神经营养因子基因修饰的神经干细胞在脊髓损伤修复中的应用

中枢神经系统损伤后的再生修复一直是神经科学领域的前沿研究课题。其中脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)无论是在发生率、还是在给患者造成的痛苦和社会负担方面来说,都使其成为该领域的研究重点。但是长期以来SCI缺乏有效治疗手段,因此探索SCI后的再生修复,使截瘫患者站起来,成为骨科和神经科医生最关注的问题之一。     

NT-3基因修饰许旺细胞与神经干细胞联合移植促进大鼠全横断脊髓受损伤神经元的存活及其轴突再生

目的探讨神经营养素-3基因修饰许旺细胞（NT-3-SCs）与神经干细胞（NSCs）联合移植对大鼠因脊髓全横断而受损伤的神经元存活及其轴突再生的作用。方法将NT-3-SCs及LacZ报告基因修饰SCs（LacZ-SCs）与NSCs联合移植到全横断性脊髓损伤处，60d后在脊髓横断处尾侧注射荧光金（FG）进行逆行标记。第67天，取材进行组织学检测大脑皮质体感区、红核及脊髓横断处头侧FG标记神经元；大脑皮质体感区、红核和脊髓背核内存活的神经元以及脊髓损伤处再生的轴突。结果大脑皮质体感区、红核及脊髓L1背核内存活的神经元由多到少依次为NT-3-SCs与NSCs联合组、LacZ—SCs与NSCs联合组和实验对照组。NT-3-SCs与NSCs联合组和LacZ—SCs与NSCs联合组的大脑皮质体感区、红核和脊髓横断处头侧有FG标记神经元；脊髓横断处及其附近组织有5-HT、CGRP和SP阳性神经纤维。结论NT-3-SCs与NSCs联合移植能够促进脊髓全横断损伤后神经元的存活以及轴突再生。     

周围神经延长修复神经短缺的研究进展

周围神经短缺的修复方法较多，神经延长是近年来神经修复的研究热点之一。本文复习了牵拉力对神经影响的研究，并对目前神经延长方法，如神经扩张延长、直接拉拢缝接及神经球瘤缝接的研究进展进行了详细综述。     

VEGF165基因修饰脂肪干细胞对糖尿病大鼠骨缺损的修复研究

目的 :探讨采用基因转染大鼠脂肪干细胞构建血管化组织工程的方法对糖尿病骨质疏松性骨缺损的修复效果。方法:选取雄性Wistar大鼠78只,体重180~220 g,其中72只通过化学药物(STZ)诱导法建立糖尿病动物模型,成模大鼠血糖值均≥16.7 mmol/L。将实验动物随机分为5组,正常对照组6只,其他实验组各18只。正常对照组:在正常大鼠骨缺损内植入经VEGF165基因修饰的脂肪干细胞;糖尿病组:单纯糖尿病骨缺损大鼠;生长因子组:在糖尿病大鼠骨缺损内单纯植入VEGF生长因子;干细胞组:在糖尿病大鼠骨缺损内单纯植入脂肪干细胞;实验组:在糖尿病大鼠骨缺损内植入经VEGF165基因修饰的脂肪干细胞。将5×106个VEGF165-ADSCs细胞与凝胶海绵结合后,植入到糖尿病大鼠骨缺损模型中,在植入后第4周时,采用光学显微镜观察缺损修复组织大体形态;采用免疫组化SP法测定骨缺损区修复后局部微血管密度;应用美国IRIS IntrepidⅡXSP电感耦合等离子体发射光谱仪对修复骨痂内钙/磷含量和碱性磷酸酶(ALP)含量测定;统计分析上述测量结果验证VEGF165-ADSCs对糖尿病大鼠骨缺损的修复作用。结果:荧光染色结果显示,VEGF165表达定位于ADSCs的细胞浆,表达率在87﹪以上;大体组织学观察结果显示:实验组修复区内骨痂生成范围和质量接近正常组,糖尿病组、生长因子组、干细胞组修复效果欠佳。植入后第4周,实验组单位体积的修复组织钙、磷含量和ALP含量明显高于生长因子组、干细胞组(P0.05),与正常对照组组比较差异无统计学意义(P0.05);第4周时,实验组修复局部的血管密度低于正常对照组(P0.05),而显著高于其他组(P0.05)。结论 :VEGF165基因修饰的脂肪干细胞在糖尿病大鼠体内具有良好的成骨及成血管作用,有望成为修复糖尿病特定骨质条件下骨缺损的一种有效手段。     

