑制前列腺癌细胞的增殖能力、迁移能力和上皮间质转化过程.     

lncRNA TTN-AS1通过靶向miR-204-3p调控胃癌细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化

目的：探讨长链非编码RNA肌联蛋白反义RNA 1（lncRNA TTN-AS1）是否可通过靶向微小RNA-204-3p（miR-204-3p）调控胃癌细胞迁移、侵袭及上皮-间质转化（EMT）。方法：采用qRT-PCR法检测胃癌组织、癌旁组织中TTN-AS1、miR-204-3p的表达量;体外培养人胃癌细胞AGS,分别将si-NC、si-TTN-AS1、miR-NC、miR-204-3p mimics、si-TTN-AS1与anti-miR-NC、si-TTN-AS1与anti-miR-204-3p转染至AGS细胞;采用qRTPCR法检测AGS细胞中TTN-AS1、miR-204-3p的表达量;采用Transwell小室实验检测迁移及侵袭能力;双荧光素酶报告实验检测TTN-AS1、miR-204-3p的靶向关系。结果：胃癌组织中TTN-AS1的表达水平比癌旁组织增加约2.90倍（P ＜0.05）,miR-204-3p的表达水平比癌旁组织减少约0.57倍（P ＜0.05）;转染si-TTN-AS1或转染miR-204-3p mimics可明显减少迁移及侵袭细胞数（P ＜0.05）;双荧光素酶报告实验证实TTN-AS1可靶向结合miR-204-3p;共转染si-TTN-AS1与anti-miR-204-3p可明显增加迁移及侵袭细胞数（P ＜0.05）。结论：抑制TTN-AS1表达可通过上调miR-204-3p的表达从而抑制胃癌细胞迁移、侵袭及EMT。     

miR-132通过降低HMGA2的表达抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭及上皮间质转化

目的：研究微小RNA-132（miR-132）对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法：利用实时定量PCR（qRT-PCR）检测骨肉瘤细胞系U2OS和HOS及人成骨细胞系hFOB1.19中miR-132的表达水平。分别向HOS及U2OS细胞转染miR-132模拟物和抑制物,以过表达或敲低细胞内miR-132的表达,利用qRT-PCR验证转染效率。采用Transwell实验、qRT-PCR及Western blot检测过表达和敲低miR-132对骨肉瘤细胞迁移、侵袭及上皮间质转化的影响。通过对Targetscan网站进行检索并利用荧光素酶报告基因实验探究HMGA2为miR-132的靶基因。qRT-PCR和Western blot检测miR-132对HMGA2表达的调控作用。结果：与人成骨细胞系hFOB1.19相比,miR-132在骨肉瘤细胞中的表达水平显著降低（P＜0.05）;向U2OS细胞转染miR-132模拟物后,细胞miR-132的表达水平显著增加（P＜0.01）;过表达miR-132后,U2OS细胞的迁移和侵袭能力显著降低,E-cadherin表达增加,Vimentin表达降低（P＜0.05）;向HOS细胞转染miR-132抑制物后,细胞miR-132的表达水平显著降低（P＜0.01）;敲低miR-132后,HOS细胞的迁移和侵袭能力显著增强,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加（P＜0.05）;生物信息学检索及荧光素酶报告基因证明HMGA2基因为miR-132的靶基因。过表达miR-132可明显降低骨肉瘤细胞中HMGA2的表达,而敲低miR-132可明显增加骨肉瘤细胞中HMGA2的表达（P＜0.05）。结论：miR-132在骨肉瘤细胞中低表达,miR-132可通过抑制HMGA2的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化。     

