新型多孔β磷酸三钙作为骨组织工程支架材料的实验研究

目的探讨新型多孔β磷酸三钙（β tricalcium phosphate,β-TCP）作为骨组织工程支架材料的应用效果。方法将兔骨髓间充质干细胞（marrow mesenchymal stem cells,MSCs）与β-TCP复合培养,实验组于24孔培养板中每孔加入3mm×3mm×3mm的β-TCP小块与细胞混合培养,对照组单纯接种细胞。培养后至10d内行倒置相差显微镜观察,第6天行扫描电镜观察细胞生长情况并与对照组比较;复合培养3、6、9、12d MTT法测定细胞增殖情况并与对照组比较以判断其细胞相容性。通过不同浓度（100%、50%、10%、1%、0）的β-TCP浸提液对细胞增殖的影响检验其细胞毒性。将MSCs诱导为成骨细胞,并与β-TCP复合修复兔桡骨1.5cm大段骨缺损,术后2、6、12周分别取材通过组织学、X线片和放射性核素骨扫描（emission computed tomograph,ECT）检验其成骨效果。结果MSCs细胞接种后4h可见部分细胞贴壁,12h后完全贴壁,细胞呈多角形、梭形;8～10d后汇成单层,实验组细胞生长与对照组相似。第6天倒置相差显微镜和扫描电镜观察可见细胞黏附性良好。MTT法测定示实验组与对照组各时间点吸光度（A）值比较差异无统计学意义（P〉0.05）。各时间点不同浓度β-TCP的细胞毒性均为0级。组织学、X线片和ECT均显示复合材料能够修复兔桡骨的大段骨缺损,且体内降解速率与骨的形成速率一致。结论新型多孔β-TCP具有独特的三维立体结构,优良的理化性质,是一种良好的骨组织工程支架材料。     

成骨细胞复合β-磷酸三钙异位成骨的实验研究

目的：评价成骨细胞复合多孔β-磷酸三钙支架在大鼠肌肉中的成骨效果。方法：分别在植入1、4、8周后,将成骨细胞β-磷酸三钙复合物取出行HE染色观察新骨形成情况,并应用KS4003．0软件进行新骨生成分析。结果：植入1周后所有标本都未发现骨生成;在4周后实验组新骨生成量为6．35％,对照组为1．32％：8周后实验组新骨生成晕为21．58％,对照组新骨生成量为4．78％。两组比较有显著性差异。结论：成骨细胞复合多孔β-磷酸二钙支架可以促进新骨生成。     

种子细胞-支架复合体在骨组织修复中的研究进展

针对人体由于创伤、感染、肿瘤、先天畸形等各种原因引起的骨缺损,传统治疗方法多采取自体骨、异体骨移植等手段.虽然自体骨移植作为骨缺损修复的"金标准",但是自体骨取材具有局限性,而异体骨存在的排斥反应、感染等弊端,均成为骨组织修复中无法回避的难题.因此,研究一种理想的人骨代替物已成为骨组织工程的重大课题.良好的人骨替代物通常要符合以下标准:(1)具有良好的生物相容性,降解产物无毒,不引起炎症反应;(2)具有合适的空隙尺寸以便于新骨的长入,骨支架材料的平均孔径需在200～400 μm之间[1];(3)具有一定的机械强度,能为新生组织提供支持,同时材料力学特性可与体内骨力学特性相匹配,人体松质骨的弹性模量在0.1～0.5 GPa,抗压强度在4～12MPa,密质骨的弹性模量在12～18 Gpa.     

低强度脉冲超声波影响兔骨髓基质干细胞与β-磷酸三钙复合修复骨缺损的实验研究

[目的]探讨低强度脉冲超声波(LIPUS)影响β-磷酸三钙(β-TCP)与兔骨髓基质干细胞(BMSCs)复合体修复兔桡骨骨缺损的效果。[方法]从兔股骨粗隆部抽取骨髓,体外培养扩增,取第3代BMSCs接种于β-TCP培养1周,分为两组,一组予以LIPUS作用,另一组作为对照。以20只成年新西兰兔为研究对象,制作双侧桡骨远端骨缺损模型。一侧桡骨骨缺损处植入LIPUS作用过的细胞支架复合体做为实验组,另一侧植入LIPUS未作用过的细胞支架复合体做为对照组。分别于术后4周、8周处死新西兰兔,运用计算机图像分析X线片上骨痂的灰度密度,行组织学切片检查骨痂生长情况。[结果]X线片骨痂灰度密度测量提示实验组骨痂较对照组生长明显增多。组织学切片显示实验组血肿机化、吸收、骨小梁和骨基质形成早于对照组。[结论]在骨缺损修复早期,LIPUS对BM-SCs与β-TCP复合体修复兔骨缺损有明显的促进作用;而在骨缺损修复晚期,LIPUS的作用相应减弱。     

