IL-10对人滋养层细胞中HLA-GmRNA表达和HCG分泌的影响

目的研究白介素-10(IL-10)对人滋养层细胞中人类白细胞抗原-G(HLA-G)mRNA表达及人绒毛膜促性腺激素(HCG)分泌的影响,探讨IL-10在母-胎免疫耐受机制中的作用.方法选取正常妊娠6～8周妇女行人工流产术后的绒毛组织21例,每1例标本随机平均分为实验组和对照组,加入IL-10 培养和单独培养72小时,每组均采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)及放射免疫测定(RIA)的方法分别检测HLA-G mRNA的表达量及HCG的分泌水平.结果①两组滋养层细胞中均有HLA-G mRNA的表达及HCG的分泌,实验组HLA-G mRNA的平均表达峰度值为0.28±0.07,对照组HLA-G mRNA的平均表达峰度值为0.15±0.04,差异有非常显著性(P＜0.01);实验组HCG浓度为27.20±4.16 U/L,对照组HCG浓度为23.98±2.27 U/L ,差异有非常显著性(P＜0.01).②直线相关分析表明,滋养层细胞中HLA-G mRNA的表达与HCG分泌之间无相关性.结论IL-10诱导人滋养层细胞中HLA-G mRNA的表达增高及HCG的分泌增加,对促进母-胎之间免疫耐受的形成具有重要作用.     

HLA-G在卵巢癌异位表达的临床和生物学意义

人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G,HLA-G)由非经典HLA-I类基因编码,最初于母胎界面的绒毛膜外滋养层细胞上发现,并证实在胎儿免疫耐受中起重要作用。现研究发现,HLA-G在生理、病理情况下有组织特异性表达,在肿瘤免疫逃逸中HLA-G可能具有重要作用。HLA-G在卵巢肿瘤的表达对卵巢癌高危险患者的早期诊断、鉴别诊断、预后分析、治疗都具有潜在价值。     

HLA-G蛋白在早孕绒毛及葡萄胎中的表达及意义

目的:探讨人类白细胞抗原G(HLA-G)蛋白在早孕绒毛和葡萄胎中的表达及意义。方法:应用免疫组化法检测30例早孕绒毛、20例葡萄胎和11例侵蚀性葡萄胎中HLA-G蛋白的表达情况。结果:①在早孕绒毛,HLA-G蛋白仅表达于绒毛外滋养层细胞,而在其他滋养层细胞则未见表达;②HLA-G蛋白在早孕绒毛、葡萄胎和侵蚀性葡萄胎中表达依次增强,三者比较,差异非常显著(P<0.001)。结论:HLA-G蛋白的表达可能与滋养细胞的侵袭行为有关,在滋养细胞肿瘤的侵袭中有一定作用。     

免疫与遗传

058 用抗滋养层细胞单克隆抗体(NDOG2)经流式细胞器分离及鉴定人绒毛胰滋养层内层细胞[英]/Caulfield JJ…//J Reprod Immunol.-1992,21.-71～85 要对滋养层内层细胞功能及其与母体组织的相互作用进行研究必需对细胞进行分离纯化。以前报道用酶消化及经流式细胞器可高度纯化滋养层内层细胞。但此法分离的细胞在与W6132(识别HLA-G、-A、-B、-C抗原的抗体)抗体反应性及各种滋养层标志方面仍是弃质性群体。免疫组织学研究     

激活素A和卵泡休止素对人滋养层细胞增殖和激素分泌的调节作用

目的: 探讨激活素A和卵泡休止素对人早孕绒毛滋养层细胞的增殖和人绒毛膜促性腺激素及孕酮分泌的调节作用。方法: 早孕绒毛用胰蛋白酶与胶原酶联合消化后,再用小牛血清白蛋白密度梯度离心,分离纯化后所得的滋养层细胞进行体外原代培养。将不同浓度激活素A加入细胞培养液中作用48 h,观察其对滋养细胞生长和人绒毛膜促性腺激素及孕酮分泌的影响。向滋养层细胞培养液中加入激活素A和不同浓度的卵泡休止素,培养24 h,观察相互作用。结果: 激活素A和卵泡休止素都不影响滋养层细胞的增殖。激活素A以剂量依赖的方式促进滋养层细胞绒毛膜促性腺激素的分泌和孕酮的分泌,滋养细胞分别经30 ng/mL,100 ng/mL激活素A处理后,培液中绒毛膜促性腺激素和孕酮水平达到高峰(P均<0.01)。激活素A对滋养层细胞激素分泌的影响,可以被其特异结合蛋白卵泡休止素以剂量依赖方式阻断。结论: 激活素A和卵泡休止素以自分泌方式调节滋养层细胞绒毛膜促性腺激素和孕酮分泌,但并不影响细胞增殖,激活素A与卵泡休止素在人早期妊娠中起重要的生理作用。     

