吗啡依赖及戒断小鼠脑内节律基因mPeriodl表达的研究

目的 研究吗啡依赖和吗啡戒断小鼠脑组织内节律基因mPeriod1（mPer1）表达的变化。方法 以雄性BALB／C小鼠的吗啡条件性位置偏爱为指标，观测吗啡依赖组、吗啡戒断组小鼠与正常盐水组小鼠的药物精神依赖的变化；应用免疫组化SP法检测3组小鼠脑内mPer1的表达情况；利用图像软件对免疫组化结果进行分析和处理。结果 吗啡依赖组的小鼠脑内mPer1表达峰值相位较正常盐水组有明显改变。而吗啡戒断组小鼠脑内mPerl表达峰值相位较正常盐水组没有显著性差异。结论 研究结果表明吗啡成瘾影响了以mPer1为重要部件的近日钟的自激振荡过程，使近日节律发生了改变。     

糖皮质激素对吗啡依赖大鼠海马c-fos基因表达的影响

目的 观察吗啡依赖大鼠脑内海马区c-fos mRNA水平的变化,研究糖皮质激素(地塞米松)控制阿片戒断症状的分子机理。方法 剂量递增腹腔注射吗啡建立大鼠成瘾模型,给与地塞米松干预,纳洛酮促瘾后观察戒断症状,应用原位杂交方法观察海马区c-fos mRNA。结果 吗啡依赖大鼠经地塞米松干预后,由纳洛酮催促戒断症状评分明显低于未经地塞米松处理组;同时经地塞米松干预后,海马c-fos mRNA的表达量明显低于未经地塞米松处理,但较盐水对照组高。结论糖皮质激素(地塞米松)能抑制吗啡依赖大鼠戒断症状以及海马c-fos mRNA的表达。     

CREB1蛋白在大鼠急、慢性吗啡依赖和戒断中的表达变化

目的 研究急、慢性吗啡依赖和戒断对大鼠脑组织cAMP反应元件结合蛋白（CREB1）的表达调节作用。方法 雄性SD大鼠36只，随机分为急性对照组、急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、慢性对照组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组，每组6只。采用免疫组化方法测定不同脑区和核团CREB1蛋白表达水平。结果 急性吗啡依赖和戒断抑制蓝斑CREB1蛋白表达。慢性吗啡依赖和戒断增加皮质、海马、蓝斑等脑区核团CREB1蛋白的表达，但是在慢性吗啡依赖和戒断时，伏隔核CREB1蛋白表达下降。结论 急、慢性吗啡依赖和戒断时CREB1在大鼠皮质、海马、下丘脑、蓝斑、伏隔核等脑区的表达存在差异，可能与介导阿片类药物依赖信号转道通路的反应性不同有关。     

急、慢性吗啡依赖大鼠脑内Gi2蛋白的表达

目的研究吗啡依赖大鼠腹侧背盖区（VTA）、伏隔核（NAc）、前额皮质（PC）、海马及蓝斑（LC）各脑区Ⅱ型抑制性鸟苷酸结合蛋白（Gi2蛋白）的改变,探讨吗啡依赖的可能机制。方法36只SD大鼠随机分为6组,分别为急性吗啡依赖组、急性吗啡戒断组、急性空白对照组、慢性吗啡依赖组、慢性吗啡戒断组和慢性空白对照组。建立吗啡依赖大鼠模型。戒断组腹腔注射纳洛酮5mg／kg,作用30min。断头处死各组大鼠,取出脑组织,进行冰冻切片。用免疫组化技术检测NAc、PC、LC、VTA和海马的相对Gi2蛋白水平。结果急性吗啡依赖组和戒断组与急性空白对照组比较,NAc区Gi2蛋白水平明显降低（P〈0．01）。慢性吗啡依赖组和戒断组与慢性空白对照组比较,NAc区Gi2蛋白水平明显降低（P〈0．01）,LC区Gi2蛋白水平明显升高（P〈0．01）。结论吗啡依赖可引起大鼠脑内Gi2蛋白水平发生改变,但各脑区Gi2蛋白水平的变化并不相同。Gi2蛋白水平改变可能是吗啡耐受和依赖潜在的分子机制。     

