脊髓腹侧神经元的纯化培养与鉴定

目的探讨胚胎大鼠脊髓腹侧组织神经元的分离、纯化和培养方法,并予以分类鉴定和测定其纯度。方法取胚胎大鼠脊髓腹侧组织分离成细胞悬液,经差速贴壁后在无血清条件培养基里培养,采用免疫细胞化学双标染色法对培养盖片上的细胞予以鉴定、分类,结合Hoechst荧光染核,计数各细胞成分的含量。结果细胞贴壁生长好,神经元占87．8％,其中,运动神经元达70．9％,星形胶质细胞占7．5％,NF200和GFAP染色皆为阴性的细胞占4．7％。结论差速贴壁接种法结合无血清条件培养基培养脊髓腹侧组织能有效抑制星形胶质细胞的快速增殖,能培养出高纯度的神经元,尤其是脊髓运动神经元。     

大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法的改进

目的改进大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,获得纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞。方法取出生后1d内SD大鼠大脑皮质,用机械吹打法使细胞分散制成初细胞悬液,10μm尼龙膜过滤除去成纤维细胞后接种。待7d细胞铺满瓶底后,＂十＂字形震荡培养液5min后传代接种。传代2次后行GFAP免疫组化染色鉴定。结果通过微孔尼龙膜过滤和传代前＂十＂字形震荡培养液等操作可以得到形态典型、纯度较高的星形胶质细胞。通过纯度计算可得离体培养的星形胶质细胞的纯度平均值为95.49%（n=6）。结论改进的星形胶质细胞体外培养方法,降低了实验操作难度,方法稳定有效,得到的星形胶质细胞纯度较高。     

一种改进的大鼠大脑皮质星形胶质细胞的培养方法

目的:改进大鼠大脑皮质星形胶质细胞的培养方法,从而获取高纯度星形胶质细胞用于神经科学研究。方法:新生大鼠(2~3日龄),75%酒精消毒后断头,于冰上取大脑皮质置于冰冷的D-Hanks液中,去除脑膜和血管,剪碎后用0.25%胰酶消化并分离细胞,以1×10~5/ml的密度接种于预铺0.015%多聚赖氨酸的细胞瓶中培养。细胞纯化采用"差速贴壁法"、"梯度血清法"和"十字手摇法",以获取高纯度星形胶质细胞。通过星形胶质细胞特异性表达蛋白即胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)行免疫细胞荧光染色来鉴定细胞纯度。结果:星形胶质细胞纯度大于98%,可多次传代,细胞增殖快,且生长良好。结论:改进的原代星形胶质细胞培养方法,操作简单,细胞纯度高,能满足各种神经科学研究中对高纯度星形胶质细胞培养的实验要求,适宜推广。     

大鼠脊髓星形胶质细胞培养方法的改良

目的:改进大鼠脊髓星形胶质细胞的体外培养方法,为研究脊髓星形胶质细胞的生物学作用及脊髓相关疾病提供实验模型.方法:新生1～2d的SD乳鼠,无菌操作下游离整段脊柱,将脊髓从椎管中冲出,机械吹打制成单细胞悬液,差速黏附处理以去除成纤维细胞成分.利用GFAP免疫荧光显色对培养细胞进行鉴定.结果:经原代和传代培养,获得的星形胶质细胞纯化率高达99%以上.结论:采用本实验室改进的方法,操作简便快捷,培养的大鼠脊髓星形胶质细胞生长良好,纯度高,为后续实验对脊髓星形胶质细胞的生物学作用研究奠定实验基础.     

大鼠脊髓星形胶质细胞的分离与纯化

目的:纯化培养和鉴定新生大鼠的脊髓星形胶质细胞,建立稳定的星形胶质细胞培养体系,为研究创伤后慢性神经病理性痛的脊髓机制奠定基础。方法:根据成纤维细胞与星形胶质细胞生长倍增时间的差异,用阿糖胞苷(Ara-C)抑制成纤维细胞生长分裂的方法获取星形胶质细胞,用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光法对其鉴定。同时与差速贴壁培养法进行对比。结果:用Ara-C处理后,可获得较高纯度的星形胶质细胞,经鉴定其纯度可达90%以上,而对照组几乎全部为成纤维细胞。结论:Ara-C处理能彻底清除成纤维细胞,从而保持星形胶质细胞的正常生长繁殖,达到纯化星形胶质细胞的目的。     

新生大鼠脊髓运动神经元的纯化培养与鉴定

背景：神经元是有丝分裂后的细胞,体外培养很难存活。脊髓运动神经元的分离、纯化和培养同时也是细胞培养的技术难点。 目的：建立新生大鼠脊髓运动神经元培养体系,并予以分类鉴定和测定其纯度。 方法：取新生大鼠脊髓腹侧组织分离成细胞悬液,经密度梯度离心及差速贴壁后纯化培养,采用免疫细胞化学双标染色法对培养盖片上的细胞予以鉴定、分类,结合Hoechst荧光染核,计数各细胞成分的含量。 结果与结论：细胞贴壁生长良好,神经元占85.8%,其中运动神经元达71.6%,星形胶质细胞占7.8%,NF200和胶质纤维酸性蛋白染色皆为阴性的细胞占6.4%。结果说明,取新生大鼠腹侧脊髓组织结合密度梯度离心及差速贴壁接种法可以培养出高纯度的脊髓运动神经元。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程     

