SRB法检测As_2O_3对KB细胞和Tca8113细胞毒性的研究

目的:采用SRB(Sulforhodamine B)法研究三氧化二砷(As2O3)对人口腔鳞癌KB细胞和Tca8113的细胞毒性。方法:采用SRB法检测As2O3作用于KB细胞和Tca8113细胞前后的A值变化。结果:SRB法检测结果显示在KB组,1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4μg/mL质量浓度的As2O3所对应的A值分别为0.11、0.21、0.26、0.27、0.27;在Tca8113组,1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4μg/mL质量浓度的As2O3对应的A值分别为0.48、0.81、0.93、0.97、0.97。结论:As2O3对人口腔鳞癌KB细胞和Tca8113细胞的增殖有明显抑制作用,癌细胞抑制率呈现出剂量依赖性效应关系。     

细胞角蛋白13在全反式维甲酸和三氧化二砷诱导分化人口腔鳞癌细胞系KB中的表达

目的研究细胞角蛋白（cytokertin,CK）13及其基因在全反式维甲酸（all—transretinoicacid,ATRA）和三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导分化人口腔未分化鳞癌细胞系KB中的表达和意义。方法采用MTT法观察ATRA和As2O3对KB细胞的敏感程度,Western blot法和RT—PCR法观察KB细胞经ATRA和As2O3诱导分化后的CK13和CK13-mRNA的表达。结果MTT法显示ATRA和As2O3的ICS0分别为35．9×10^-6mol／L和1．55×10^-6mol／L,As2O3对KB细胞药物化学敏感性比ATRA高;Western blot法显示ATRA和As2O3对KB细胞诱导分化后24hCK13无表达,48hCK13出现弱表达,72hCK13出现明显的表达;RT-PCR法显示ATRA和As2O3对KB细胞诱导分化后24hCK13-mRNA表达明显升高,48h达到高峰,72h出现下降的趋势,并且CK13-mRNA的表达变化提前于CK13的表达。结论CK13可作为口腔鳞癌诱导分化标记物和判断临床口腔鳞癌诱导分化疗效的指标。     

脱落酸对Tca8113细胞诱导分化影响的体外实验

目的探讨植物激素中脱落酸（ABA）对人舌鳞癌Tca8113细胞的诱导分化作用。方法采用脱落酸处理Tca8113细胞,观察Tca8113细胞生长和形态变化,SABC免疫组化检测细胞表面分化标志物Involucrin、RARβ及原位杂交检测Caspase- 3 mRNA的表达变化,并比较细胞表面分化标志物的表达水平与Caspase- 3 mRNA表达两者间相关性。结果Tca8113细胞经ABA作用后,细胞生长抑制明显（P<0.05）,Tca8113细胞表现出向正常细胞转化的趋势。脱落酸作用24 h时细胞Involucrin、RARβ蛋白以及Caspase- 3 mRNA表达均增高,不同浓度实验组中其表达存在显著性差异（P<0.05）。1×10-2mmol/L ABA作用12 h和24 h时,Involucrin、RARβ和Caspase- 3 mRNA表达之间呈正相关（P<0.05）。结论脱落酸可通过提高Involucrin、RARβ表达水平,激活Caspase- 3 mRNA的表达,从而促进肿瘤细胞分化及凋亡。     

三氧化二砷结合低剂量照射对口腔癌细胞抑制作用的研究

目的探讨三氧化二砷（AS2O3）和低剂量照射（750cGY）结合对口腔鳞癌细胞和人血管内皮细胞的体外抑制作用。方法采用MTT法检测不同浓度AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对口腔鳞癌细胞系Tca8113细胞和KB细胞以及人血管内皮细胞系（HUVEC）增殖的影响;通过克隆形成试验、流式细胞技术检测不同浓度AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对Tca8113和KB细胞的克隆形成抑制和诱导凋亡作用;采用体外血管形成试验验证AS2O3单独作用或与低剂量照射结合对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）血管形成的作用。结果 AS2O3结合低剂量照射对Tca8113细胞、KB细胞和人血管内皮细胞都有明显的生长抑制作用,还可以诱导Tca8113细胞和KB细胞凋亡并显著抑制两种细胞的体外克隆形成率。AS2O3和低剂量照射结合使人血管内皮细胞体外血管的形成明显减少。结论 AS2O3结合低剂量照射对口腔鳞癌细胞具有显著的体外生长抑制及凋亡诱导作用,还可以明显抑制体外血管形成。     

