转染环氧合酶-2反义寡核苷酸对骨肉瘤细胞侵袭性的抑制作用

目的 探讨环氧合酶-2(COX-2)反义寡核苷酸(ODNs)对人骨肉瘤细胞株OS-732侵袭性的抑制作用及其机制.方法 设计和合成COX-2反义寡核苷酸,体外转染骨肉瘤OS-732细胞,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot证实转染效果.改良Boyden-transwell方法观察肿瘤细胞侵袋抑制率,RT-PCR方法研究转染COX-2反义ODNs对OS-732细胞尿激酶型纤溶酶原激活物及其受体(uPA、uPAR)mRNA表达的影响.结果 转染COX-2反义ODNs的细胞COX-2核酸、蛋白表达水平显著降低.转染组细胞侵袭能力显著降低,呈浓度依赖性.转染组细胞uPA、uPAR的mRNA表达水平显著降低(P<0.01).结论 COX-2反义ODNs对OS-732细胞侵袭能力有明显抑制作用,其对uPA、uPAR表达的下调是主要作用机制.     

胆囊癌细胞中转染Survivin和bcl-2反义寡核苷酸后凋亡作用的对比研究

目的:比较转染Survivin、bcl -2反义寡核苷酸(ASODN)对胆囊癌细胞系 GBC SD的凋亡促进作用。方法:设计并合成特异性靶向 Survivin及 bcl- 2 的 ASODN。胆囊癌细胞分为 5 组:空白对照组、Survivin ASODN转染组、bcl- 2 ASODN转染组、Survivin SODN转染组和bcl -2 SODN转染组,转染24h后,采用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)检测Survivin基因、bcl- 2基因表达的变化,流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测 ASODN对细胞的生长抑制率。结果:转染 Survivin及bcl 2 ASODN后,胆囊癌细胞内Survivin基因表达下调 47.8%,bcl- 2 基因表达下调 52.4%;细胞凋亡率分别为(11.4±3. 9)%、(7. 3±3. 2)%,与对照组差异有统计学意义(P< 0. 01)。而转染 SurvivinASODN组及bc1 2ASODN组相比差异也有显著性(P<0.05)。两转染组相对于空白对照组的生长抑制率分别为54.3%、41.6%。结论:Survivin和bcl 2反义寡核苷酸均可有效的抑制Survivin及bc1- 2基因的表达,从而诱导胆囊癌细胞的凋亡,两者相比,Survivin反义寡核苷酸可更为有效地诱导胆囊癌细胞的凋亡。     

反义寡核苷酸对丙型肝炎病毒转染胆管癌细胞的抑制作用

目的　探讨反义寡核苷酸 (ODNs)对丙型肝炎病毒 (HCV)转染胆管癌细胞中HCV的抑制作用。方法　通过半定量逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测HCVmRNA表达的变化 ,观察不同浓度 (0～ 6 .0 μmol/L)的HCV核心区ODNs对体外丙肝病毒感染胆管癌细胞 (QBC939)的抑制作用 ;同时以裸鼠为研究对象进一步观察ODNs对HCV的体内抑制作用。结果　ODNs可有效地进入靶细胞在体外与HCV核心基因杂交结合 ,使HCVmRNA的表达明显降低 ,终浓度为 6μmol/L的ODNs作用下无HCVmRNA表达。动物实验观察ODNs组在裸鼠中的瘤体平均直径小于对照组、PBK HCVC转染组 (P <0 .0 1 ) ,成瘤率 2 5 % (5/ 2 0 )低于PBK HCVC转染组 65 % (1 3/2 0 ) (P <0 .0 5) ,成瘤时间 1 5 .3d较对照组 1 2 .0d、PBK HCVC转染组 1 0 .1d延迟 (P <0 .0 1 )。结论　反义寡核苷酸不失为治疗丙肝病毒感染胆管癌新的途径     