PMA诱导C6细胞rPer1,rDbp基因的近日节律表达

目的寻找一种新的体外节律诱导剂以研究C6神经胶质瘤细胞近日节律基因的表达情况。方法采用PMA（phorbol 12-myristate 13-acetate），100nmol／L）及50％的马血清刺激体外培养的小鼠NIH-3T3细胞。RT-PCR检测不同时间点mPer1 mRNA的表达水平，比较两者的诱导效率；PMA刺激体外培养的大鼠C6神经胶质瘤细胞，RT—PCR检测不同时间点rPer1，rDbp mRNA的表达水平。结果PMA及50％的马血清均能诱导NIH-3T3细胞mPer1的近日节律表达且诱导效率近似；并首次发现C6细胞的rPer1，rDbp基因存在着近日节律振荡。结论PMA是一种有效的体外节律诱导剂；经PMA诱导后，C6细胞的节律基因存在近日振荡，为体外研究授时因子对近日节律的导引机制提供依据。     

节律基因mPeriod2对Lewis肺癌细胞生长的影响

目的 研究节律基因mPeriod2(mPer2)对肿瘤细胞的生长抑制及诱导分化凋亡的作用。方法 体外培养Lewis肺癌细胞,使用脂质体包裹法将真核表达质粒pcDNA3．1为基础的mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转导入Lewis肺癌细胞内;以免疫组化及流式细胞技术检测mPer2表达;通过流式细胞技术检测稳定转染的mPer2阳性表达的Lewis肺癌细胞的生长及凋亡。结果 mPer2表达质粒(pcDNA3．1-mPer2)转染的Lewis肺癌细胞表达PERIOD2蛋白;与对照组比较,其增殖指数下降及凋亡率增加。结论 节律基因mPer2可以抑制肿瘤细胞的生长,增加肿瘤细胞的凋亡率。     

核酶阻断per1表达对吗啡成瘾小鼠海马c-fos转录及表达的影响

目的研究用特异性核酶阻断生物节律基因per1的表达对吗啡成瘾小鼠海马c—fos基因转录及表达的影响。方法制备吗啡成瘾小鼠模型，向小鼠脑室内注射脂质体包裹的重组质粒pcDNA3．1-per1RZ DNA，在脑内产生特异性核酶-per1RZ，阻断小鼠脑内生物节律基因per1的表达。作脑组织冰冻切片，用原位杂交和免疫组化法测定小鼠海马c—fos基因转录及表达的变化。结果per1RZ能使吗啡成瘾小鼠海马的c—fos基因转录及表达明显减弱。结论重组质粒表达的per1RZ可以干扰生物节律基因per1的表达，抑制海马c—fos基因的转录和表达，从而控制吗啡成瘾的发生。     

青藤碱对吗啡依赖小鼠催促戒断症状的影响

目的　研究中药成分青藤碱 (Sin)对吗啡依赖小鼠催促戒断症状的影响。方法　以剂量递增法形成吗啡依赖小鼠模型 ,ipSin 30min后 ,用纳络酮进行催促戒断 ,观察小鼠的戒断反应。结果　ipSin 10mg·kg-1后 ,小鼠的跳跃反应、前爪震颤、体重下降等戒断症状均明显减少或减轻 ,ipSin 30、6 0mg·kg-1可抑制小鼠跳跃、扭体、前爪震颤、“湿狗”样抖动、体重下降等症状。结论　Sin能抑制吗啡依赖小鼠催促戒断症状 ,对成瘾小鼠的体重下降具有显著的缓解作用     

利鲁唑对吗啡躯体依赖的影响及其可能机制

目的：评价利鲁唑对吗啡躯体依赖的调节作用及可能机制。方法：在小鼠吗啡依赖和大鼠依赖模型上分析利鲁唑对吗啡躯体依赖的影响。用化学发光法测定小鼠脑组织NOS活性。结果：在小鼠吗啡躯体依赖模型中，利鲁唑(2．5～10mg/kg,sc)剂量依赖性地抑制吗啡依赖小鼠纳洛酮催促的戒断症状；在大鼠吗啡依赖模型中，利鲁唑(2．5和5mg/kg，sc)使吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断积分明显降低。利鲁唑能显著降低吗啡依赖小鼠不同脑区(大脑、小脑、丘脑)一氧化氮合酶(NOS)活性。结论：利鲁唑抑制吗啡依赖大鼠和小鼠的戒断症状，机制与抑制吗啡依赖状态下脑组织内NOS活性代偿性升高有关。     