β-磷酸三钙填充载药微球治疗兔感染性骨缺损

[目的]探讨β-磷酸三钙填充载药微球对兔感染性骨缺损的治疗作用.[方法]采用复乳化溶剂挥发法制备缓释微球,3D打印制备多孔β-TCP支架,采用离心震荡法制备复合支架.取75只新西兰兔,随机分为5组,每组15只.其中15只设为正常对照组,其余4组制备股骨下段慢性骨髓炎模型,造模成功后,15只给予单纯清创(清创组);15只...     

羟基磷灰石/β－磷酸三钙/甲壳素复合多孔支架材料的制备及生物相容性研究

目的 探讨羟基磷灰石/β-磷酸三钙/甲壳素(HAP/β-TCP/CS)多孔支架的制备及其与人体骨髓间质干细胞(MSCs)的生物相容性.方法 以羟基磷灰石粉体为基体,采用有机泡沫浸渍-发泡复合成型工艺制备出羟基磷灰石/β-磷酸三钙多孔支架,再将该多孔支架与甲壳素复合得到有机-无机复合支架,然后通过体外培养实验评价该复合支架的干细胞相容性.结果 复合甲壳素可以显著提高HAP/β-TCP支架的抗压强度,并且该支架具有三维连通网状结构,细胞在支架上粘附,生长良好.结论 该复合多孔支架具有良好的干细胞亲和性和生物相容性.     

壳聚糖-明胶/β-磷酸三钙复合体作为组织工程软骨支架材料的实验研究

目的了解壳聚糖(CS)-明胶(Gel)/β-磷酸三钙(β-TCP)复合体支架超微结构、机械性能及生物相容性,探讨其作为组织工程软骨支架材料的可行性。方法采用二次冻干技术制备CS-Gel/β-TCP复合体支架,扫描电镜观察超微形态,材料万能测试机测定压缩强度和压缩模量;将CS-Gel/β-TCP复合体支架植入兔皮下,观察体内降解情况及生物相容性。结果混合溶液固含量、β-TCP添加量、预冻温度对复合体支架的孔隙结构具有决定性作用。β-TCP的引入能显著增强CS-Gel聚合体支架的机械性,随着β-TCP添加量的增多,复合体支架的压缩强度、模量都有较大程度提高;随着预冻温度的降低,材料的机械性能亦随之降低。在植入早期可观察到一过性炎性反应,随着植入时间延长,支架逐渐降解,12周时基本降解吸收。结论 CS-Gel/β-TCP复合体支架具有良好的超微结构、机械性能和生物相容性,是一种较好的构建组织工程软骨的支架材料。     

新型脱细胞骨基质-壳聚糖复合支架的生物相容性研究

[目的]评价新型脱细胞骨基质-壳聚糖(ABECM/CS)骨组织工程复合多孔支架的生物相容性和安全性,为临床应用提供实验依据.[方法]采用联合脱细胞方法对猪股骨进行处理后制备脱细胞骨基质/壳聚糖骨组织工程复合支架.分离、培养兔骨髓间充质干细胞传代后进行实验.采用MTT法观察材料浸提液于1、3、5、7d时进行细胞毒性实验观察细胞的活性;将材料浸提液与稀释血混合离心后观察红细胞溶血情况,检测OD值计算相对溶血率;将材料浸提液经静脉注入兔体内进行热原实验,在规定时间内观察兔体温变化.[结果]细胞毒性实验显示,培养1、3、5、7d后各时间段内三组OD值两两比较(P＞0.05)无显著差异,表明材料无毒性.在溶血实验中观察实验材料的溶血率为3.0％,在标准值溶血率5％范围内,提示无溶血现象发生.热原实验结果显示每只兔体温升高均低于0.6℃,且3只兔体温升高总度数低于1.4℃,符合热原检测规定,复合材料无致热作用.[结论]经联合脱细胞处理制备的ABECM/CS复合支架无细胞毒性、无溶血反应、无热原性,具有良好的生物相容性和安全性,可作为构建组织工程骨的支架载体材料.     