脂质体介导的c-erbB-2反义寡核苷酸转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的效率及作用

目的 探讨阳离子脂质体介导的c-erbB-2反义寡核苷酸(ODNs)转染小鼠乳腺癌TM40D细胞的效率及其对细胞增殖、凋亡的影响。方法 应用流式细胞仪及荧光显微镜观察反义ODNs在1、2、4、6h的转染效率以及在细胞内的分布。应用四甲基偶氮唑蓝比色分析法(MTT)检测反义ODNs对细胞增殖的影响;流式细胞仪检测对细胞凋亡的影响。结果 脂质体可促进反义ODNs进入细胞内,无脂质体介导的反义ODNs转染细胞的效率随转染时间延长逐步增加,而脂质体介导的反义ODNs转染细胞4h效率达到高峰72．23％,6h维持在高水平。脂质体可使反义ODNs在细胞内有效分布,进入细胞核。MTT法检测结果表明c-erbB-2反义ODNs抑制细胞增殖,抑制率为50．24％。流式细胞仪检测结果表明c-erbB-2反义ODNs促进细胞凋亡,正常细胞组凋亡率为9．13％,脂质体组为9．29％,脂质体 反义ODNs组为38．50％。结论 脂质体可促进反义ODNs进入细胞及在细胞有效分布,c-erbB-2反义ODNs可抑制乳腺癌TM40D细胞的增殖及促进癌细胞凋亡。     

胃泌素和胆囊收缩素对胆管癌细胞凋亡阈值的影响

目的　探讨胃泌素和胆囊收缩素 (CCK)对胆管癌细胞凋亡阈值的调节作用。方法　以白僵菌素 (40 μmol/L× 1 2h)为凋亡诱导剂 ,末端标记 (TUNEL)技术检测胃泌素 (Gastrin) 1 7或CCK 8S(1 0 - 8mol/L× 48h)预处理后QBC939胆管癌细胞诱发性凋亡指数 (AI)的变化及反义bcl 2寡核苷酸转染 (1 .32mg/L)的影响。结果　Gastrin 1 7或CCK 8S预处理使AI显著降低 ,与对照组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 1 ) ,同时加入Gastrin/CCK B受体拮抗剂L365 ,2 60或转染反义bcl 2寡核苷酸可逆转 ,与相应Gastrin 1 7或CCK 8S组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 1 )。结论　胃泌素和CCK具有提高凋亡阈值、抑制胆管癌细胞凋亡的作用 ,其机制与上调bcl 2基因表达有关     

胃泌素调节胆管癌细胞凋亡的初步研究

目的探讨胃泌素 (gastrin)对胆管癌细胞凋亡的调节及机理。方法用TUNEL技术和定量RT PCR分别检测胃泌素 17(G 17)对QBC939人胆管癌细胞系白僵菌素诱发性凋亡指数 (AI)和bcl 2 /baxmRNA表达的影响 ,用反义寡核苷酸技术研究bcl 2基因在胃泌素调节细胞凋亡中的作用。结果与对照组比较 ,G 17组AI降低、bcl 2mRNA表达增强 (P <0 0 1) ,baxmRNA无变化 ;胃泌素受体拮抗剂L36 5 ,2 6 0 (L6 0 )可拮抗G 17对AI和bcl 2mRNA表达的影响 (P <0 0 1) ;反义bcl 2寡核苷酸转染可逆转G 17对AI的抑制 (P <0 0 1) ,正义和随机片段无作用。结论胃泌素能提高凋亡阈值、抑制胆管癌细胞凋亡 ,其机理与上调bcl 2表达有关     

