鼠伤寒脂多糖表位模拟位的筛选

目的获得模拟脂多糖抗原表位的噬菌体环状展示肽。方法用抗鼠伤寒菌脂多糖单克隆抗体2F4为靶分子,亲和筛选噬菌体随机环七肽库,双夹心ELISA及特异性抗原抑制试验鉴定阳性克隆。结果经三轮筛选,随机挑选38个克隆,其中34个克隆显示与2F4结合。鼠伤寒沙门氏菌脂多糖可抑制噬菌体克隆与2F4结合,所有克隆的半数抑制浓度为(0.125~0.250)μg/ml。挑选10个克隆测序并推导氨基酸序列,其中7个克隆出现P-X-WAS-X-W保守序列;10个序列中非极性氨基酸含量平均值为71.4%。结论噬菌体展示环七肽可模拟鼠伤寒沙门氏菌脂多糖抗原表位。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的：获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽，作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法：以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞，成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选，用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果：经三轮筛选，从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个特异性与骨肉瘤细胞os-732结合，而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论：得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆，提示骨肉瘤细胞表面结构复杂，具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性，为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。     

骨肉瘤细胞特异性结合短肽的筛选

目的获得与骨肉瘤细胞株os-732特异结合的短肽,作为骨肉瘤靶向治疗的先导化合物。方法以骨肉瘤细胞os-732为靶细胞,成骨细胞为吸附细胞对噬菌体12肽库进行差减筛选,用细胞ELISA、免疫组化鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果经三轮筛选,从随机挑选的20个噬菌体克隆中得到9个能特异性与骨肉瘤细胞os-732结合,而不与正常成骨细胞结合的阳性克隆。但其氨基酸序列无同源性。结论得到多个序列不同的特异性结合骨肉瘤的噬菌体克隆,提示骨肉瘤细胞表面结构复杂,具多个骨肉瘤抗原表位。本实验获得的短肽具有一定的亲合力和肿瘤特异性,为针对不同位点的靶向药物设计提供了实验依据。     

噬菌体展示短肽模拟脂多糖结合蛋白抗炎功能位点的研究

目的应用噬菌体随机12肽库筛选脂多糖结合蛋白(lipopolysaceharide binding protein,LBP)具有抗炎作用的肽序列.方法以LPS为目标分子,对噬菌体十二肽库进行亲合筛选,4轮筛选后,检测随机挑取的噬菌体克隆的结合活性和抑制活性,对可与LBP竞争性结合LPS的噬菌体克隆行细胞因子生成抑制实验和LPS内化抑制实验,对获得的阳性克隆进行DNA序列测定,推导外源肽氨基酸序列,并与LBP序列比较,确定LBP的抗炎功能位点.结果随机挑取的100个噬菌体克隆中16个可与LBP竞争性结合LPS,其中7个噬菌体克隆对LBP的增敏LPS刺激PBMC分泌TNF-α功能无作用,对这7个克隆进行LPS内化抑制实验,其中3个克隆可以抑制LBP增强LPS内化作用.测序发现这3个阳性克隆融合多肽的序列均为FHTRWNYWPYLH,与IBP一级结构氨基酸序列同源性低.结论该12肽序列可以模拟LBP的抗炎功能位点.     

从噬菌体随机肽库筛选庚型肝炎病毒E2抗原表位

目的：筛选能识别庚型肝炎病毒（ＨＧＶ） Ｅ２区的单克隆抗体和有竞争抑制活性的多肽。方法：利用抗ＨＧＶ Ｅ２区的３株单克隆抗体Ｍ６,Ｍ１３,Ｍ３０作为筛选配基,对构象限制性的随机环９肽库进行亲和筛选,并对阳性噬菌体克隆进行功能鉴定。结果：证实亲和筛选具有良好的富集效果后,随机挑出１６个噬菌体克隆进行交叉结合实验,有１４个克隆与Ｍ６抗体有较强的特异结合;其中１０个克隆在竞争抑制实验后中抑制率大于５０％     

人源多克隆抗血清识别的HBsAg模拟表位筛选

目的 获得与乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）人源抗血清特异结合的噬菌体呈现模拟多肽,加深对乙肝病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）Ｂ细胞表位的了解。方法 基于噬菌体小衣壳蛋白（ｇｐⅢ）构建１２氢基酸随机肽库,经混合多克隆人源ＨＢｓＡｇ阳性血清的三轮筛选,阳性噬菌体经ＥＬＩＳＡ和竞争实验证实,并测定其对应呈现多肽的插入序列,分析其氨基酸序列与ＨＢｓＡｇ的相似性,结果 两个噬菌体颗粒在ＥＬＩＳＡ实验中呈阳性,其中     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