小分子干扰RNA对绒毛膜癌细胞人类白细胞抗原G 基因表达的影响

目的探讨小分子干扰RNA(siRNA)对绒毛膜癌(绒癌)细胞中人类白细胞抗原G(HLA-G) 基因表达的影响,了解HLA-G基因在绒癌发生、发展中的作用.方法设计并合成HLA-G siRNA,分为两组.实验组以不同浓度(分别为1.0、 2.5、 5.0 μg/L,下同)的HLA-G siRNA转染HLA-G基因高表达的绒癌细胞系JEG-3细胞,对照组以等量阴性对照siRNA转染JEG-3细胞.实时荧光定量RT-PCR技术检测转染后JEG-3细胞中HLA-G mRNA的表达,HLA-G mRNA的表达以PCR循环数阈值(Ct值)表示;蛋白印迹法测定JEG-3细胞中HLA-G蛋白的表达;显微镜观察并计数转染后存活的JEG-3细胞数.结果 HLA-G siRNA转染JEG-3细胞后,明显下调JEG-3细胞中HLA-G mRNA及蛋白的表达水平.实验组不同浓度的HLA-G siRNA转染后,JEG-3细胞的Ct值[分别为(20.67±0.02)、(21.37±0.03)、(21.43±0.02)个循环数],分别与对照组[分别为(20.33±0.01)、(20.37±0.02)、(20.40±0.03)个循环数]比较,差异有统计学意义(P<0.05).上述浓度转染后,实验组JEG-3细胞的HLA-G蛋白表达水平[分别为0.42±0.03、0.37±0.02、0.12±0.04],分别与对照组[分别为1.69±0.23、1.62±0.31、1.36±0.22]比较,差异有统计学意义(P<0.01).实验组JEG-3细胞生长较对照组明显受到抑制(P<0.05).结论 HLA-G siRNA可以下调HLA-G mRNA及蛋白的表达水平,抑制细胞生长,表明HLA-G基因在绒癌的发生、发展中具有重要作用.     

过表达P57KIP2基因对滋养层细胞生物学行为的影响

目的:探究P57KIP2基因过表达之后对滋养层细胞生物学行为的影响。方法:采用实时荧光定量(q PCR)及Western Blot方法检测人绒毛膜滋养层细胞(HTR8-/SVneo)过表达P57KIP2基因后mRNA和蛋白水平的表达变化;用Transwell方法检测HTR8-/SVneo细胞过表达P57KIP2基因后迁移、侵袭能力生物学行为的变化;CCK8检测HTR8-/SVneo细胞过表达该基因后增殖能力的变化。采用免疫荧光检测HTR8-/SVneo细胞过表达该基因后,抗凋亡蛋白Bcl2的表达变化。结果:滋养层细胞过表达P57KIP2基因后,其mRNA及蛋白水平均明显增高(P0.05);P57KIP2基因过表达后滋养层细胞的迁移、侵袭数量均明显增高,差异有统计学意义(P0.05);滋养层细胞的细胞相对吸光值48小时后明显增高(P0.001);过表达P57KIP2基因后滋养层细胞中抗凋亡蛋白Bcl2表达增高(P0.05)。结论:P57KIP2基因可能会增加滋养层细胞迁移、侵袭以及增殖能力,P57KIP2基因可能参与调控滋养细胞的凋亡过程。     