反义寡核苷酸降低细胞株SMMC—7721／ADM之MRP基因表达的研究

目的 研究反义硫代磷酸寡核苷酸（AS－ODN）抑制人肝癌细胞耐药株（SMMC－7721／ADM）MRP基因表达的作用。方法 用人工合成互补于MRP基因mRNA特定片断的反义硫代磷酸寡核苷酸，以脂质体Lipofectamine为载体转染SMMC－7721／ADM细胞株，用RT－PCR测定mRNA表达，流式细胞技术测定细胞膜MRP1蛋白P190表达及MTTI地检测细胞对柔红霉素（DNR）和阿霉素（ADM）的敏感性。结果 AS－ODN能抑制AMR mRNA和其蛋白P190表达，提高细胞对DNR和ADM的敏感性。结论 （1）AS－ODN能降低MRP基因表达;(2)MRP介导的多药耐药（MDR）是SMMC－7721／ADM耐药的重要机理之一。     

ets-1反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901侵袭力的影响

目的　研究ets 1反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC 790 1侵袭力的影响。方法　应用ets 1反义、正义寡核苷酸转染SGC 790 1细胞 ,并设磷酸盐缓冲液 (PBS)对照组。转染后应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)检测ets 1mRNA的变化 ,应用Transwell小室检测体外侵袭力的变化 ,并应用裸鼠胃癌皮下转移模型检测对体内侵袭力的影响。结果　转染ets 1反义寡核苷酸后 ,ets 1mRNA表达降低 (0 .42 3± 0 .0 86vs 0 .815± 0 .176、0 .80 7± 0 .169,P <0 .0 1) ,侵过小室滤膜细胞数目减少 (97.1± 11.1vs 198.7± 18.3、2 0 5 .8± 2 2 .2 ,P <0 .0 1) ,裸鼠胃癌生长明显受到抑制 (1.2 8±0 .13vs 1.18± 0 .11、0 .60± 0 .11,P <0 .0 1)。结论　ets 1反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞株SGC 790 1的侵袭力     

反义c-myc寡核苷酸对人肝癌细胞恶性表型的逆转作用

我们采用反义ｃ ｍｙｃ核酸技术观察反义ｃ ｍｙｃ寡核苷酸 (ＯＤＮ)对人肝癌细胞ＳＭＭＣ 772 1生长的抑制作用 ,现将结果报道如下。一、材料与方法1.寡核苷酸的合成及修饰 :正义、错配及反义ｃ ｍｙｃＯＤＮ (均为 15 ｍｅｒ)的合成和磷酸基硫代化修饰均由上海生物工程公司完成。设计的序列为 :5’ ＡＴＧＣ ＣＣＣＴＣＡＡＣＧＴＴ 3’正义寡核苷酸序列 ;5’ ＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＧＣＡＴ 3’反义寡核苷酸序列 ;5’ ＴＡＣＧＧＧＧＴＴＧＡＧＣＡＡ 3’错配链寡核苷酸序列。2 .人肝癌细胞ＳＭＭＣ 772 1培养和基因转染 :人肝癌细胞Ｓ…     

ets-l反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901体外侵袭力的影响

目的 :研究ets l反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC 790 1体外侵袭力的影响。方法 :应用ets l反义、正义寡核苷酸转染SGC 790 1细胞 ,并设PBS对照组。转染后应用逆转录聚合酶链式反应检测ets lmRNA的变化 ,应用克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化 ,Transwell小室检测侵袭能力的变化。结果 :转染ets l反义寡核苷酸后 ,ets lmRNA表达降低 ,反义组形成克隆数目 (2 4 2± 4 8)较正义组、对照组减少 (47 6± 8 1,4 4 3± 7 6 ,P <0 0 1) ,侵过小室滤膜细胞数目减少 (97 1± 11 1,198 7± 18 3,2 0 5 8± 2 2 2 ,P <0 0 1)。结论 :ets l反义寡核苷酸能够抑制胃癌细胞株SGC 790 1的体外侵袭力。     

survivin基因反义寡核苷酸对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞凋亡与细胞周期的调控作用

