超声微泡介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤作用

目的 观察超声微泡(UM)介导HSV1-TK/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞株HepG2的杀伤效率.方法 将HepG2接种在培养板中,随机分为以下5组:(A)空白对照组;(B)单纯质粒组;(C)超声微泡+质粒组;(D)超声+质粒组;(E)超声+超声微泡+质粒组.转染后24 h,荧光显微镜观察各组细胞绿色荧光的表达,流式细胞仪检测各组细胞的转染效率,噻唑蓝(MTT)比色法检测转染方法对HepG2活性的影响,Western blot法检测各组细胞的TK蛋白表达;转染后24h,各组细胞加入0、0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、500.0、1000.0 mg/L共8个浓度梯度的前药更昔洛韦(GCV),72 h后MTr法检测各组细胞的存活率.结果 荧光显微镜下E组的绿色荧光强度明显高于其他各组;流式细胞仪检测基因转染率分别为0％、0.39％、0.61％、1.10％、36.00％,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测提示E组tk mRNA相对表达量为1.13,是其余各组的7～9倍,Western blot 条带灰度分析显示E组TK蛋白的明显高于其他各组(P＜0.05);转染方法对HepG2细胞活性无明显影响(P＞0.05);GCV浓度在50 mg/L以上培养72 h后,低频超声+超声微泡+质粒组细胞几乎全部被杀灭,存活率为0,杀伤效应最强(P＜0.05),其余各组几乎无杀伤作用.结论 超声破坏微泡造影剂可提高HSV1-TK基因在HepG2中的转染和表达,增强HSV1-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤效应,而超声辐照和微泡造影剂在转染过程中对细胞的活性无影响.     

不同方法转染人前列腺癌PC-3细胞pEGFP-N1基因的体外实验研究

目的:探讨转染人前列腺癌PC-3细胞pEGFP-N1基因的最佳转染方法。方法:以超声微泡造影剂、超声辐照、脂质体转染及其相互结合的方法,将质粒pEGFP-N1基因转染人前列腺癌PC-3细胞,24h后以荧光显微镜观察前列腺癌PC-3细胞中的绿色荧光蛋白表达情况,并用流式细胞仪测定转染率。结果:以超声+微泡+脂质体组基因转染效率最高,与其他组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:超声联合微泡与脂质体结合能明显提高pEGFP-N1基因在人前列腺癌细胞中的转染率,是一种较理想的基因转染方法。     

不同微泡浓度对NT-3基因转染神经干细胞的影响

目的探讨低频超声下体外介导神经营养因子3（NT-3）基因转染神经干细胞的适宜超声微泡浓度。方法体外培养神经干细胞,在24孔板中加入200μl不同浓度（分别为10％、20％和30％）微泡和20μl pEGFP-NT-3基因重组质粒（1μg／u1）混合静置30min。将500μl神经干细胞悬液（3×10^5／ml）加入微泡和质粒混合液中,固定声强1．5W／cm^2,照射时间60s,占空比10％,用1MHz超声探头辐照。转染后流式细胞仪检测细胞绿色荧光蛋白表达情况,MTT法检测神经干细胞存活率。空白对照组为质粒与神经干细胞的混合物,不经超声辐照。结果微泡浓度为10％时,细胞存活率〉80．00％,但细胞转染率只有（6．26±0．58）％;微泡浓度为30％时,细胞存活率〈40．00％,同时转染率最低;而当微泡浓度为20％时,细胞存活率较高[（69．66±2．08）％],且细胞转染率最高[（14．39±1．79）％]。结论在一定超声辐照参数条件下,微泡浓度20％的细胞转染率较高,且对细胞损伤较小,可作为神经干细胞基因转染的适宜条件。     

The Research of EGFP Plasmid Transfection in Hepatoma Cells Mediated by Ultrasound Targeted Microbubble Destruction

目的 探讨超声靶向微泡破裂(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数.方法 体外培养HepG2细胞,在不同治疗超声的声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中的转染.荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测细胞的转染率,MTT法检测细胞活性.结果 在超声声强为2 w/cm2、占空比为20％、照射时间为60s时,HepG2细胞的7转染率最高,达到11.53％±2.15％,且细胞生存率大于85％.结论 UTMD是一种有效的基因转染方法,不同的超声转染参数对细胞活力和基因传输效率有较大影响,对其进行优化后可减少细胞损伤,增强基因转染.     