青海地区子痫前期患者HLA-GmRNA及蛋白表达研究

目的:探讨青海高原地区子痫前期患者人类白细胞相关抗原G(HLA-G)mRNA、蛋白表达情况及临床意义。方法:收集2011年9月至2011年12月在青海大学附属医院产科分娩的30例子痫前期患者和30例正常妊娠妇女的胎盘组织和血清样品,采用实时荧光定量PCR及West-ernblot分析检测HLA-GmRNA和蛋白在正常妊娠与子痫前期患者胎盘中的表达差异,并应用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中可溶性HLA-G的表达。结果:①青海高原地区子痫前期患者胎盘组织中HLA-GmRNA、蛋白表达水平明显低于正常妊娠组,差异有统计学意义(P<0.05)。②子痫前期患者血清中可溶型HLA-G(sHLA-G)浓度明显低于正常妊娠组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:HLA-G基因转录的下调及其蛋白质表达下降,在青海高原地区子痫前期的发生发展过程中可能发挥重要作用。     

胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外人滋养层细胞孕酮分泌的影响

目的:探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对人早孕绒毛滋养层细胞孕酮(P)的合成和调节 作用。方法:将胰蛋白酶和胶原酶联合消化人早孕绒毛滋养组织,Percoll密度梯度分离纯化后得 到的人早孕胎盘滋养层细胞进行原代培养。以终浓度为0.1μg/L、1μg/L、10μg/L、100μg/L　IGF-I分 别对其作用12h,以及100μg/L浓度IGF-I作用12h、24h、48h、72h时,放免法检测滋养细胞 分泌P 的含量,RT-PCR法检测低密度脂蛋白受体(LDLR)mRNA的表达。结果:滋养层细胞P 的 分泌量随着IGF-I的浓度升高而增加;同时100μg/L浓度的IGF-I作用于滋养层细胞12h 后,P 分泌开始增加,48h达到高峰,以后逐渐下降。半定量RT-PCR均显示LDLRmRNA阳性条带,且表 达规律与P一致。结论:滋养层细胞P的分泌具有对IGF-I的时间和浓度依赖性,并且IGF-I能 上调LDLRmRNA的表达,对促进滋养细胞P分泌的调节起重要作用。     

甾体激素对绒毛外滋养细胞表达HLA-G蛋白的影响

目的:探讨甾体激素(E_2、P_4)对绒毛外滋养细胞表达HLA-G的影响。方法:将分离培养的绒毛外滋养细胞(EVT)分成E_2组、孕酮(P_4)组、E_2+P_4组和空白对照组,分别向各组EVT培养液中加入不同浓度的17β-雌二醇、孕酮及17β-雌二醇+孕酮,空白对照组则不加任何激素,48h后,流式细胞仪检测各组HLA-G蛋白的表达。结果:①单独使用E_2或P_4均能上调EVT表达HLA- G蛋白,上调作用与其浓度关系密切,与对照组相比,差异有显著性(P＜0．01);②联合应用E_2+P_4亦上调EVT表达HLA-G蛋白,1000 nmol/L的E_2+P_4组HLA-G蛋白的表达,明显高于低浓度组(1nmol/L、10nmol/L、100nmol/L),差异有显著性(P＜0．01);③低浓度的E_2+P_4组(1nmol/L)HLA- G蛋白的表达高于同浓度的P_4组(P＜0．05),而低于同浓度的E_2组(P＜0．001);1000nmol/L,E_2+P_4组HLA-G表达显著高于单纯的E_2、P_4组(P＜0．01)。结论:①低浓度的E_2、P_4对HLA-G调节呈拮抗作用,高浓度E_2和P_4则以协同作用调节HLA-G的表达;②HLA-G可能参与了卵巢甾体激素调节胚胎植入进程。     

人类白细胞抗原G、E在人胎盘组织中的表达及其意义

目的:探讨人类白细胞抗原G、E(HLA-G、E)在人胎盘组织中的表达及意义。方法:用原位杂交及免疫组化法分别检测HLA-G、E mRNA及蛋白质在人正常早孕绒毛组织、晚孕胎盘组织中的表达。结果:在人正常早孕绒毛组织中的绒毛细胞滋养细胞、合体滋养细胞及绒毛外滋养细胞(EVCT)内均有HLA-G、E mRNA及HLA-E蛋白质表达,而HLA-G蛋白质仅在EVCT内表达;晚孕胎盘组织中HLA-G、E mRNA及蛋白质表达于蜕膜板内的EVCT及羊膜上皮细胞。结论:HLA-E表达于人正常早孕绒毛组织中所有类型的滋养细胞及晚孕胎盘组织中的EVCT和羊膜上皮细胞。抗人HLA-G单克隆抗体4H84仅能检测出人胎盘组织中EVCT及羊膜上皮细胞内的HLA-G蛋白。     