IL-6对食管癌细胞侵袭迁移及上皮间质转化的影响

目的 研究白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)对食管癌Eca-109细胞增殖、侵袭迁移及上皮间质转化的影响,探讨其作用机制.方法 用不同浓度(0、25、50和100 ng/mL)的IL-6处理Eca-109细胞,采用MTT法检测细胞增殖,细胞划痕实验、Transwell小室实验检测细胞迁移侵袭能力,荧光定量PCR检测E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist1mRNA的表达,Western blot检测Stat3、p-Stat3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist1蛋白表达.结果 与对照组(0 ng/mL)比较,IL-6处理组(25、50、100 ng/mL)在IL-6作用后第1～5天Eca-109细胞增殖增加,呈量效-时效关系(P＜0.05,P＜0.01).IL-6各浓度(0、25、50 ng/mL)组24 h细胞迁移距离分别为(18.20 ±0.89)、(23.77 ±0.40)和(25.27±0.93) mm,与对照组(0 ng/mL)比较,IL-6处理组(25、50 ng/mL) Eca-109细胞体外迁移距离明显增加(P ＜0.05,P＜0.05).IL-6各浓度(0、25、50 ng/mL)组穿过Matrigel胶的细胞分别为(70.33±2.36)、(103.00±3.51)、(118.00±4.00)个/视野,与对照组(0 ng/mL)比较,IL-6处理组(25、50 ng/mL) Eca-109细胞体外穿过Matrigel胶的细胞数量明显增加(P ＜0.05,P＜0.05).荧光定量PCR结果显示,与对照组(0 ng/mL)相比,IL-6处理(25、50 ng/mL)组N-cadherin、Vimentin和Twist1 mRNA达增加(P＜0.05,P＜0.05),E-cadherin mRNA表达降低(P＜0.05).Western blot结果显示,与对照组(0 ng/mL)相比,IL-6各处理(25、50 ng/mL)组p-Stat3、N-cadherin、Vimentin和Twist1蛋白表达增加,E-cadherin蛋白表达降低,Stat3蛋白表达没有明显改变.结论 IL-6可提高食管癌Eca-109细胞体外增殖、侵袭、迁移能力,促进上皮间质转化过程,其机制可能通过活化Stat3蛋白,上调Twist1的表达,进一步调控EMT蛋白(E-cadherin、N-cadherin和Vimentin)的表达.     

miR-34a通过靶向FOXM1对鼻咽癌细胞增殖和上皮间质转化的影响

  目的  研究miR-34a通过靶向FOXM1对鼻咽癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响,并从上皮间质转化方向研究侵袭和迁移的机制。  方法  体外培养人鼻咽癌细胞HNE-1、CNE-2Z,每株细胞分3组,即空白对照组(control组)、阴性对照组(miR-34a nc组)和过表达miR-34a组(miR-34a mimics组)。荧光定量PCR检测转染后各组细胞miR-34a表达水平。生物信息软件预测miR-34a和FOXM1的靶向关系,荧光定量PCR和Western blotting分析靶向关系。上调miR-34a后,CCK-8法测细胞增殖能力,Transwell、实验测细胞迁移、侵袭能力,Western blotting法测上皮间质转化相关蛋白E-cadherin、Vimentin相对表达水平。  结果  生物信息软件预测miR-34a和FOXM1可能存在靶向关系。在HNE-1、CNE-2Z细胞中,与control组和miR-34a nc组比较,miR-34a mimics组FOXM1的表达下调(HNE-1:0.570±0.041、1.127±0.129、1.125±0.145,F=23.672, P=0.001;CNE-2Z:0.689±0.114、1.966±0.164、1.924±0.087,F=99.599, P＜0.001),增殖、迁移和侵袭能力被显著抑制(P < 0.01),E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调(P < 0.01)。Control组和miR-34a nc组差异无统计学意义(P>0.05)。  结论  miR-34q通过靶向FOXM1抑制鼻咽癌细胞的增殖、侵袭和迁移,其机制与抑制上皮间质转化有关。      

SETD8抑制HCT116细胞迁移和上皮间质转化

目的:探究组蛋白修饰酶SETD8在人结肠癌细胞系HCT116中的表达及对细胞迁移和上皮间质转化(EMT)过程的影响.方法:RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测人正常肠上皮细胞系NCM460和肿瘤细胞系HCT116中SETD8的表达,分别用siRNA和过表达SETD8的质粒转染HCT116细胞后完成Transwell实验,蛋...     

环状RNA＿PLEKHM3通过miR-320/KLF4轴调控宫颈癌细胞上皮间质转化

目的 探讨环状RNA含普列克底物蛋白同源域的家族M3成员(PLEKHM3)(circRNA＿PLEKHM3)通过调控微小RNA-320(miR-320)/畸变样因子4(KLF4)轴在宫颈癌细胞上皮间质转化(EMT)行为中的作用与机制。方法 采用实时定量PCR(qRT-PCR)法检测宫颈癌细胞Hela和CaSki中circRNA＿PLEKHM3的表达水平;RNA荧光原位杂交检测circRNA＿PLEKHM3在人宫颈癌上皮细胞CaSki中的定位;双荧光素酶报告基因实验检测circRNA＿PLEKHM3和miR-320的靶向关系,以及miR-320和KLF4的靶向关系;对CaSki细胞过表达circRNA＿PLEKHM3;另外设置三组,分别为在过表达circRNA＿PLEKHM3的基础上过表达miR-320、沉默KLF4,以及在过表达miR-320的基础上沉默KLF4。qRT-PCR检测CaSki中miR-320的表达水平;Western blot检测CaSki细胞中KLF4和EMT标志物上皮钙黏蛋白(E-cadherin)、神经钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)...     