超声靶向微泡破裂介导EGFP质粒转染肝癌细胞的研究

目的探讨超声靶向微泡破裂(Ultrasound Targeted Microbubble Destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数。方法体外培养HepG2细胞,在不同治疗超声的声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中的转染。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在HepG2细胞中的表达,流式细胞仪检测细胞的转染率,MTT法检测细胞活性。结果在超声声强为2 w/cm2、占空比为20%、照射时间为60 s时,HepG2细胞的7转染率最高,达到11.53%±2.15%,且细胞生存率大于85%。结论 UTMD是一种有效的基因转染方法,不同的超声转染参数对细胞活力和基因传输效率有较大影响,对其进行优化后可减少细胞损伤,增强基因转染。     

超声联合微泡体外介导NT-3基因转染神经干细胞的超声占空比探讨

目的 探讨低频超声体外介导神经营养因子-3 (neurotrophin-3,NT-3)基因转染神经干细胞的适宜超声占空比条件. 方法 体外培养神经干细胞,在24孔板中加入200μl微泡(浓度20％)和20μl pEGFP-NT-3基因重组质粒(1 μg/μl)混合静置30 min.将500μl神经干细胞悬液(3×105/ml)加入到微泡和质粒混合液中,采用超声声强1.5 W/cm2,照射时间60s,占空比分别为10％、25％和50％.用1 MHz超声探头辐照上述混合液,转染后用流式细胞仪检测各组细胞基因转染率,MTT法检测神经干细胞存活率.空白对照组为未经超声辐照的质粒与神经干细胞混合物. 结果 随着超声占空比升高,细胞存活率逐渐降低.占空比为50％时,细胞存活率低于40％;占空比为25％时,细胞存活率高于60％,且基因转染率明显高于占空比10％和50％组,为(18.60±0.90)％. 结论 通过优化超声占空比条件,证明适宜的超声占空比为25％,神经干细胞转染率最高,且细胞损伤较小.     

超声微泡介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因体外转染兔软骨细胞的研究

目的 观察超声介导下携白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因(IL-1Ra)的微泡体外转染兔软骨细胞的效率和表达.方法 体外分离培养兔软骨细胞,分为单纯质粒组(P)、微泡+质粒组(M+P)、超声+质粒组(U+P)和超声+微泡+质粒组(U+M+P),照射后48 h,荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测IL-1Ra基因的mRNA和蛋白表达,台盼兰染色检测细胞生存率.结果 U+M+P组转染效率较其他三组明显提高,为(11.6±1.0)%;且eGFP-C1-IL-1Ra质粒经超声微泡介导转染后可表达IL-1Ra的mRNA和蛋白.结论 超声微泡可介导IL-1Ra基因在兔软骨细胞内的转染和表达,可望成为软骨损伤基因治疗的新方法.     

超声辐照微泡介导双自杀基因转染对裸鼠乳腺癌杀伤作用的在体研究

目的：探讨超声辐照微泡介导CD/TK双自杀基因质粒转染对在体乳腺癌的杀伤效应。 方法：用人乳腺癌MCF-7细胞建立裸鼠移植瘤模型后,将荷瘤裸鼠随机分为对照组、质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组,每组5只。对照组仅给予CD与TK相应的前药（5-氟胞嘧啶与更昔洛韦）;质粒组注射质粒（含CD/TK基因）与前药;超声辐照组注射质粒与前药,并予超声辐照;超声辐照微泡组注射靶向超声造影剂（质粒与微泡混合物）与前药,并予超声辐照。实验期间记录裸鼠肿瘤生长情况;处理结束后5 d,剥除肿瘤,计算各组的抑瘤率;用倒置荧光显微镜观察目的基因瘤内转染情况,计算基因转染效率;RT-PCR法检测目的基因的表达;免疫组化法计数肿瘤的微血管密度（MVD）。 结果：与对照组比较,质粒组肿瘤的生长无统计学差异（P>0.05）,而超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤生长被明显抑制（均P<0.05）,质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组的抑瘤率分别为3.72%、21.40%、47.13%。质粒组、超声辐照组、超声辐照微泡组基因转染效率分别为0.78%、2.81%、23.87%,后者转染效率明显高于前两组（均P<0.05）。超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤组织中均出现CD/TK基因阳性片段,而对照组与质粒组的肿瘤组织中未见。超声辐照组与超声辐照微泡组肿瘤组织MVD计数均明显低于对照组,且超声辐照微泡组低于超声辐照组（均P<0.05）,质粒组MVD计数与对照组无统计学差异（P>0.05）。 结论：超声辐照微泡介导的双自杀基因系统能有效提高基因转染效率与表达,从而增强对肿瘤生长和肿瘤微血管的生成的抑制作用。     