甲氧滴滴涕对人绒毛外滋养细胞的白细胞表面抗原G(HLA-G)表达的影响

目的:探讨甲氧滴滴涕(MXC)对绒毛外滋养细胞(EVCT)白细胞表面抗原G(HLA-G)表达的影响。方法:用胰蛋白酶消化加流式细胞仪分离得到人绒毛外滋养细胞,进行原代培养及鉴定。将所获细胞分为MXC(1μmol/L、3μmol/L、5μmol/L、7μmol/L)处理组及空白对照组,培养12h、24h、48h。用Western blotting检测各组各时间点HLA-G的表达,同时用RT-PCR法检测HLA-GmRNA表达。结果:MXC处理组滋养细胞HLA-G表达呈时间剂量依赖性下降,HLA-G mRNA变化与其一致。结论:MXC可从蛋白和mRNA水平降低绒毛外滋养细胞HLA-G表达,从而降低其免疫耐受功能。     

人类白细胞抗原G及其异构体mRNA在人类着床前胚胎的表达

目的研究人类白细胞抗原G（human leukocyte antigen，HLA-G）及其异构体mRNA在人类着床前胚胎的表达，探讨HLA-G在人类胚胎早期发育中的作用和意义。方法第四军医大学唐都医院妇产科生殖医学中心2003-01-2005-12期间，以体外受精-胚胎移植技术助孕过程中剩余的患者自愿捐赠的人类早期胚胎作为研究对象，采用巢式RT-PCR检测早期胚胎HLA-G及其异构体mRNA的表达。结果检测20个受精后2—3d的人类卵裂期胚胎，2、4、6、8细胞期胚胎各5个，有7个胚胎表达HLA-G及其部分的异构体mRNA。检测5个受精后4d的人类桑葚胚，全部表达HLA-G及其部分的异构体mRNA。检测25个受精后6d的扩张期囊胚，全部受检囊胚均表达HLA-G mRNA，但异构体表达不同。在受检的25个扩张期囊胚中，20个表达HLA-G1（表达率80．0％），4个表达G2（表达率16．0％），25个表达G3（表达率100％）、24个表达G4（表达率96．0％），5个表达G5（表达率20．0％），8个表达G6（表达率32．0％）。结论着床前的人类胚胎表达HLA-G及其异构体mRNA，其阳性表达胚胎的比例，随着胚胎发育的进程而增加。HLA-G异构体在人类着床前胚胎差异表达。     

靶向人类白细胞抗原G1(HLA-G1)的siRNA真核表达载体的构建及表达

目的:构建靶向人类白细胞抗原G1(HLA-G1)的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体(pSUPER-HLA-G1),并检测其在滋养细胞系HTR-8/SVneo中的敲减效率。方法:将设计的HLA-G1 siRNA寡聚脱氧核苷酸链与真核表达载体pSUPER连接,构建重组pSUPER-HLA-G1真核表达载体,并用脂质体法将其转染入HTR-8/SVneo细胞系中。pSUPER-HLA-G1质粒转染后采用RT-PCR检测HLA-G1在HTR-8/SVneo细胞中的基因转录情况,Western blotting检测HLA-G1蛋白的表达情况。结果:构建的真核表达载体pSUPER-HLA-G1可在HTR-8/SVneo细胞中表达,HLA-G1 mRNA和其蛋白表达抑制率分别为74.85±7.43%和71.07±6.11%。结论:构建的人HLA-G1 siRNA蛋白真核表达载体pSUPER-HLA-G1有效地沉默了HLA-G1在HTR-8/SVneo滋养细胞中的基因表达及蛋白表达,为今后以HLA-G1为靶点的基因研究奠定了基础。     