从噬菌体展示随机肽库中筛选豌豆凝集素的结合肽

目的:从噬菌体展示随机肽库中筛选能与豌豆凝集素(PSA)特异结合的短肽.方法:①用豌豆凝集素(PSA)作为靶蛋白,对噬菌体展示的随机六肽库进行亲和筛选;②α-甲基-D-甘露糖苷对筛选出的噬菌体和PSA结合的影响实验(点印迹法); ③选择性地合成了3条6肽ARMWSF、RYDYSY、LRLRQL,用不同浓度的6肽对PSA、ConA与HRP的结合进行竞争抑制实验.结果:经过三轮筛选后,这些噬菌体展示肽有明显的富集,从第三轮挑选的22个克隆的插入氨基酸序列可分为三大类;点印迹结果表明,这些噬菌体展示肽能与PSA特异结合,而α-甲基-D-甘露糖苷不同程度地抑制这种结合; LRLRQL不溶于水,ARMWSF和RYDYSY对PSA和HRP的结合有抑制,而对ConA和HRP的结合没有明显抑制.结论:人工合成的2条6肽和PSA的结合部位与α-甲基-D-甘露糖苷和PSA结合的部位并非相同.     

表达幽门螺杆菌过氧化氢酶的无抗性减毒鼠伤寒沙门氏菌株的构建

OBJECTIVE: To construct a non-resistant attenuated Salmonella typhimurium (S.typhimurium) strain capable of expressing Helicobacter pylori (Hp) catalase. METHODS: After PCR amplification, the gene fragment encoding Hp catalase was inserted into the expression vector pYA248 containing asd gene, and the recombinant vector was then introduced into the host S.typhimurium strain X4072 depleted of genes encoding adenylate cyclase (delta cya), cyclic adenosine monophosphate receptor protein (delta crp) and aspartate-beta-semialdehyde dehydrogenase (delta asd). Bridged enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was employed to measure the antigenicity of the catalase expressed in the sonicate and culture supernatant. According to Meacock's method and with the assistance of the growth curve, the stability of the recombinant strain was evaluated. A half lethal oral dose test was conducted to evaluate the safety of recombinant strain. RESULTS: S.typhimurium X4072 (pYA248-CAT) with expected capacity was successfully constructed, and bridged ELISA demonstrated higher catalase levels in the culture supernatant than in the sonicate of the recombinant strain X4072 (pYA248-CAT). After the strain was passaged for 100 generations without selection pressure, all the randomly selected colony of the recombinant strain grew well with positive catalase antigenicity as identified by ELISA. The growth curve of the recombinant strain showed comparable growth status of the 2 strains X4072 (pYA248) and X4072 (pYA248-CAT). The survival rate of C57BL/6 mice was 100% 30 d after oral administration of 1.0x10(10) cfu X4072 (pYA248-CAT). CONCLUSION: Non-resistant S. typhimurium vaccine X4072 (pYA248- CAT) is constructed successfully, which is stable in vitro and safe as confirmed by animal experiment. This vaccine provides a new candidate for viable oral vaccine against Hp infection.     

Screening of TACE Peptide Inhibitors from Phage Display Peptide Library

Summary： To obtain the recombinant tumor necrosis factor-α converting enzyme （TACE） ectodomain and use it as a selective molecule for the screening of TACE peptide inhibitors, the cDNA coding catalytic domain （TS00） and full-length ectodomain （T1300） of TACE were amplified by RT-PCR, and the expres.sion plasmids were constructed by inserting T800 and T1300 into plasmid pET-28a and pET-28c respectively. The recombinant TS00 and T1300 were induced by IPTG, and SDS-PAGE and Western blotting analysis results revealed that TS00 and T1300 were highly expressed in the form of inclusion body. After Ni^2＋-NTA resin affinity chromatography, the recombinant proreins were used in the screening of TACE-binding peptides from phage display peptide library respectively. After 4 rounds of biopanning, the positive phage clones were analyzed by ELISA, competitive inhibition assay and DNA sequencing. A common amino acid sequence （TRWLVYFSRPYLVAT） was found and synthesized. The synthetic peptide could inhibit the TNF-α release from LPS-stimulated human peripheral blood mononuclear cells （PBMC） up to 60.3%. FACS analysis revealed that the peptide mediated the accumulation of TNF-α on the cell surface. These results demonstrate that the TACE binding peptide is an effective antagonist of TACE.     

鼠伤寒沙门菌L型变异对噬菌体敏感性的影响

目的：探讨鼠伤寒沙门菌的Ｌ型变异对噬菌体敏感性的影响。方法：用１２株鼠伤寒沙门菌分型噬菌体对３株体外诱导的鼠伤寒沙门菌Ｌ型及其原菌做噬菌体敏感性检测。结果：裂解原菌的噬菌体大多不能裂解其Ｌ型菌，只有少数噬菌体能同时裂解原菌及其Ｌ型菌。结论：鼠伤寒沙门菌的Ｌ型变异可引起噬菌体受体的丢失，从而导致对相应的噬菌体不再敏感。     