全反式维甲酸和三氧化二砷对人口腔鳞癌细胞系KB细胞周期的影响

目的研究全反式维甲酸（all-trans retinoi cacid,ATRA）和三氧化二砷（arsenic trioxide,As2O3）诱导分化对人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞周期的影响及意义。方法采用流式细胞技术观察人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞经不同浓度ATRA和As2O3诱导分化后96h时的细胞周期的变化。结果ATRA作用于KB细胞后,加药组与对照组相比,被阻断在G1期的细胞比率轻度升高,S期比率下降,抑制率随浓度增高无明显升高的趋势。As2O3三个不同浓度作用KB细胞96h时,没有明显改变各细胞周期所占的比例。抑制率随作用浓度的增加而升高。结论ATRA和低浓度As2O3对人口腔未分化鳞癌细胞系KB细胞具有诱导分化作用,ATRA诱导KB细胞分化可能与G1、G0期阻滞有关。     

三氧化二砷对舌鳞癌细胞凋亡及端粒酶逆转录酶基因的作用

目的　研究三氧化二砷(As2O3)对舌鳞癌细胞株(Tca8113)增殖的影响及对端粒酶逆转录酶基因(hTERT mRNA)的作用,并初步探讨三氧化二砷的作用机制。方法　以舌鳞癌细胞株(Tca8113)为研究对象,采用噻唑蓝 (MTT)、Annexin V/碘化丙锭(PI)染色法检测细胞生长抑制率和细胞凋亡率;采用Western blot检测细胞hTERT蛋白 的表达;采用RT-PCR法检测细胞hTERTmRNA的表达情况。结果　As2O3能够明显抑制Tca8113细胞增殖,诱导 细胞凋亡,并有浓度、时间依赖性。5μmol/L As2O3组72 h细胞生长抑制率为83·40%±7·31%,细胞凋亡率为 26·40%±3·42%。As2O3能抑制hTERTmRNA的表达和翻译,随As2O3作用时间、浓度增加,细胞hTERTmRNA和蛋 白表达减弱,各实验组与对照组比较差异有统计学意义(P<0·05)。结论　As2O3可以明显抑制Tca8113细胞增殖, 诱导舌癌细胞凋亡,并抑制端粒酶催化亚基基因的表达,诱导细胞凋亡和抑制hTERT转录和翻译可能是其作用机 制之一。     

口腔鳞癌细胞系KB和Tca8113中的SP细胞含量分析

目的探讨两种口腔鳞状细胞癌细胞系KB和Tca8113中的侧群细胞的含量,寻找口腔鳞癌肿瘤干细胞存在的依据。方法采用有限稀释法对口腔鳞癌细胞系KB和Tca8113细胞株经Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide,PI）双染色后,采用流式细胞仪测定,分析两细胞株中侧群细胞的含量。结果口腔鳞癌细胞系KB和Tca8113中具有不同的表型,即侧群细胞和非侧群细胞。在体外培养中,KB和Tca8113细胞株中侧群细胞含量分别为0.6%和2.3%。经维拉帕米阻断后,侧群细胞含量均明显降低,分别降为0和0.1%。结论 KB和Tca8113细胞株中均存在侧群细胞,但含量较少。     

塞来昔布对Tca8113细胞环氧化酶-2表达及诱导凋亡的作用

目的观察选择性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞的生长抑制、COX-2表达调节及诱导凋亡的作用。方法在Tca8113细胞中分别加入含有不同浓度塞来昔布的培养液,培养24、48、72 h后,采用MTT方法测定细胞生长抑制率,采用免疫组化方法观察COX-2蛋白在Tca8113细胞中的表达,应用荧光显微镜观察凋亡细胞的形态学特征,应用Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞的早期凋亡率,相对定量荧光定量PCR检测Tca8113细胞中COX-2 mRNA的表达。结果COX-2蛋白在Tca8113细胞中呈强阳性表达,塞来昔布在抑制细胞生长的同时,抑制Tca8113细胞COX-2蛋白的表达;Tca8113细胞经塞来昔布处理后凋亡细胞多见,与对照组相比,塞来昔布处理组早期凋亡细胞增多有统计学意义;塞来昔布调节COX-2 mRNA表达的作用与对照组相比无统计学意义。结论塞来昔布主要以剂量依赖的方式抑制Tca8113细胞生长,诱导细胞凋亡,其作用与抑制COX-2蛋白表达有关,而对COX-2基因作用较弱,其作用机制有待进一步研究。     