神经营养素-3与脊髓损伤

脊髓损伤严重地威胁人类生命和健康，它使患者丧失工作能力，生活质量下降，甚至生活不能自理，造成了巨大的人力和经济损失。尽管经历了近100年的探索研究，脊髓损伤的疗效仍未取得突破性的进展，随着研究的深入，近年来人们发现神经营养素是轴突再生不可缺少的物质成份，能减轻脊髓继发性损伤，并能明显促进轴突生长，本文主要对神经营养素家族的重要成员：神经营养素-3在脊髓损伤中的研究进展进行综述：     

不同断面神经束组吻合对周围神经再生影响的实验研究

目的 观察不同断面神经束组吻合对大鼠坐骨神经再生的影响。方法 将32只SD大鼠随机分为四组，各组大鼠均切断双侧坐骨神经后立即在显微镜下左侧施行不同断面神经束组吻合(实验侧)；右侧行同一断面神经束组吻合(对照侧)。分别于第2、4、6、8周检测两侧坐骨神经运动诱发电位的潜伏期、波幅和有髓神经纤维数。结果 各指标经统计学处理，术后第2周，实验侧和对照侧之间差异无统计学意义，术后第4、6、8周实验侧各项指标优于对照侧。结论 不同断面神经束组吻合在神经恢复后期有加速神经再生作用，优于同一断面神经束组吻合。     

断端间距对周围神经再生影响的实验研究

目的 探索较佳修复周围神经损伤的方法。方法 以SD大鼠坐骨神经为实验模型,观察神经切断后保留不同间隙修复后的神经再生情况。术后6周、8周处死大鼠,分别行电生理检测、腓肠肌湿重观察、组织学观察及神经轴突计数。结果 保留3mm神经断端间隙时,各项检查结果均优于其他各组。结论 保留3mm神经断端间隙,术后神经功能恢复最好,可有效地发挥神经再生的趋化作用,且对轴突再生速度无影响。     

自体神经外膜小间隙桥接法构建神经再生室修复周围神经断裂的实验研究

目的 探讨应用自体神经外膜小间隙桥接法构建神经再生室修复周围神经断裂的可行性和优越性.方法 取SD大鼠40只,体质量250～350g,随机分成2组,每组20只.实验组:坐骨神经切断后采用自体神经外膜小间隙桥接法缝合;对照组:坐骨神经切断后采用神经外膜原位缝合.术后2、4、6、8、10、12、14及16周时,分别从2组中各取出2只大鼠,大体观察实验动物肢体恢复自主活动的时间,显微镜视下观察神经再生室及缝合口的大体形态,光镜及电镜下对2组再生神经纤维进行观察.结果 实验组大鼠恢复肢体自主活动快,缝合口与周围组织粘连轻.形态学观察发现小间隙神经纤维排列有序,结缔组织增生明显减少.电镜观察显示神经间隙远端再生神经髓鞘板层呈同心圆状排列致密、整齐,雪旺细胞增生明显.而对照组没有上述改变.结论 自体神经外膜小间隙桥接法构建神经再生室修复周围神经断裂是可行的,优于神经外膜原位缝合法,是修复周围神经断裂的一种新方法.     

周围神经缺损神经移植修复对神经元细胞凋亡的影响

目的：应用移植神经的方法修复周围神经损伤,观察其对神经元的保护作用。方法：选用雄性SD大鼠30只。随机分成正常对照组、神经缺损组、神经损伤组、神经移植组,实验组每组9只大鼠,并按手术先后随机分成7、14、28d3个时间组。将大鼠左侧坐骨神经在梨状肌下缘碾挫或切除0．5cm,分别制备神经损伤或缺损动物模型,并采用神经原位移植的方法修复神经缺损。按术后不同时间处死动物。于术后7、14、28d取L4－6脊髓作TUNEL标记检测,标记凋亡的运动神经元数目。切片作HE、甲苯胺兰染色后计算脊髓内运动神经元的数目。结果：在术后28d,神经移植组的凋亡细胞明显少于另2组（U1＝2．10;U2＝2．89 P＜0．05）。各时间组的神经元数目,神经移植组明显多于另2组（t1=6.84;t2=6.95 P＜0．05）。结论：移植神经对周围神经损伤后的相应神经元,有一定的保护作用。     

胶质细胞源性神经营养因子基因修饰的雪旺氏细胞修复大鼠周围神经缺损的实验研究

目的　从转基因角度探讨治疗周围神经损伤的有效方法。方法　成年Wister大鼠 4 8只 ,平均分为 3组。切断大鼠坐骨神经并形成 10mm长缺损 ,用硅胶管桥接两侧断端 ,管腔内植入胶质细胞源性神经营养因子 (glialcell linederivedneurotrophicfactor,GDNF)修饰的雪旺氏细胞 (schwanncells,SCs) ,正常SCs修复组和单纯硅胶管修复组作为对照 ,分别于术后 4、8、12和 16周对各组动物进行大体观察 ,肌电图测量 ,组织学切片观察 ,再生神经的神经电生理检测 ,GDNF免疫组化检测 ,组织学切片 ,观察和图像分析。结果　GDNF SCs组动物的神经传导速度、有髓神经纤维密度、神经组织面积、髓鞘厚度均显著优于SCs组和硅胶管组。结论　将GDNF基因修饰的雪旺氏细胞移植修复周围神经缺损 ,使局部释放的GDNF维持神经元存活 ,加快轴突再生速度以促进周围神经再生 ,此方法为将来治疗周围神经损伤提供了线索。     