目的研究survivin基因反义寡核苷酸转染对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞周期、细胞凋亡的作用及其可能的作用机制。方法采用脂质体介导survivin基因反义寡核苷酸转染人肝癌SMMC-7721细胞,透射电镜观察细胞超微结构,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,RT-PCR方法检测cyclin B1 mRNA的表达。结果survivin反义寡核苷酸转染后细胞内cyclin B1表达由0.36±0.03增加至0.91±0.03,同时G2-M期细胞及凋亡细胞比例分别由5.81%及0.7%明显增加至42.11%及31.35%,同时细胞超微结构呈典型凋亡样改变。结论survivin基因反义寡核苷酸转染细胞后可以通过诱导cyclinB1的表达,导致G2-M期阻滞,从而诱导细胞凋亡的发生。survivin基因反义寡核苷酸转染可以作为治疗肝癌的重要新方法。     

转录因子诱骗性寡核苷酸转染猪血管内皮细胞抑制人补体介导的异种细胞毒作用

目的 探讨转录因子SP1诱骗性寡核苷酸(decoy ODNs)转染的猪血管内皮细胞对人血清补体介导的异种细胞毒作用的影响.方法 将培养的永生化猪血管内皮细胞系细胞株SV-40-PED分为3组.转染组:SV-40-PED转染了SP1 decoy ODNs;错配组:SV-40-PED转染了错配的decoy ODNs;空转染组:SV-40-PED仅用转染试剂oligofectamine作用.转染后26 h,采用细胞爬片免疫荧光技术、蛋白印迹法、逆转录聚合酶链反应及乳酸脱氢酶释放试验进行检测,分别观察各组SV-40-PED胞膜α-半乳糖残基(α-Gal)、蛋白质和α1,3-半乳糖基转移酶(α1,3-GT)mRNA等表达的变化,以及转染了SP1 decoy ODNs的SV-40-PED对人血清补体介导的细胞毒作用的影响.结果 转染组SV-40-PED胞膜α-Gal的荧光表达明显减弱,部分胞膜可见点状荧光缺损,而空转染组和错配组仍可见明亮的绿色荧光.转染组蛋白表达水平均有不同程度的下降,相对吸光度(A值)仅为未转染组的52.6%.转染组α1,3-GT基因异构体1和2 mRNA的相对表达量分别为0.42±0.20和0.27±0.12,空转染组分别为0.72±0.17和0.50±0.19,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05);错配组与空转染组相比,差异无统计学意义(P>0.05).体积分数为20%和40%的人血清对空转染组和错配组SV-40-PED均有不同程度的杀伤,而对转染组SV-40-PED的杀伤明显减弱(P<0.05).结论 经SP1 decoy ODNs转染的猪血管内皮细胞可以抑制人血清补体介导的异种细胞毒作用.     

硫化型反义寡核苷酸逆转乳腺癌多药耐药的研究

多药耐药 (MDR)是恶性肿瘤化疗中经常遇到的现象 ,我们通过合成互补于多药耐药基因 1(Mdr 1)cDNA起始密码区的反义寡核苷酸 (ASODN ) ,以不同的浓度转染乳腺癌耐药细胞株 ,研究转染后 7d内实验细胞Mdr 1mRNA及其表达的P gp每天的变化情况 ,探讨A SODN转染肿瘤细胞的理想作用浓度和转染后出现最大逆转效果的时段。一、材料和方法1.细胞培养 :耐阿霉素的人乳腺癌细胞株MCF 7/ADR来自美国国立癌症研究所 ,常规方法进行培养 ,取对数生长期细胞进行实验。2 .ASODN的合成及修饰 :针对Mdr 1cDNA的起始密码区合成ASODN ,其碱基序…     