乏氧对人舌癌Tca8113细胞尿激酶型纤溶酶原激活物表达的影响

目的　研究乏氧对人舌癌Tca8113细胞尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)表达的影响,探讨乏氧与口腔鳞 癌侵袭、转移的关系。方法　采用免疫组化染色和流式细胞术,对Tca8113细胞在不同乏氧时间(0、3、6、12、24 h)下 的uPA蛋白表达进行染色和定量分析。结果　乏氧可促进人舌癌Tca8113细胞uPA蛋白表达,而且随着乏氧时间 3 h→6 h→12 h→24 h的延长,uPA表达逐渐增高。结论　乏氧可通过激活肿瘤细胞高表达uPA而促进口腔鳞癌侵 袭和转移。     

肝细胞生长因子对人舌鳞癌 Tca8113细胞 VEGF-C 表达的影响及作用机制的初步研究

目的：研究 HGF 对人舌鳞癌 Tca8113细胞中 VEGF-C 表达的影响并探讨其作用机制。方法：体外培养 Tca8113细胞,应用 ELISA 方法测定不同浓度 HGF 作用下以及分别用 LY294002、U0126、SP600125、SB203580信号通路抑制剂阻断PI3K/Akt、P44/P22MAPK、JNK、P38MAPK 信号通路后 VEGF-C 的表达水平。结果：随着培养液中 HGF 浓度的增加,Tca8113细胞中 VEGF-C 的表达水平出现先增高后降低的趋势,当 HGF 浓度为40 ng/ml 时,VEGF-C 表达水平最高。PI3K/Akt 信号通路抑制剂（LY294002）和 P42/44MAPK 信号通路抑制剂（U0126）显著抑制了 HGF 刺激下 Tca8113的 VEGF-C 蛋白的表达（P ＜0．01）;而 JNK 信号通路抑制剂（SP600125）和 P38MAPK 信号通路抑制剂（SB203580）对 HGF 刺激下 Tca8113的 VEGF-C 蛋白的表达影响甚微（P ＞0．05）。结论：在人舌鳞癌 Tca8113细胞中,随着 HGF 浓度的增加,VEGF-C 的表达先增高后降低。PI3K/Akt 和 P44/P22MAPK 信号通路在口腔鳞状细胞癌淋巴转移中可能发挥作用。     

三氧化二砷对舌癌细胞鼠移植瘤的抑瘤作用

目的 探讨三氧化二砷在Ｓｃｉｄ小鼠体内的移植瘤抑制作用及可能作用机理。方法 将体外培养的人舌鳞癌细胞系Ｔｃａ８１１３细胞接种于Ｓｃｉｄ小鼠皮下,建立移植瘤模型,观察Ａｓ２Ｏ３对Ｔｃａ８１１３细胞移植瘤的抑瘤效果。结果 Ａｓ２Ｏ３对Ｔｃａ８１１３细胞移植瘤的抑制率为４９．１６％,且存在较煌诱导细胞凋亡作用。     

~(60)Co照射及低温保存对转基因细胞影响的分析

目的　观察经放射前后的转基因细胞Tca8113/TNF α的TNF α的分泌情况 ,为转基因细胞经致死剂量的放射线灭活作为“瘤苗”应用于临床前TNF α基因的有效表达提供依据。方法　利用基因转染技术 ,用逆转录病毒载体将肿瘤坏死因子基因 (TNF α基因 )转导入人舌癌Tca8113细胞 ,并获得表达 ;在此基础上 ,通过ELISA法分析转基因细胞Tca8113/TNF α在60 Co放射组及未放射组的TNF α分泌量的变化以及经液氮储存 4 8h、一周复苏后的TNF α分泌量的变化。结果　 (1) 60 Co放射组转基因细胞Tca8113/TNF α的TNF α的分泌量 (x±s) (pg/ml/ 10 6细胞 /2 4h)平均高达 (110± 5 6 2 ) ,而未转基因的Tca8113细胞的上清液中未检测到TNF α ,统计学上有明显的差异性 (P <0 0 1) ;(2 )经频率为 4 39 5cGy/min ,总剂量为 10 0 0 0cGy的60 Co放射后TNF α分泌量降低 ,但在 4～ 6d时有一分泌高峰 ;(3)转基因细胞Tca8113/TNF α经60 Co放射后在经 4 8h及一周的液氮内储存后TNF α能够分泌 ,其分泌量的变化趋势同储存前。 4 8h组和一周组之间无明显的统计学差异性。结论　转基因细胞Tca8113/TNF α作为“瘤苗”应用时 ,目的基因的表达可初步评价为有效     