磷酸三钙-透明质酸-Ⅰ型胶原-骨髓基质细胞复合修复骨缺损的实验研究

目的观察由磷酸三钙人工骨(β-tricalciumphosphate,β-TCP)、透明质酸(hyaluronicacid,HA)、型胶原(type collagen,COL-)复合物作为诱导后的骨髓基质细胞(marrowstromalcells,MSCs)载体修复兔桡骨骨缺损的能力及作为自体骨移植替代物的可能性。方法获取新西兰大白兔MSCs,体外诱导培养后与β-TCP、HA、COL-结合形成复合物。将6月龄新西兰大白兔30只,手术制备双侧桡骨2cm骨缺损,8周后随机分为A、B及C组,A组(n=27侧),植入β-TCP-HA-COL--MSCs;B组(n=27侧),植入自体骨;C组(n=6侧),缺损空置作为空白对照。用扫描电镜观察β-TCP-HA-COL-结构。于4、8和12周各时间点分别处死动物6、9和15只;4、8周时A、B组各6侧,12周时A、B组各15侧;C组8周时6侧。进行大体观察、X线摄片、HE染色及无机质含量测定,对A、B组12周时标本进行成骨面积及生物力学测试,比较各组骨缺损的修复效果。结果MSCs在体外生长稳定,增殖能力强,可被诱导为成骨细胞。β-TCP-HA-COL-复合物呈多孔结构。各组各时间点大体观察、X线片、组织学及生物力学测试结果显示,随着时间的延长A、B组骨缺损可被修复,空白对照组不能修复。12周时成骨面积、生物力学测试,A、B组差异无统计学意义(P>0.05)。A组中的无机质含量在4、8和12周分别为75%、57%和42%。结论     

改进沉淀法合成β-磷酸三钙

以Ca（NO3）2和Ca（NO3）2·4H2O为原料,加入分散剂聚苯乙烯,采用液相沉淀法制备β-磷酸三钙前体,经过800℃高温煅烧制得结晶度较高的β-磷酸三钙粉体,采用XRD、TEM、FTIR等手段对粉体进行测试分析。结果表明,液相沉淀法制备的β-磷酸三钙为纳米级,经800℃煅烧2h后,可获得晶粒细小、结晶状态良好、分散性好的β-TCP粉体。     

骨组织工程生物活性支架研究进展

新型支架材料的研究趋势呈单一组分向多组分过渡,惰性材料向活性材料过渡,宏观水平向微观水平过渡。随着纳米技术与生命科学的迅猛发展,纳米改性与仿生构建这两个新理念也逐渐融入了支架研究的主流,网络成骨理论近年也在支架领域得到很好的拓展与应用。如何在原有研究的基础上研获理想的生物活性支架,已成为骨组织工程这一重大课题的核心热点和难点。本文重点探讨了骨组织工程中极具前景的几类生物支架,对其国内外研究与临床应用的现状做一综述。     

脱细胞脊髓天然支架的制备及形态学观察

[目的]采用化学脱细胞方法去除细胞和髓鞘成分制作细胞外基质支架,为桥接脊髓损伤缺损提供理想的天然神经支架。[方法]取SD大鼠胸段脊髓约2cm,运用冻融 化学萃取(3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNaseI、RNaseA)的组织工程学方法处理大鼠脊髓组织,并对处理后的脊髓支架分别进行组织学检查,了解脱细胞情况及细胞外基质支架形态。[结果]经过脱细胞处理后,光镜下HE染色脊髓横断面呈网状结构,未见细胞成分存留,纵切面上呈互相交错的管状通路;未见轴突、髓鞘和细胞核。髓鞘染色可见髓鞘脱除彻底,未见髓鞘成分。[结论]本实验采用冻融 化学萃取的组织工程学方法可制备出理想的天然脊髓支架,该支架与脊髓三维组织结构具有高度相似性,有望作为脊髓损伤后桥接物和神经组织工程种子细胞的支架,本实验结果显示3%脱氧胆酸钠和1KU/mlDNa-seI、RNaseA进行脱细胞处理两次是较为合适的,能较为彻底去除细胞及髓鞘成分并较为完整地保留细胞外基质的三维结构。     