端粒酶反义寡核苷酸对肾癌细胞端粒酶活性及其体外增殖的影响

目的　探讨端粒酶反义核酸对肾癌细胞端粒酶活性和体外增殖的影响。　方法　以端粒酶RNA模板区为靶点 ,序列为TAGGGTTAGACAA的硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸 (ASON )与肾癌细胞株RCZ细胞共同孵育 ,计 1～ 2 8天细胞数 ,MTT比色法测细胞生长抑制率 ,PCR ELISA法检测端粒酶活性。　结果　ASON实验组与随机引物及空白对照组比较 ,端粒酶活性明显降低 (P<0 .0 0 1) ,细胞增殖数目显著减少 (P <0 .0 1) ,抑制率显著增加 (P <0 .0 0 1) ,抑制效果显示剂量依赖性 (P <0 .0 5 ) ,具有序列选择的特异性。　结论　以端粒酶RNA模板区为靶点的反义寡核苷酸抑制肾癌RCZ细胞的端粒酶活性和体外增殖 ,可能对肿瘤治疗有潜在的意义。     

ets-1反义寡核苷酸对胃癌细胞株SGC-7901体外侵袭力的影响

目的:研究ets-1反义寡核苷对胃癌细胞株SGC-7901体外侵袭力的影响.方法:应用ets-1反义、正义寡核苷酸转染SGC-7901细胞,并设PBS对照组.转染后应用逆转录聚合酶链式瓜检测ets-1mRNA的变化,应用克隆形成试验检测细胞增殖活性的变化,Transwell小室检测侵袭能力的变化.结果:转染ets-1反义寡核苷酸后,ets-1mRNA表达降低,反义组形成克隆数目(24.2±4.8)较正义组、对照组减少(47.6±8.1,44.3±7.6,P＜0.01),侵过小室滤腊细胞数目减少(97.1±11.1,198.7±18.3,205.8±22.2,P＜0.01).结论:ets-1反义,SGC-7901细胞·肿瘤侵犯·体外研究     

整合素连接激酶反义寡核苷酸对胃癌细胞的作用

目的探讨全硫代修饰整合素连接激酶(integrin-linkedkinase,ILK)反义寡核苷酸(antisenseoligonucletide,ASODN)导入胃癌细胞株SGC-7901后对胃癌细胞的作用。方法(1)应用脂质体将ILK的ASODN导入胃癌细胞系SGC-7901,以RT-PCR及Western印迹方法检测作用后胃癌细胞ILK的mRNA和蛋白水平的变化;(2)应用MTS法及流式细胞术评价ILK的ASODN导入细胞后对其体外增殖和凋亡的影响。结果(1)转染后胃癌细胞ILK的蛋白表达水平明显下降,但mRNA水平无明显变化;(2)胃癌细胞生长受到明显抑制,抑制效应具有浓度依赖性,并可明显诱导细胞产生凋亡。结论ILK反义寡核苷酸导入胃癌细胞株SGC-7901后可以降低细胞内ILK的蛋白表达水平,并可体外抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡。     

反义抑制微小RNA-21对程序性细胞坏死因子4和张力蛋白同源物基因在鳞状细胞癌A431细胞株中表达及细胞凋亡的研究

目的 观察转染反义抑制微小RNA-21(miR-21)对A431细胞株中程序性细胞坏死因子4(PDCD4)和磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)表达及细胞凋亡的影响.方法 对A431细胞转染反义miR-21(Anti-miR-21),采用免疫细胞化学法检测转染前后A431细胞株中PDCD4和PTEN的表达,采用原位末端转移酶标记(TUNEL)检测转染前后A431细胞株中细胞凋亡.结果 细胞组、转染无关序列组和转染miR-21反义寡核苷酸组PDCD4表达平均吸光度(IA)值分别为62 340.03 ±2157.52、55 871.36±7281.27和175 302.34±14 571.90,差异有统计学意义(F =50.12,P＜0.05)；细胞组、转染无关序列组和转染miR-21反义寡核苷酸组PTEN表达IA值分别为19 206.26 ±655.01、19 149.26±1058.29和135 572.92±4685.05,差异有统计学意义(F=576.54,P ＜0.05)；细胞组、转染无关序列组和转染miR-21反义寡核苷酸组凋亡细胞比例分别为9.90％、12.95％和31.63％,差异有统计学意义(F=201.79,P＜0.05).结论 转染Anti-miR-21后A431细胞株中miR-21表达下降,这种抑制可以上调A431细胞株中PDCD4和PTEN的表达,加速肿瘤细胞凋亡.     