单只小鼠来源的大脑皮层星形胶质细胞的体外原代培养

目的:建立单只小鼠来源的星形胶质细胞体外原代培养体系.方法:取单只新生小鼠,无菌操作下取双侧大脑皮质,彻底剥除脑膜,制备细胞悬液,差速贴壁法去除成纤维细胞,悬液原代培养9d左右,待细胞融合成单层并铺满瓶底后,消化传代,胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学显色鉴定星形胶质细胞.结果:分离培养出的星形胶质细胞生长良好,纯化率达95%以上,细胞数目能达到106以上.结论:采用该改进的方法能简捷地用单只小鼠大脑皮层建立星形胶质细胞的体外培养及研究体系.     

胚胎小鼠肠神经胶质细胞的分离与鉴定

目的:建立一种简便的分离与鉴定胚胎小鼠肠神经胶质细胞的方法。方法:分离14～16 d胚胎小鼠肠道组织,制备单细胞悬液,用神经胶质细胞生长专用的培养基进行培养,在倒置显微镜下观察胶质细胞的生长情况。在细胞贴壁达90%以上时进行纯化并传代,待细胞贴壁后使用GFAP、S100b和Sox10蛋白抗体作为胶质细胞的特异性标记物用免疫荧光法进行EGCs纯度的鉴定。结果:培养24 h部分细胞贴壁,随培养天数延长贴壁细胞的数量逐渐增多,胞体较前饱满,突起进一步向外延展。12～14 d时细胞贴壁达90%以上,传代后细胞状态良好。免疫荧光染色可见其GFAP、S100b和Sox10蛋白质染色阳性率均达90%以上,鉴定为肠神经胶质细胞。结论:我们建立了一种简便的分离与鉴定胚胎小鼠肠神经胶质细胞的方法,今后可以用于EGCs自身功能及与其他肠道细胞相互作用的研究。     

新生大鼠脊髓少突胶质细胞体外培养与鉴定

本研究探索利用新生大鼠脊髓培养和纯化少突胶质细胞的方法。取新生大鼠全脊髓,胰酶消化并吹打分散细胞,用含20％胎牛血清的DMEM培养液原代混合细胞培养,细胞铺满瓶底后传代培养。用抗半乳糖脑苷脂抗体和抗胶质原纤维酸性蛋白抗体进行细胞分类免疫组化鉴定。结果显示:少突胶质细胞纯度可达98％以上,表明新生大鼠脊髓是少突胶质细胞体外培养的理想取材部位。本操作简单易行,可以在短时间内获得足量的纯化的少突胶质细胞。     

大鼠少突胶质细胞的纯化培养与鉴定

目的探讨新生2dSprague—Dawley（SD）大鼠脑少突胶质细胞的分离方法和生长条件，为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病的研究奠定基础。方法根据星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长时间差异、细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同，采用两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养获取并鉴定高纯度的大鼠少突胶质细胞。结果培养出突起有如蜘蛛网状的成熟少突胶质细胞，半乳糖脑苷脂（Galactocerebroside，Gal）阳性。结论两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少突胶质细胞。     

人脐血MSCs移植修复大鼠脊髓损伤的效果及机制的初步探讨

目的　探讨人脐血间充质干细胞（MSCs）移植修复大鼠脊髓损伤的作用及机制。 方法　分离纯化人脐血MSCs;制备大鼠脊髓半横断损伤模型,随机分为三组,分别在术后3 d经尾静脉注射生理盐水、培养液和BrdU标记的MSCs。移植后7、14、21、28 d,采用BBB评分法评估各组大鼠脊髓功能恢复情况;免疫荧光双标法检测MSCs在脊髓内的迁移、存活和分化,免疫组织化学法检测炎症因子高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和核因子（NF-κB）在脊髓损伤部位的表达规律。 结果　移植后28 d,MSCs移植组大鼠肢体功能恢复明显,与生理盐水组和培养液组比较差别有统计学意义(P＜0.05)。移植后7、14、21d,脊髓损伤区及周边均可见大量Brdu+细胞,其中BrdU+GFAP+细胞约占53.3%,BrdU+NSE+细胞约占　22.15%。相同时间点MSCs移植组HMGB1和NF-κB的阳性表达率远低于生理盐水组和培养液组,差别有统计学意义(P＜0.05)。 结论　人脐血MSCs移植后可替代损伤的神经细胞,并可减轻脊髓损伤后的炎症反应,从而促进大鼠脊髓功能的恢复。     