超声辐照参数对体外基因转染效果的影响

目的探讨超声辐照参数对体外基因转染效果的影响及最佳转染条件。方法将293T细胞种植于24孔板内,24h后更换为转染液进行超声辐照,EGFP质粒浓度为1mg/ml,每孔加入15μg;超声强度分为1.5、2.0、2.5W/cm2,辐照时间分为30、45、60s,微泡浓度分为20%、30%、40%;每个参数相互组合并重复4次。转染后72h于荧光显微镜下观察细胞内绿色荧光蛋白的表达,以流式细胞仪检测荧光细胞比例,CCK-8检测细胞存活率,计算转染效率。结果超声声强、辐照时间、微泡浓度均对转染效率有显著影响。辐照条件为2.0 W/cm2、辐照时间45s、微泡浓30%时转染效率最高,可达(35.25±1.40)%。结论超声辐照参数共同影响转染效果,低条件下相互协同,高条件下相互抑制,选择合适的辐照参数是超声介导体外基因转染的重要因素。     

磁性纳米介导的pcDNA3.1(+)-p53对HepG2细胞的作用

目的:探讨氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米介导的pcDNA3.1(+)-p53质粒（-p53质粒）对人肝癌HepG2细胞的作用。方法:（1）以-p53质粒作为表达基因，用氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒进行细胞转染，计算转染率，并与脂质体转染组，空白载体组及空白对照组进行比较。（2）观察在外加磁场条件下的氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒的转染效率和速度。（3）观察-p53磁性纳米粒对HepG2细胞生长增殖的抑制作用。结果:（1）RT-PCR及Western blot 检测证实，载有氨基硅烷化Fe3O4的磁性纳米粒能成功的在人肝癌HepG2细胞中导入了外源性的野生型p53基因，其转运效率（39%）略高于相同条件下脂质体的转染效率（36%）（P>0.05）。（2）在外加磁场条件下氨基硅烷化Fe3O4磁性纳米粒的转染效率明显增强。（3）转染的外源性p53基因可明显抑制人肝癌HepG2细胞的生长速度及集落形成能力，使细胞阻滞于G1期，抑制率为46%。结论:（1）氨基硅烷化Fe3O4纳米颗粒是良好的基因转运载体，可将外源性基因成功的转入靶细胞。（2）转入外源性野生型p53能有效抑制HepG2细胞的生长增殖。该研究为基因治疗恶性肿瘤的在体实验奠定了基础。     

不同方法HBx基因表达质粒转染肝癌HepG2细胞的效果比较

目的：比较Lipo2000、磷酸钙法和Lonza电转法转染乙型肝炎病毒X（HBx）基因的表达质粒pHA-HBx至HepG2肝癌细胞的转染效率及其细胞毒性。 方法：分别用Lipo2000、磷酸钙法和Lonza电转法将绿色荧光蛋白（GFP）标记的pHA-HBx转染至HepG2肝癌细胞，以荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率，RT-PCR鉴定HBx基因在HepG2细胞基因组的整合，Annexin V/PI法检测细胞的存活情况。 结果：RT-PCR结果显示，外源性HBx基因通过3种转染方法均可导入HepG2细胞并表达；Lipo2000和Lonza电转法的转染效率均高于磷酸钙法（均P<0.05），而Lipo2000和Lonza电转法的转染效率间差异无统计学意义（P>0.05）；细胞存活率从高到低依次为Lonza电转法、Lipo2000、磷酸钙法（均P<0.05）。 结论：Lonza电转法转染pHA-HBx至HepG2肝癌细胞转染效率高，且细胞毒性小，是较好的转染方法。     