放射诱导启动子介导CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的实验研究

目的 观察人工放射诱导启动子介导CDglyTK双自杀融合基因治疗Tca8113细胞的疗效,为舌鳞癌治疗探索新的途径。方法 构建人工放射诱导启动子调控双融合自杀基因的真核表达质粒pcDNA3.1（+）/E-CDglyTK,用脂质体为载体转染Tca8113细胞后予以3 Gy诱导放疗,描绘细胞生长曲线,RT-PCR检测CDglyTK的表达,流式细胞仪检测细胞的凋亡和增殖。结果 诱导放疗可显著增强双自杀基因CDglyTK对Tca8113细胞的毒性作用;RT-PCR半定量分析诱导放疗增强了CDglyTK基因的mRNA表达;流式细胞检测发现治疗组细胞的凋亡指数明显高于对照组,而增殖指数则低于对照组,诱导放疗显著提升了这种差距。结论 人工合成放射诱导启动子可作为基因治疗中的分子开关调节CDglyTK基因在Tca8113细胞中靶向表达。低剂量放射性照射可显著提高放射诱导启动子调控的CDglyTK基因治疗Tca8113细胞的疗效。     

Survivin基因在顺铂诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡中的作用

目的体外观察顺铂（DDP）诱导Tca8113舌鳞癌细胞株凋亡的作用, 同时检测在此过程中凋亡蛋白抑制因子Survivin mRNA表达和蛋白表达的变化。方法将人Tca8113舌鳞癌细胞株进行传代培养,MTT法检测顺铂不同浓度和不同时间对Tca8113舌鳞癌细胞生长的抑制作用,通过RT- PCR检测凋亡过程中Survivin基因mRNA的表达,免疫细胞化学观察Survivin基因的蛋白表达,以及流式细胞术观察顺铂诱导各组Tca8113细胞的凋亡率。结果顺铂可明显抑制Tca8113舌鳞癌细胞的增殖, 其增殖抑制率呈浓度和时间依赖性,细胞凋亡率也呈同样的趋势,最高可达34.1%。1.0 μg/mL DDP处理Tca8113舌鳞癌细胞,Survivin mRNA和蛋白表达水平随时间的增加而降低,在24h达到最低,随后又升高。结论抗凋亡蛋白Survivin在Tca8113舌鳞癌细胞高表达,顺铂可有效诱导Tca8113舌鳞癌细胞凋亡, Survivin mRNA表达在化疗早期随作用时间的延长而降低,Survivin基因的抑制在顺铂诱导的Tca8113舌鳞癌细胞的细胞凋亡中起着重要的作用。     

短发卡RNA介导的表皮生长因子受体基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖、凋亡的影响

目的 研究短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)介导的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因沉默对舌鳞状细胞癌细胞增殖和凋亡的影响,为治疗舌鳞状细胞癌提供依据.方法 构建靶向人EGFR的shRNA真核表达载体并瞬时转染人舌鳞状细胞癌细胞株Tca8113细胞,用半定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测转染前后EGFR的mRNA和蛋白的变化,用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞增殖活性,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况.结果 转染后Tca8113细胞的EGFR mRNA和蛋白的表达(0.217±0.047)和(0.324±0.059)均明显下调(P＜0.05),细胞增殖活性(0.340±0.009)明显降低(P＜0.05),细胞凋亡率(39.4±7.7)%显著增高(P＜0.05).结论 shRNA介导的EGFR基因沉默可抑制舌鳞状细胞癌细胞增殖并诱导其凋亡.     