HLA-G蛋白在人类着床前胚胎的表达

目的:探讨HLA-G在人类胚胎早期发育和免疫耐受中的作用和意义。方法:以体外受精-胚胎移植技术助孕过程中剩余的、自愿捐赠的人类早期胚胎作为研究对象,采用免疫荧光染色技术,检测人类着床前胚胎HLA-G蛋白的表达。结果:采用MEM-G/9单抗进行了HLA-G免疫荧光染色,20个2-8-细胞期的人类早期胚胎中15个胚胎HLA-G蛋白检测阳性;3个桑椹胚和5个囊胚均为阳性。结论:着床前人类早期胚胎表达HLA-G蛋白。     

N-glycans of human amniotic fluid transferrin stimulate progesterone production in human first trimester trophoblast cells in vitro

AIMS: During pregnancy, the placenta produces a variety of steroid hormones and proteins. Several of these substances have been shown to exert immunomodulatory effects. Progesterone is thought to mediate some of these effects by regulating uterine responsiveness. The aim of this study was to clarify the effect of amniotic fluid transferrin and its N-glycans on the release of progesterone by first trimester trophoblast cells in vitro. METHODS: Cytotrophoblast cells were prepared from human first trimester placentae by trypsin-DNAse dispersion of villous tissue followed by a percoll gradient centrifugation and depletion of CD45 positive cells by magnetic cell sorting. Trophoblasts were incubated with varying concentrations (50-300 microg/ml) of transferrin from human amniotic fluid and serum as well as with N-glycans obtained from amniotic fluid transferrin. Culture supernatants were assayed for progesterone by enzyme-immunometric methods. RESULTS: The release of progesterone increased in amniotic fluid transferrin- and N-glycan-treated trophoblast cell cultures compared to untreated trophoblast cells. There was no stimulating effect of serum transferrin on the progesterone production of trophoblast cells. CONCLUSIONS: The results suggest that amnion-transferrin and especially its N-glycans modulate the endocrine function of trophoblasts in culture by up regulating progesterone secretion.     

不明原因的胎儿生长受限胎盘组织HLA-G mRNA的表达及其临床意义

目的:检测人类主要相容性抗原HLA-G mRNA在不明原因胎儿生长受限(FGR)患者胎盘中的表达,以探讨免疫遗传基因HLA-G与不明原因的FGR发病之间的关系。方法:采用反转录聚合酶链法(RT-PCR),检测20例不明原因的FGR(研究组),28例正常产妇(对照组)胎盘组织中的HLA-G mRNA的表达水平。结果:不明原因的FGR组的胎盘组织HLA-G mRNA的表达水平明显低于正常组,经统计学分析,差异有显著性(P=0.024)。胎盘组织HLA-G mRNA表达的相对量与新生儿的体重呈正相关,Pearson相关系数r=0.512,P<0.05.结论:不明原因FGR胎盘组织中HLA-G mRNA表达量较正常下降,提示胎盘组织HLA-G mRNA表达异常可能参与了FGR的发生发展。     

The short forms of HLA-G are unlikely to play a role in pregnancy because they are not expressed at the cell surface

HLA-G is a nonclassical class I MHC molecule of unknown function expressed on human invasive trophoblast. In trophoblast cells, HLA-G mRNA is alternatively spliced into a variety of forms which are predicted to encode a full length membrane-bound form, three short membrane-bound isoforms and two soluble isoforms. The aim of this study was to determine which of these protein isoforms are translated, which are expressed on the cell surface and which are secreted. Artificial cDNAs encoding the isoforms were generated by PCR mutagenesis, ligated to an epitope tag and transfected into a human cell line capable of expressing MHC class I. Protein products of appropriate sizes were detected in cells transfected with cDNAs encoding all membrane-bound forms, but surface biotinylation studies indicated that only full length membrane-bound HLA-G was present at the cell surface. Full length HLA-G was also detected by surface antibody binding and flow cytometry. Soluble HLA-G1 was detected in cells transfected with the appropriate cDNA only after treatment with monensin, which inhibits transport of glycoproteins through the Golgi apparatus. These results suggest that full length HLA-G, but not short HLA-G isoforms can be expressed on the surface of human cells and that soluble HLA-G is rapidly secreted. Thus, it is likely that the full length membrane-bound and soluble forms of HLA-G are the only biologically active forms to which the mother is exposed.