Nogo-p4对神经干细胞分化为双极形星形胶质细胞突起长度的影响

目的 观察Nogo-p4对大鼠脊髓来源神经干细胞（NSCs）分化形成双极形星形胶质细胞突起长度的影响。方法 取4只出生24h内的Wistar大鼠,悬浮培养法培养大鼠脊髓来源的NSCs,形成神经球后,以免疫荧光法鉴定NSCs。把NSCs分为A、B两组,A组加入血清,B组加入血清和Nogo-p4,分化7d后,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体标记星形     

嗅鞘细胞移植对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的影响

目的观察嗅鞘细胞移植物对脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能的影响。方法30只雌性成年SD大鼠制成脊髓半横断损伤模型,并随机分成5组立即进行移植,A组移植纯化的嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)悬液,B组移植纯化的OECs培养上清液,C组移植未纯化的OECs,D组移植未纯化的OECs培养上清液,E组移植DMEM/F12培养液,术后6 w内进行BBB评分和IP实验,用单因素方差分析进行统计学分析。结果A组的BBB评分在3w后较其它组高,差异有统计学意义(P<0.05),A组的IP实验结果在4 w后较其它组高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论纯化培养嗅鞘细胞移植能促进脊髓半横断损伤大鼠后肢运动功能恢复。     

Abnormal astrocyte differentiation and defective cellular interactions in wobbler mouse spinal cord

Summary The wobbler mutation is inherited as an autosomal recessive trait and displays a muscular atrophy associated with motoneuron degeneration in early postnatal development. It has been shown that the level of glial fibrillary acidic protein (GFAP) is greatly increased in the spinal cord of wobbler mice. We performed immunocytochemical analyses combined with confocal microscopy to study the developmental distribution of GFAP-positive astrocytes in the spinal cord of wobbler mice during the course of the disease, and in primary cultures of adult wobbler spinal cord astrocytes. Many changes in the number and distribution of astrocytes were observed in the wobbler mice from 1–10 months post-partum. Strongly GFAP-positive astrocytes are present in small number in the anterior horn by 1 month. They increase in number and are observed in the entire spinal cord grey and white matters by 2–10 months. These reactive astrocytes have thick, short, extensively branched processes which contrast with the long, unbranched processes observed in control mice. The wobbler astrocyte processes are oriented perpendicular to the surface of the spinal cord, which contrasts with the normal parallel, concentric orientation. No expansion of astrocyte processes exit from the white matter towards the grey matter. Moreover, the surface of the wobbler spinal cord beneath the meninges displays a dramatic decrease of interdigitating processes, end feet and flattened cell bodies of astrocytes that form a disorganized layer.In vitro, mutant astrocytes have morphological characteristics similar to thosein vivo and, in particular, develop short, thick, branched processes. These mutant astrocytes in cultures do not contact one another, whereas normal mature cultures show an increased incidence of cell-cell contacts between long processes. The increase of astrocyte reactivity associated with these modifications in astrocytic process arrangement may reflect an important primary event in the course of the wobbler disease rather than a non-specific response to motoneuronal death.     

乳鼠肌源性干细胞向许旺样细胞的诱导分化

背景：有证据显示,肌源性干细胞能够促进肌纤维的再生,增强再生肌组织的功能,并具有分化为神经外膜组织细胞和具有许旺细胞表型细胞的潜能。 目的：分析许旺细胞条件培液诱导小鼠乳鼠源肌源性干细胞向许旺细胞的分化,探讨其作为神经组织工程的种子细胞的可行性。 方法：取C57BL/6乳鼠四肢骨骼肌,采用改良的Preplate技术纯化培养肌源性干细胞,利用抗体Desmin和Sca-1对纯化后的细胞进行免疫细胞化学鉴定。采用许旺细胞条件培液诱导其向许旺细胞分化,并行许旺细胞特异性抗体S100β、P75NTR免疫细胞化学鉴定。 结果与结论：从小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞,能在体外稳定增殖传代,Desmin和Sca-1免疫细胞化学染色阳性。肌源性干细胞经体外诱导分化后部分细胞S100β、P75NTR染色阳性。说明应用改良的Preplate方法,可从新生小鼠骨骼肌中分离得到肌源性干细胞;采用许旺细胞条件培液能将其诱导分化为许旺样细胞,有可能成为神经组织工程神经较理想的许旺细胞替代物。     

嗅鞘细胞培养上清液对体外培养脊髓神经元存活及活性的影响

目的:通过检测鞘嗅细胞培养上清液,研究其是否能够分泌促进神经元存活及活性的物质,以便为CNS神经损伤修复提供相关移植的理论依据。方法:分离培养嗅神经及嗅球颗粒层(ONGL)细胞,经过传代培养进行纯化嗅鞘细胞,最后收集其培养上清液。浓缩并检测其蛋白浓度,分别以10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、80ug/ml、160ug/ml的浓度加到培养的脊髓神经元的存活及活性指标。结果:嗅鞘细胞培养上清的蛋白浓度为40ug/ml、80ug/ml时对神经元夏活具有促进作用(与对照组相比P<0.01),而80ug/ml时对神经元活性具有促进作用(P<0.01)。结论:嗅鞘细胞在培养状态能够分泌一些活性物质,这些活性物质对神经元的存活和活性有明显的促进作用。