Skp2靶向RNA干扰质粒的构建及其对人舌鳞癌Tca8113细胞的影响

目的运用RNA干扰技术阻断人舌鳞状细胞癌Tea8113细胞中Skp2基因的表达，观察Skp2基因沉默后对Tea8113细胞的影响。方法采用真核转录质粒pRNAT-U6．1／Neo构建针对Skp2基因的重组转染质粒。经聚乙烯亚胺法将其转染Tea8113细胞，通过反转录聚合酶链反应（reverse transcrip-tase polymerase chain reaction，RT-PCR）、Western blot检测Skp2、p27表达的变化；流式细胞仪、甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl terrazolium，MTT）法检测转染后Tea8113细胞的细胞周期、生长速度的变化。结果转染重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3后，Tea8113细胞内Skp2基因在mRNA和蛋白水平上均下调表达（P〈0．01），p27基因蛋白水平上调表达（P〈0．01）；而各重组质粒转染后p27基因的mRNA水平无明显变化。重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3转染Tea8113细胞后，与对照组相比，G1～G0期细胞增加了约22％（P〈0．01），G2～M期和S期细胞减少了约10％和12％（P〈0．01），细胞的生长速度明显变慢（P〈0．01）。结论初步证明了Skp2、p27基因在口腔鳞状细胞癌细胞分化增殖中所扮演的重要角色；筛选出了高效RNA干扰重组质粒Skp2shRNA-2、Skp2shRNA-3，为进一步研究以Skp2基因为靶点的人舌鳞状细胞癌基因治疗奠定了基础。     

人信号素基因semaphorin-3F瞬时转染对舌鳞癌细胞增殖作用的影响

目的探讨人信号素家族中最具代表性成员信号素3F（semaphorin-3F，SEMA-3F）基因瞬时转染对舌鳞状细胞癌细胞生长的影响。方法将Tea8113细胞分为4组，即转染组：转染pEGFP-N1-SEMA-3F-cDNA的Tca8113细胞；空载体组：转染pEGFP-N1质粒的Tca8113细胞；未转染组：无转染细胞；对照组：仅加转染试剂。构建和纯化SEMA-3F的真核表达载体pEGFP-N1-SEMA-3F，用阳离子脂质体转染试剂介导转染Tca8113细胞。观察外源目的基因在靶细胞中的表达及细胞的生长情况。结果基因转染后48h成功检测到高表达SEMA-3F基因。转染后24、48、72、96h，甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测转染组的各时期平均A值，均低于其余3组。转染后48h，流式细胞仪检测G1期细胞比例降低，S期比例增高。结论SEMA-3F基因瞬时转染可使其在Tca8113细胞中高表达，并使细胞增殖受到抑制。本实验结果将SEMA-3F作为目的基因，为治疗舌癌进一步提供了实验依据。     

三氧化二砷抑制口腔鳞癌细胞增殖的研究

目的:体外试验研究三氧化二砷对口腔鳞癌的可能治疗作用。方法:以人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞为研究对象之一,采用台盼蓝拒染法计数活细胞,观察三氧化二砷作用于Tca8113细胞的量效关系、时效关系。采用平皿法姬姆萨染色观察三氧化二砷对Tca8113细胞的克隆形成抑制作用。以舌鳞状细胞癌临床新鲜标本组织块为研究对象之二,消化后细胞悬液与各浓度三氧化二砷、一定浓度的MTX、5Fu、PYM体外培养后MTT法测定临床舌癌细胞生长抑制率。结果:三氧化二砷对Tca8113细胞、临床舌癌细胞均有显著生长抑制作用。1μmolAs2O3台盼蓝染色活细胞计数Tca8113细胞生长抑制率28.57%,克隆形成抑制率31.01%;3μmolAs2O3浓度Tca8113细胞生长抑制率58.36%,克隆形成抑制率76.63%;5μmolAs2O3浓度Tca8113细胞生长抑制率86.03%,克隆形成抑制率91.30%。体外药敏测定:1μmol浓度As2O3的临床舌癌细胞的生长抑制率39.5%,3μmol浓度As2O3为47.2%,5μmol浓度As2O3为89%,MTX为36.5%,5Fu为41.3%,PYM为58.16%。临床药敏标准一般大于30%为敏感,PYM大于50%为敏感。结论:体外试验表明三氧化二砷可显著抑制人舌鳞状细胞癌细胞系Tca8113细胞的生长,对临床癌细胞也表现了良好的抗增殖作用,三氧化二砷可能成为治疗口腔鳞癌的有效药物