吗啡依赖和戒断对大鼠杏仁核神经甾体和氨基酸递质水平的影响

目的研究吗啡依赖和戒断时大鼠杏仁核中神经甾体和氨基酸递质水平的变化。方法连续7天给予大鼠盐酸吗啡建立吗啡依赖模型。使用纳洛酮(2mg/kg)催促戒断,观察戒断症状并进行评分。将大鼠断头处死后,剥离大脑并分离出杏仁核,用液-液萃取和固相萃取法提取游离型和结合型神经甾体。神经甾体(包括脱氢表雄酮、孕烯醇酮、别孕烯醇酮、脱氢表雄酮硫酸酯和孕烯醇酮硫酸酯)的含量使用高效液相色谱-质谱法测定。甘氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量采用柱前OPA衍生-电化学检测-高效液相色谱法测定。结果与盐水对照组相比,吗啡依赖大鼠杏仁核中的脱氢表雄酮水平降低33 %(P<0·01)。与戒断对照组比较,吗啡戒断大鼠杏仁核中的孕烯醇酮和别孕烯醇酮水平分别升高45 %和42 %(P<0·05) ,γ-氨基丁酸水平降低18 %(P<0·01)。与吗啡依赖组比较,吗啡戒断组大鼠杏仁核中的孕烯醇酮和孕烯醇酮硫酸酯水平分别升高60 %和40 %(P<0·05) ,甘氨酸水平降低14 %(P<0·05)。结论吗啡依赖大鼠杏仁核中的脱氢表雄酮可能参与吗啡依赖的形成而与吗啡戒断症状的表达无关。其他神经甾体(包括孕烯醇酮、别孕烯醇酮和孕烯醇酮硫酸酯)则可能参与吗啡的戒断而与依赖的形成无关。纳洛酮催促戒断时,大鼠杏仁核中抑制性氨基酸递质的合成和释放受到抑制。表明大鼠杏仁核中的各种神经甾体和氨基酸递质在吗啡依赖和戒断时发生了不同的变化。     

尾吊对小鼠肝脏组织中clock与bmal1基因节律的影响

目的研究尾吊对持续黑暗条件下小鼠肝脏节律基因clock与bmal1节律表达的影响。方法常规明暗光照条件导引(entrainment)C57BL/6J(C57)小鼠1周后,在持续黑暗条件下采用头低位-30°尾吊C57小鼠,于尾吊第12天、13天、14天每隔4 h连续18个时间点进行肝脏组织取材,提取总RNA,并运用Real-time PCR方法检测肝脏组织clock和bmal1节律基因mRNA的表达变化。结果尾吊组与对照组肝脏clock与bmal1节律基因mRNA水平均呈现出节律性表达特征。在尾吊条件下,clock基因mRNA的峰值相位提前约4 h,bmal1基因mRNA表达节律的振幅在每天授时因子时间(zeitgeber time,ZT)ZT2与ZT6显著下降(P<0.05)。结论在持续全黑暗条件下,C57小鼠肝脏组织节律基因clock与bmal1的mRNA水平表现出明显的近日节律性,尾吊对clock基因产生峰值相位提前的效应,对bmal1基因产生振幅减少的效应。     

节律基因Period1对吗啡依赖效应的影响

目的：研究节律基因Period1在药物精神依赖形成中的作用。方法：设计针对节律基因Period1 mRNA的核酶(per1 RZ)，构建以真核表达质粒pcDNA3．1为基础的perlRZ表达质粒(pcDNA3．1-per1RZ)；体外转录切割实验检测核酶对Period1 RNA的切割作用；脑室注射pcDNA3．1-perlRZ，调节动物节律基因Period1的表达；以BALB／C小鼠的吗啡条件性位置偏爱(CPP)为指标，观察pcDNA3．1-periRZ对吗啡精神依赖形成的影响。结果：体外切割实验发现perlRZ对PeriodlRNA的切割效率达到60％；动物实验证实per1RZ能有效干扰小鼠中枢神经系统Period1基因的表达，阻断吗啡条件性位置偏爱的形成。结论：节律基因Period1与药物精神依赖的形成有关，提示per1RZ可以阻断动物药物精神依赖的形成。     

模拟微重力对NIH-3T3细胞clock及bmal1基因表达的影响

目的探讨模拟微重力对NIH-3T3细胞节律基因clock与bmal1 mRNA表达的影响。方法 NIH-3T3细胞采用回转器分别回转培养6 h,12 h,18 h,24 h,30 h,36 h,42 h和48 h,同时设置1 G静置培养为对照组。Trizol试剂提取细胞总RNA,实时定量PCR法检测节律基因clock及bmal1 mRNA在各时间点的相对表达量。通过余弦法获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果 clock及bmal1基因mRNA的表达趋势相近。对照组clock与bmal1 mRNA相对水平呈现节律性表达,而回转组表达无节律性。回转组mRNA相对水平最大值出现于约6 h时间点,最小值出现在约18 h,而对照组分别出现于约18 h与24 h。与对照组比回转组的周期延长了约16 h。回转后clock与bmal1的峰值相位前移。结论 NIH-3T3细胞中clock与bmal1的表达存在同步化的转录特征。模拟微重力可影响clock与bmal1节律的周期长度及峰值相位。     