不同微泡浓度对NT-3基因转染神经干细胞的影响

目的探讨低频超声下体外介导神经营养因子3（NT-3）基因转染神经干细胞的适宜超声微泡浓度。方法体外培养神经干细胞,在24孔板中加入200μl不同浓度（分别为10％、20％和30％）微泡和20μl pEGFP-NT-3基因重组质粒（1μg／u1）混合静置30min。将500μl神经干细胞悬液（3×10^5／ml）加入微泡和质粒混合液中,固定声强1．5W／cm^2,照射时间60s,占空比10％,用1MHz超声探头辐照。转染后流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白表达情况,MTT法检测神经干细胞存活率。空白对照组为质粒与神经干细胞的混合物,不经超声辐照。结果微泡浓度为10％时,细胞存活率〉80．00％,但细胞转染率只有（6．26±0．58）％;微泡浓度为30％时,细胞存活率〈40．00％,同时转染率最低;而当微泡浓度为20％时,细胞存活率较高[（69．66±2．08）％],且细胞转染率最高[（14．39±1．79）％]。结论在一定超声辐照参数条件下,微泡浓度20％的细胞转染率较高,且对细胞损伤较小,可作为神经干细胞基因转染的适宜条件。     

腺病毒介导的NT-3基因在骨髓间质干细胞中的表达

目的:研究腺病毒介导的NT-3基因在培养的大鼠骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)中的表达.方法:在293细胞中培养扩增NT-3重组腺病毒(adenovirus vector for NT-3,Ad-NT-3),测定病毒滴度,然后用Ad-NT-3感染传代培养的MSCs,RT-PCR技术检测NT-3基因的表达.结果:Ad-NT-3扩增后获得了较高滴度的病毒,MSCs经Ad-NT-3感染后有NT-3 mRNA的转录.结论:腺病毒介导的NT-3基因可转入培养的MSCs并高效表达,为NT-3基因治疗的研究奠定了基础.     

异体和自体骨髓源神经干细胞周围神经移植实验研究

[目的]研究异体和自体骨髓源性神经十细胞移植于周围神经后神经修复情况，以及所移植神经干细胞能否以分化神经元的形式存活。[方法]取新西兰人白兔骨髓基质细胞(BMSCS)体外培养及诱导分化为神经干细胞，采用Brdu标记细胞和免疫细胞化学SABC法检测观察培养细胞：随机选择同种异体BMSCS移植、自体BMSCS移植和未移植组。[结果]异体和处自体移植区生K的神经纤维均显波纹状排列，神经纤维密度比正常神经低但形态近似，可见有髓神经纤维的郎飞氏结，可见到神经纤维间隙的黏液基质及少量成纤维细胞，但均未见分化神经元样的细胞存在；未移植侧生K的神经纤维稀疏，可见到比较多的断裂和不连续，基质黏液变明显；异体移植组神经纤维生K的走行序列比自体移植组神经纤维紊乱，可见到反应性增生。[结论]异体和白体骨髓源性神经干细胞周围神经缺损区移植均有利于神经纤维的修复，异体比自体移植后神经纤生长较差但差别较小；本方法神经干细胞朱见以分化神经元的形式存活。     

Large-area irradiated low-level laser effect in a biodegradable nerve guide conduit on neural regeneration of peripheral nerve injury in rats

This study used a biodegradable composite containing genipin-cross-linked gelatin annexed with β-tricalcium phosphate ceramic particles (genipin-gelatin-tricalcium phosphate, GGT), developed in a previous study, as a nerve guide conduit. The aim of this study was to analyse the influence of a large-area irradiated aluminium-gallium-indium phosphide (AlGaInP) diode laser (660 nm) on the neural regeneration of the transected sciatic nerve after bridging the GGT nerve guide conduit in rats. The animals were divided into two groups: group 1 comprised sham-irradiated controls and group 2 rats underwent low-level laser (LLL) therapy. A compact multi-cluster laser system with 20 AlGaInP laser diodes (output power, 50 mW) was applied transcutaneously to the injured peripheral nerve immediately after closing the wound, which was repeated daily for 5 min for 21 consecutive days. Eight weeks after implantation, walking track analysis showed a significantly higher sciatic function index (SFI) score (P < 0.05) and better toe spreading development in the laser-treated group than in the sham-irradiated control group. For electrophysiological measurement, both the mean peak amplitude and nerve conduction velocity of compound muscle action potentials (CMAPs) were higher in the laser-treated group than in the sham-irradiated group. The two groups were found to be significantly different during the experimental period (P < 0.005). Histomorphometric assessments revealed that the qualitative observation and quantitative analysis of the regenerated nerve tissue in the laser-treated group were superior to those of the sham-irradiated group. Thus, the motor functional, electrophysiologic and histomorphometric assessments demonstrate that LLL therapy can accelerate neural repair of the corresponding transected peripheral nerve after bridging the GGT nerve guide conduit in rats.     