重组人BMP-2修饰的β磷酸三钙/胶原材料制备及其诱导成牙性能的初步研究

目的构建重组人BMP-2(recombinant human BMP-2,rhBMP-2)修饰的β磷酸三钙(βtricalciumphosphate,β-TCP)/胶原生物支架材料,初步探讨其在牙组织工程中发挥的作用,评价其作为牙组织工程支架材料的可行性。方法将纳米级β-TCP粉末与胶原在强碱性水溶液中复合,制备β-TCP/胶原生物支架材料,并与rhBMP-2复合,制备牙组织工程支架材料。SPF级8～10周龄SD大鼠46只,雄性34只,雌性12只,体重250～300 g。体视显微镜下分离新生SD大鼠的下颌骨,取牙胚消化成细胞悬液,与支架材料复合培养制备组织工程牙胚。通过扫描电镜观察、细胞黏附率测定和MTT测定细胞增殖情况评价支架材料对牙胚细胞体外生长的影响。将组织工程牙胚植入SD大鼠肾被膜下作为实验组(n=12),另分别植入单独牙胚细胞团块(细胞对照组,n=12)及单独支架材料(材料对照组,n=4)作为对照,4、8周时取出标本行大体及组织学观察。结果扫描电镜示β-TCP/胶原生物支架材料呈疏松多孔状,质地柔软,亲水性良好;复合培养3 d后牙胚细胞可紧密贴附于支架材料,生长状态良好。牙胚细胞接种至支架材料上经4、8、12 h孵育后,细胞黏附率分别为27.20%±2.37%、44.52%±1.87%、73.81%±4.15%。MTT检测示牙胚细胞在β-TCP/胶原生物支架材料上的增殖情况与未放置支架材料相似,差异无统计学意义(P>0.05)。各组植入物移植于大鼠肾被膜下4、8周后大体观察可见白色钙化物形成;植入后4周,实验组镜下可见明显牙样形态及典型的釉质和牙本质样结构形成,细胞对照组可见釉质和牙本质样结构,但排列相对紊乱;植入后8周,实验组釉质及牙本质样结构较4周成熟,层次也更加清晰,细胞对照组也可见较为成熟的釉质和牙本质样结构;植入后4、8周,材料对照组均未见牙样结构形成。结论 rh BMP-2修饰的β-TCP/胶原生物支架材料与牙胚细胞生物相容性良好,可作为牙组织工程支架材料的良好选择。     

细胞复合β-磷酸三钙生物陶瓷修复软骨缺损的实验研究

[目的]通过将骨髓间充质干细胞（MCSc）诱导的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞接种到三维多孔β-磷酸三钙（β-TCP）生物陶瓷支架材料上，体外构建骨软骨复合体，探讨以β-TCP为载体建造组织工程化软骨修复骨软骨缺损的可行性。[方法]将β-TCP多孔陶瓷加工成圆柱状，并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上分别接种从犬骨髓干细胞培养成的具有软骨细胞、成骨细胞表型的细胞，将细胞-支架复合体共同培养1周后，移植到犬关节软骨缺损处。植入后12、16周末取材，进行大体观察、组织学及组织化学等观察。[结果]复合体体内移植后，在犬关节软骨缺损处有新生软骨形成，形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。[结论]β-TCP多孔陶瓷可作为支架材料，复合细胞后具有修复软骨缺损的作用。     

新型β-磷酸三钙的制备与成骨能力的实验研究

目的采用有机泡沫浸渍法制备多孔β-磷酸三钙(β-TCP)生物陶瓷,探讨其作为骨组织工程支架材料的可能性。方法有机泡沫浸渍法制备β-TCP支架材料,接种人骨髓基质干细胞,体外成骨诱导培养。相同条件下培养的单层细胞作为对照组。采用扫描电镜和噻唑蓝比色法观察细胞在材料上的增殖能力,同时测定碱性磷酸酶活性和骨钙蛋白含量来观察细胞在材料上的成骨分化能力。将体外培养7 d的细胞材料复合物和单纯材料回植裸鼠皮下,分别于术后4、8、12周取材观察异位成骨情况。结果扫描电镜观察显示实验组细胞在材料上增殖良好,MTT结果与对照组无明尼差异,但碱性磷酸酶活性和骨钙蛋白含量均高于单层培养的细胞。细胞材料复合物在裸鼠皮下4周已经成骨,并随时间延长骨量增多。单纯材料组在各时间点均未成骨。结论有机泡沫浸渍法制备的多孔β-TCP生物陶瓷具有良好的支持成骨能力,是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