反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞bcl-2基因的表达并增强凋亡的研究

目的　观察反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞bcl 2基因的表达并诱导凋亡和增强化疗的敏感性。方法　应用反义硫代寡核苷酸 (bcl 2SON)和顺铂共同处理结肠癌细胞系SW62 0 ,通过流式细胞仪观察其bcl 2蛋白表达的变化 ,并通过原位末端标记法 (TUNEL)染色和流式细胞仪检测细胞凋亡指数。结果　用bcl 2SON处理过的SW62 0细胞其bcl 2蛋白平均荧光强度 (MFI)为(40 .3± 8.7) %与空白对照及随机链对照组相比 ,差异有非常显著性 (P <0 .0 1 ) ,表明导入反义bcl 2后可明显抑制结肠癌细胞的bcl 2蛋白的表达。经bcl 2SON和 1 0mg/L顺铂共同处理的SW62 0细胞凋亡指数为 (64 .7± 8.4) % ,显著高于单纯顺铂处理组的 (2 3 .6± 6 .3) % (n =5 ,P <0 .0 1 )以及单纯bcl 2SON处理组的 (2 7.5± 5 .1 ) % (n =5 ,P <0 .0 1 )。而未经处理的对照组SW62 0细胞凋亡指数则为 (8.5± 1 .2 ) % ,显著低于后两组 (n =5 ,P <0 .0 5)。结论　bcl 2SON可通过抑制结肠癌细胞 (SW 62 0 )bcl 2蛋白的表达 ,诱导其凋亡 ,增强对化疗药物的敏感性     

Stat3反义寡核苷酸联合化疗调控结肠癌细胞增殖与凋亡的分子机制

目的　探讨Stat3反义寡核苷酸 (Stat3AS ON)联合 5 氟尿嘧啶 (5 FU )治疗结肠癌的作用机制。方法　应用Stat3AS ON与 5 FU处理结肠癌细胞HCT116,Westernblot检测Stat3、p Stat3、CyclinD1与bcl xL表达 ,MTT法检测细胞增殖状态 ,流式细胞技术检测细胞周期与凋亡。结果　Stat3AS ON与 5 FU作用于HCT116细胞 72h后 ,G1期细胞比率由 63 .7%上升至 82 .2 % ,S期细胞比率分别由 17.6% ,下降至 9.9% ,凋亡细胞百分比由 6.1%增加至 3 2 .0 %。Stat3AS ON与 5 FU可以抑制结肠癌细胞增殖 ,促进结肠癌细胞凋亡 ,联合应用Stat3AS ON与 5 FU可以起协同作用 ,明显抑制结肠癌细胞Stat3信号转导通路活化。结论　选择性阻断细胞内信号转导通路可能为治疗结肠癌提供新途径     

抑制复制蛋白A1表达对食管癌细胞放射敏感性的影响

目的 观察抑制复制蛋白A1(RPA1)表达对食管癌细胞放射敏感性的影响.方法 脂质体介导转染RPA1反义寡核苷酸及阴性对照寡核苷酸于人食管癌TE-1细胞中,设空白对照组(只加培养基)、Mock组(转染试剂组)、对照组(阴性对照寡核苷酸组)及实验组(反义寡核苷酸组),分别以24、48、72、96h为转染时间点;通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)和Western blot法分别检测各组食管癌TE-1细胞RPA1 mRNA及其蛋白表达;并给予6MV X射线单次照射6Gy,用细胞计数试剂盒(CCK)-8法检测各组食管癌细胞放射敏感性的差异.结果 RT-PCR、qRT-PCR及Western blot法结果显示实验组食管癌TE-1细胞的RPA1 mRNA 及蛋白表达均降低;CCK-8结果显示实验组食管癌TE-1细胞的增殖率低于其他各组(P＜0.05).结论 抑制食管癌rE-1细胞RPA1表达,可增加食管癌TE-1细胞的放射敏感性.