腺病毒介导的心肌营养素-1基因转染对神经干细胞作用的实验研究

目的:观察腺病毒介导的心肌营养素-1(Adv-CT-1)基因转染对大鼠神经干细胞(NSCs)的作用。方法:分离、培养胚胎大鼠NSCs,以Adv-CT-1基因转染NSCs,应用细胞集落与细胞突起计数、流式细胞仪凋亡检测等技术,检测NSCs的生长与凋亡情况。结果:Adv-CT-1基因转染培养大鼠NSCs可增加NSCs集落数量和诱导分化细胞突起的数量(P<0.05)。在H2O2诱导的NSCs凋亡模型中,转染Adv-CT-1基因的NSCs凋亡细胞数量较对照组减少(P<0.05),存活细胞数增加(P<0.01)。结论:CT-1基因转染可促进NSCs分裂增殖以及细胞突起的生长,减少超氧化损伤诱导的NSCs凋亡发生,促进损伤NSCs的存活。     

神经营养因子-3基因转入雪旺细胞的实验研究

目的观察阳离子脂质体转染神经营养因子-3（NT-3）基因在培养雪旺细胞（Schwann cell，SC）的表达和提高雪旺细胞分泌NT-3的能力。方法用消化后的组织块法和差速离心法分离、纯化雪旺细胞。用脂质体转染法将NT-3基因导入雪旺细胞，ELISA双抗体夹心法检测NT-3的表达；免疫组化S-100法鉴定SC的纯度。结果经免疫组化S-100法鉴定SC的纯度达95％以上。ELISA双抗体夹心法测定转染后不同时期的NT-3的浓度，2周后表达增加，4周后明显增加，差异有统计学意义（P〈0．01）。结论NT-3基因可转入培养的SC并有高效表达。SC作为受体细胞，易于获取并能在体外大量培养繁殖；能较长时间表达所携带基因而不衰减，并能稳定地大量表达。     

水凝胶在周围神经损伤修复领域的应用研究进展

作为临床常见创伤性疾病之一,周围神经损伤(peripheral nerve injury,PIN)由于损伤后再生速度缓慢,常会引起神经疼痛、异常反射、自主神经紊乱等,甚至出现感觉运动障碍严重影响机体功能。即便作为治疗金标准,自体神经移植也存在供区有限、供体损伤等局限性,极大地限制了其临床应用效果。因此,制备适合临床实践的人工神经移植物成为PIN治疗的未来发展趋势,修复损伤缺损和促进神经再生也成为组织工程和再生医学的研究热点。近年来,对人工神经导管(nerve guidance conduits,NGCs)在神经再生修复领域进行了广泛研究,其中支架材料和内填充物作为神经导管的核心要素也成为研究的重点,新材料应用、包埋干细胞/前体细胞、开发负载营养因子及载药缓释系统均取得了一系列成果。本研究探讨了水凝胶及其相关衍生材料在PIN修复领域中的应用进展,为推动组织工程和临床医学的相关研究提供新的思路。     

生物人工周围神经修复大鼠不同长度周围神经缺损

目的 采用一种自行研制的具有良好生物相容性的部分脱乙酰甲壳质构建人工神经来修复大鼠坐骨神经不同长度的缺损，研究证实其修复效果。方法 选用24只健康雄性SD大鼠，随机分为3组造成不同长度（5、10、15mm）的坐骨神经缺损，右侧进行人工神经桥接修复，左侧进行原位神经移植。12周后进行神经电生理检测以及组织学检测。结果 5mm以及10mm组，光镜下能够观察到人工神经内新生的纤维延续存在。组织学证明。此种人工神经能够有效的修复10mm以内的大鼠坐骨神经缺损；神经肌肉复合动作电位的产生表明：12周后神经已经长过缺损段，神经传导功能恢复，并且已经长入远端靶器官。结论 结果证明这种套管能够有效的桥接10mm的大鼠坐骨神经缺损（神经直径的6～8倍）。可能应用于周围神经缺损的治疗。同时可以作为进一步开发组织工程化的人工神经的良好载体。