白藜芦醇对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化的抑制作用

目的：探讨白藜芦醇（Res）对胶质瘤U87细胞上皮-间质转化（EMT）、迁移和侵袭能力的调控作用,阐明Res对胶质瘤细胞EMT的抑制作用。方法：将胶质瘤U87细胞分为对照组（不做处理）、EMT组（TGF-β1诱导EMT）和Res处理组（Res处理EMT）。应用Western blotting法检测各组细胞中间质标志物（N-钙黏蛋白、β-连环蛋白和波形蛋白）、诱导EMT的转录因子（Snail、Slug和Twist1）以及基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的蛋白表达水平。划痕愈合实验检测细胞迁移能力,Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力。结果：与对照组比较,EMT组胶质瘤U87细胞的间质标志物（N-钙黏蛋白、β-连环蛋白和波形蛋白）、诱导EMT的转录因子（Snail、Slug和Twist1）和MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均明显升高（P<0.05）;与EMT组比较,Res处理组上述蛋白表达水平明显下调（P<0.05和P<0.01）;40 μmol·L^-1 Res处理组效果较20 μmol·L^-1 Res处理组更明显（P<0.05）。EMT组细胞迁移率和侵袭率明显高于对照组（P<0.01）,而Res处理组胶质瘤细胞迁移率和侵袭率明显低于EMT组（P<0.01）。结论：Res能抑制胶质瘤U87细胞EMT,降低细胞的迁移和侵袭能力。     

MiR-124通过调控Smad4促进C6胶质瘤细胞凋亡的研究

【立论依据】 胶质瘤是中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤。由于外科技术难以做到病理学上的全切除,术后复发率非常高。在前期实验中我们发现C6胶质瘤细胞miR-124含量显著低于与正常大鼠大脑组织,且转染miR-124 后,C6胶质瘤细胞数明显减少。我们应用microRNA靶基因信息软件查到smad4的mRNA与miR-124-3p有3个结合位点,smad4可能是miR-124的靶基因。由此推测miR-124可能通过抑制smad4的蛋白表达对胶质瘤细胞起作用。 【设计思路】 本实验以大鼠C6胶质瘤细胞为研究对象,通过人为转染miR-124,分析其对smad4蛋白表达的影响,并确定smad4为miR-124新靶基因,从而探索miR-124对促进C6胶质瘤细胞凋亡的新作用机制。 【实验内容】 (1)通过qRT-PCR检测正常大鼠大脑、C6胶质瘤细胞、转染后的C6胶质瘤细胞中miR-124的表达水平。(2)转染外源miR-124观察C6胶质瘤细胞的生长状态。(3)结合蛋白质印迹和TUNEL assay方法,比较分析miR-124转染前和后C6胶质瘤细胞凋亡差异。(4)通过qRT-PCR检测比较分析转染miR-124 前后C6胶质瘤细胞中smad4 mRNA的表达变化。(5)用蛋白质印迹检测转染miR-124前后的C6胶质瘤细胞中Smad4表达变化。(6)以siRNA-Smad4 抑制smad4基因的表达后,再转染 miR-124 mimic,通过蛋白质印迹和细胞荧光染色方法比较分析细胞增殖的变化。 【材料】 C6胶质瘤细胞,Lipo2000脂质体,miR-124 mimic,实时PCR仪,超净台,孵箱,相差显微镜,荧光显微镜,PCR相关试剂,蛋白质印迹相关试剂,TUNEL assay试剂盒,Smad4抗体等。 【可行性】 前期研究已证实人工转染miR-124后其细胞数明显降低,smad4的蛋白水平下调;通过microRNA靶基因信息软件查到smad4可能是miR-124的另一个靶基因;项目组成员已熟练掌握研究所需要各种实验技术;实验设备齐全,具有完成上述实验的基本仪器设备。 【创新性】 我们将证明:miR-124通过抑制smad4的蛋白表达,调控smad4,抑制胶质瘤细胞的增殖且促进死亡。已有研究表明miR-124通过抑制靶基因STAT3 的蛋白表达对胶质瘤起作用,但目前尚无关于miR-124与 smad4之间作用关系的报道。