明胶杂化三维聚乳酸支架研究

目的 克服聚乳酸材料的疏水性,制备表面特性和孔隙结构均符合组织工程需要的细胞支架.方法 应用改进的溶液浇注/粒子沥滤技术,制备孔隙完全连通的三维聚乳酸细胞支架,碱液预处理支架表面,浸润明胶溶液,戊二醛蒸汽交联支架上的明胶,获得杂化改性支架;用扫描电镜等对改性后的支架进行结构与性能表征.结果 圆柱形多孔聚乳酸支架,在杂化改性后吸水率增加约2倍,由改性前的(1164.2±172.9)%上升到(2637.7±527.8)%,亲水性显著增强;杂化改性后,明胶均匀分布在支架孔隙表面,支架孔隙形态、连通性基本没有变化.结论 明胶杂化能显著提高聚乳酸细胞支架的亲水性,改性过程不影响支架的孔隙结构和形态,可以制备出亲水性好、内部结构可控、孔隙率高、孔隙连通性好的组织工程细胞支架.     

脱细胞软骨基质三维支架的制备及特性研究

[目的]探索脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备及其应用于关节软骨组织工程的可行性。[方法]新鲜牛膝关节软骨粉碎后,梯度离心法获取软骨微粒,采用改进的Courtman改良法处理细胞后,再冷冻干燥,制备脱细胞软骨基质三维多孔支架。然后,采用京尼平对三维支架进行交联,再次冷冻干燥后,对支架材料进行大体、组织学染色及扫描电镜观察,分别测定支架的孔隙率、溶胀率、降解率。最后,分离培养兔骨髓基质细胞(BMSCs),采用MTT法检测BMSCs在支架材料上的生长、增殖情况,以柱形图表示。[结果]大体观察显示支架呈疏松多孔状,京尼平交联后整体呈深蓝色。组织学观察显示支架材料无软骨细胞碎片残留,HE染色、甲苯胺兰染色观察均未见软骨细胞残留。测量示支架孔隙率为90%,溶胀率为(1314±337)%,降解率2周为(13.69±7.3)%,4周为(25.99±8.9)%。MTT法显示细胞在支架上生长良好,与对照组DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P0.05),提示支架无细胞毒性。扫描电镜显示支架内孔洞较明显,BMSCs通过细胞突起黏附于支架表面,黏附良好,能较好地在其上生长。[结论]经改进的Courtman改良法处理的软骨基质三维多孔支架脱细胞更彻底,保留了软骨的天然细胞外基质成分,天然交联剂京尼平交联后支架的细胞相容性好,抗降解性得到了提高,是一种适用于软骨组织工程的良好载体。     

Beta-磷酸三钙复合材料支架的研究进展

外科临床工作中,由于骨缺损或者组织填充需要而要求植骨的情况十分多见,但自体骨的来源有限,体积、形态的塑造均受到很大限制,且会对供区组织的连续造成破坏,并有引起并发症的风险;异体植骨可能引起免疫排斥反应,少数甚至可引发传染性疾病,所以两者的临床应用受到很大限制。因此,人工骨的制备和临床应用成为研究热点之一。     

纳米羟基磷灰石-壳聚糖骨组织工程支架的研究

目的以一种简单、有效的方法制备多孔的纳米羟基磷灰石(nano hydroxyapatite,nano-HA)-壳聚糖(chitosan,CS)复合支架,并评价其理化性能及与细胞相容性。方法采用原位复合-冷冻干燥方法,制备多孔nano-HA-CS支架。通过扫描电镜、透射电镜、X线衍射和傅立叶红外光谱分析支架的微观形貌及材料的组成。分离初生Wistar大鼠的成骨细胞,取传代培养第3代细胞分别与nano-HA-CS支架和纯CS支架共培养2、4、6、8h,各时间点各取4个样品,测定细胞在支架上的黏附率,并通过组织化学染色、扫描电镜观察细胞形态。结果nano-HA-CS复合支架具有多孔结构,孔径为100~500μm,大多数孔径为400~500μm。具有很高的孔隙率,随CS和HA含量的增加,孔隙率明显降低,密度升高。扫描电镜和透射电镜观察显示合成的HA晶体,晶粒大小为纳米级,在支架孔壁上均匀、连续分布如“铺路石”样。X线衍射和红外光谱分析表明合成的HA是含CO32-弱结晶纳米晶体。细胞相容性实验显示,成骨细胞在支架上黏附、增殖,并分泌纤维状细胞外基质;在复合支架上的黏附率明显高于纯CS支架。结论采用原位复合与冷冻干燥法结合制备的nano-HA-CS复合支架具有良好的理化性质和细胞相容性,有望应用于组织工程骨的构建。