鼠伤寒沙门菌L型的诱导及其超微结构观察

目的：获得稳定的鼠伤寒沙门菌Ｌ型菌株，了解其超微结构。方法：用羧苄青霉素将５株鼠伤寒沙门菌诱导为Ｌ型，透射电镜观察其超微结构。结果：诱导出的鼠伤寒沙门菌Ｌ型呈典型的油煎蛋样菌落，菌体呈显著多形性，且难以回复。电镜下可见巨型体、球形体和丝状体多完全缺壁，少数有部分细胞壁残留。原生小体完全缺壁，部分呈空心状。有些巨型体内有大量原生小体产生。结论：获得的鼠伤寒沙门菌Ｌ型是细胞壁严重缺陷的稳定Ｌ型，是对其生物学特性和致病性进行深入研究的良好材料。     

LBP抑制肽对内毒素诱导的脓毒血症小鼠的保护作用

目的 研究脂多糖结合蛋白抑制肽(P12)对内毒素脂多糖(LPS)诱导的脓毒血症小鼠TLR4、CD14及肿瘤坏死因子a(TNFa)表达和小鼠生存率的影响.方法 40只小鼠随机分为5组:对照组、内毒素血症组、低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组,每组8只.腹腔内注射LPS复制脓毒血症模型,尾静脉注射P12,蛋白定量方法 (Western blot)检测TLR4和CD14蛋白的表达,ELISA法检测小鼠血清中TNF-a的含量.结果 抑制肽组TLR4和CD14蛋白的OD值较LPS组低,较正常组高.脓毒血症组小鼠血清中TNF-a的含量显著高于对照组[(180.17±39.14)pg/mL比(24.88±5.82)pg/mL,P<0.01];低剂量P12组、中剂量P12组和高剂量P12组血清中TNF-a的含量分别为(112.69±19.78)、(86.34±9.25)和(70.48±8.48)pg/mL,均明显低于脓毒血症组(均P<0.05).结论 脂多糖结合蛋白抑制肽通过抑制由TLR4和CD14介导的LPS跨膜信号转导,降LSP诱导的TNFa的释放,提高了脓毒血症小鼠的生存率.表明脂多糖结合蛋白抑制肽对急性肺损伤或脓毒血症可能具有潜在的预防和早期治疗作用.     

鼠伤寒沙门氏菌R质粒检测及其不相容性分群研究的初步探讨

本文作了248株河南、内蒙两省区来源的鼠伤寒沙门氏菌的药敏试验,挑选44株 抗菌株检测出20例含R质粒的菌株,并进一步对检出的R质粒作了不相容性分群的初步研究。药敏试验结果表明,两省区抗药性菌株及三抗以上的多重抗性株检出率都很高,没有显著性差异,但各种抗性标记及其不同组合的分布有所不同。不相容试验确定出一个质粒(来源河南菌株)为FN群;一个质粒(来源于内蒙菌株)为C群;二个质粒(来源于内蒙菌株)为W群。另17个R质粒未能确定其不相容分群,本文对其不能分群的原因作了讨论。     

人端粒酶逆转录酶功能区表位的筛选与鉴定

目的 筛选并鉴定人端粒酶逆转录酶(hTEIH)功能区表位。方法 应用差减筛选法，以抗hTERT多克隆抗体为靶筛选噬菌体12肽库，通过夹心ELISA、抗hTERT多抗特异性阻断实验、竞争抑制实验鉴定阳性噬菌体克隆并测序。结果 经3轮筛选，从随机挑取的24个噬菌体克隆中有13个克隆特异地与抗hTERT多抗结合，而不与正常小鼠IgG结合，其中11个克隆的氨基酸序列富含组氨酸(最高达41．6％)及亲水氨基酸(最高达91．67％)。结论 得到11个序列不同的hTERT表位，为研制针对hTERT的小分子抑制剂提供了实验依据。     

枢复宁的鼠伤寒沙门氏菌诱变性研究

目的 观察枢复宁的诱变作用。方法 应用鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验研究了枢复宁的诱变作用，试验选用TA97、TA98、TA100、TA102菌株。结果 当枢复宁的浓度在0．5、5、50、500、5000μg／皿，无论加或不加S9混合物时其对四株沙门氏菌株的回复突变作用均为阴性。结论 枢复宁在体外对原核细胞无诱变作用。     

Deletion of Salmonella enterica serovar typhimurium sipC gene

Objective:To construct a novel plasmid as Salmonella enterica serovar typhimurium(S.typhimurium)sip C gene knockouts candidate.Methods:In this research,50upstream and 30downstream regions of S.typhimurium sip C gene and kanamycin gene were PCR amplified.Each of these DNA fragment was cloned into p GEM T-easy vector.The construct was confirmed by PCR and restriction digest.Results:PCR amplified 320,206 and 835 bp DNA fragments were subcloned into p ET-32 vector resulting with a plasmid called p ET-32-sip C up-kan-sip C down.Conclusions:The new plasmid(p ET-32-sip C up-kan-sip C down)is useful for genetic engineering and for future manipulation of S.typhimurium sip C gene.