层粘连蛋白受体Ⅰ与hPeriod1相互作用的研究

目的寻找与节律蛋白hPeriod1（hPer1）相互作用的蛋白，并对筛选出的层粘连蛋白受体Ⅰ（Lamr1）在节律系统中的功能作初步研究。方法分别构建pGAD rec／脑cDNA文库和pGBKT7／hPer1bHLH—PAS重组诱饵蛋白质粒，酵母双杂交筛选下丘脑里与hPer1相互作用的蛋白。利用RT—PCR技术检测新蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织中的表达及在SH—SY5Y细胞中的节律性质。通过RNA干扰技术研究新蛋白与hPer1的关系。结果通过酵母双杂交筛选，证明Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用。该蛋白在脑、肺、心、肝、肾组织广泛表达，灰度比较显示经马血清诱导后的SH～SY5Y细胞的hPer1表达呈现近日节律，而Lamr1表达无节律变化。RNA干扰显示hPer1表达下调不影响Lamr1的表达。结论Lamr1能与hPer1蛋白发生相互作用，但其表达在RNA水平无节律变化。Lamr1参与细胞的黏附、转移和侵袭。其前体蛋白作为核蛋白参与细胞蛋白的合成。Lamr1可能参与hPer1相关的生物节律系统的信号传出。     

近日节律基因Clock对雄性小鼠生殖功能的影响

目的 通过干扰小鼠睾丸节律基因Clock的表达,研究Clock对雄性小鼠生殖能力的影响.方法 通过RNA干扰技术干扰雄性小鼠睾丸节律基因Clock的表达,以Western blot检测干扰效果,研究干扰Clock表达后对小鼠体内胎仔数和精子数量、精子活力、体外受精率的影响.结果 Clock干扰质粒使小鼠睾丸Clock蛋白的表达明显下调.在体内实验不但影响了雄性小鼠的胎仔数,而且其相对应的精子体外受精能力也明显下降.结论 节律基因Clock与雄性小鼠的生殖功能有密切的关系.     

Estimating time of death based on the biological clock

The biological clock may stop at the time of death in a dead body. Therefore, the biological clock seems useful for estimating the time of death. In this study, we tried to read the biological clock in tissues from dead bodies to estimate the time of death using molecular biological techniques. At first, we examined real-time RT-PCR analysis of gene expression for mPer2 and mBmal1, which constitutes a feedback loop in the oscillation system, in the kidney, liver, and heart of mice. We could detect circadian oscillation of these gene expressions in mouse tissues even at <48 h after death. Thus, the ratio of mPer2/mBmal1 was found to be useful for estimating the time of death. We next applied this method to the liver, kidney, and heart obtained from forensic autopsy cases with less than 72 h of postmortem interval. Significant circadian oscillation of hPer2/hBmal1 ratio could be detected in these autopsy samples. We further examined gene expression for hRev-Erbα, a component of another feedback loop. The ratios of hRev-Erbα/hBmal1 showed higher amplitude of oscillation than those of hPer2/hBmal1 and are considered more suitable for estimating the time of death. In particular, a hRev/hBmal1 ratio of >50 indicated the time of death as 0200–0900 hours, and a hRev/hBmal1 ratio that considerably exceeded 75 indicated the time of death as 0200–0800 hours. On the other hand, a hRev/hBmal1 ratio of less than 25 strongly indicated the time of death as 1000–2300 hours. Taken together, these findings indicate that gene expression analyses of the biological clock could be powerful methods for estimation of the time of death.     

穿膜肽mCLOCK's DNA-BIND作为药物载体的生物安全性初步评价

目的 研究一种新的来源于节律蛋白mCLOCK's DNA结合域的穿膜肽mCLOCK's DNA-BIND(CDB)作为药物携带载体的生物安全性.方法 化学合成穿膜肽CDB.体外采用Phorbol 12-Myristate 13-acetate(PMA)诱导NIH3T3细胞的近日节律.于诱导后不同时间点,CDB与小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞共孵育,RT-PCR检测其对近日节律核心分子mPeriod1(mPer1)基因表达的影响.此外,培养的NIH3T3直接与CDB共孵育12 h和24 h后,MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞术检测其对细胞周期和凋亡的作用.结果 CDB没有明显影响PMA诱导的mPer1节律基因表达.此外,CDB不干扰NIH3T3细胞增殖及生长周期,亦无明显的诱导凋亡作用.结论 CDB对细胞近日节律、细胞增殖、生长周期及细胞凋亡均无明显毒副效应,可望作为一种安全有效药物载体,并具有广泛的临床应用前景.