重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP的构建及在HepG2细胞的表达

目的 构建热休克蛋白70(HSP70)启动子调控内皮抑素(Endo)基因的重组质粒pcDNA3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP,观察其在HepG2细胞中的表达规律.方法 用聚合酶链反应(PCR)法体外扩增HSP70启动子(350 bp);用EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ双酶切法切取质粒pSP-Endo/EGFP中Endo/EGFP,克隆到pcDNA 3.1(+)中获得重组质粒pcDNA 3.1(+)/HSP70-Endo/EGFP.脂质体介导转染HepG2细胞,转染24 h后予以37、39、41、43、45℃加热诱导30 min,荧光显微镜和流式细胞术检测EGFP的表达,逆转录(RT)-PCR法检测细胞内Endo mRNA的表达;ELISA法检测转染细胞上清中Endo蛋白浓度.结果 合成HSP70启动子序列测序结果与Gene Bank中AL671762所提供序列完全一致.低温加热可增强HepG2细胞中Endo/EGFP表达,43℃组EGFP表达强度达37℃组的3.3倍.43℃组Endo mRNA表达水平高于不加热组.43℃组上清Endo蛋白浓度为(177±28)μg/L,高于不加热组(43±11)μg/L.结论 成功构建HSP70启动子调控Endo基因的重组质粒,低温加热可增强HepG2细胞中Endo基因的表达.     

巨噬细胞移动抑制因子小干扰RNA对肝癌细胞表达血管内皮生长因子的抑制效应

目的 观察巨噬细胞移动抑制因子(MIF)小干扰RNA(siRNA)对肝癌细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 Western blot检测MIF和VEGF在肝癌和癌旁组织的表达情况;人工化学合成MIF siRNA和对照siRNA,将其转染PLC、HepG2肝癌细胞株,定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot检测MIF和VEGF mRNA及其蛋白的表达.结果 MIF、VEGF mRNA和蛋白在肝癌组织中高表达.MIF siRNA(50、100 nmol/L)转染肝癌细胞株后,PLC细胞MIF和VEGFmRNA水平分别下调(78.8±7.2)%、(90.4±2.9)%和(60.6±2.6)%、(79.8±1.2)%;HepG2细胞MIF和VEGF mRNA水平分别下调(74.3±8.9)%、(88.4±4.6)%和(65.6±4.6)%、(80.7 ±2.2)%.MIF蛋白分别下调(57.3±3.4)%、(78.7±1.2)%和(54.8±6.8)%、(77.9±2.3)%,并呈剂量依赖关系;伴随MIF mRNA和蛋白的表达下调VEGF蛋白分别下调(52.6±12.9)%、(87.4±2.3)%和(52.4±11.1)%、(68.5±2.8)%,亦呈剂量依赖关系,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),两干预组间的差异也有统计学意义(P<0.05).结论 MIF siRNA能特异性阻断PLC及HepG2细胞MIF mRNA和MIF蛋白的表达,并且同时有效下调VEGF mRNA及其蛋白的表达,MIF可能通过调控VEGF基因和蛋白的表达,参与肿瘤血管的生成和促进肿瘤细胞的转移.     

肝靶向性Gal-PEG-PEI纳米载体介导psiRNA转染HepG2细胞效率的检测

目的 检测肝细胞靶向性Gal-PEG-PEI纳米基因载体介导psiRNA转染HepG2细胞的效率.方法 纳米粒径仪和透射电镜测定Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径和形态,转染HepG2细胞,48 h后用流式细胞仪测定转染效率.转染前加入1 mg半乳糖观察其半乳糖竞争拮抗结果.结果 Gal-PEG-PEI/psiRNA复合物的粒径随N/P的增大而减小,最小粒径为81.1 nm;Gal-PEG-PEI载体的转染效率为(37.34±2.50)%,明显高于PEG-PEI、LipofectamineTM 2000及裸psiR-NA;加入竞争拮抗剂半乳糖后Gal-PEG-PEI的转染效率下降至3.60%.结论 Gal-PEG-PEI纳米基因载体对HepG2细胞有较高的转染效率,具有良好的肝细胞靶向性.     

三结构域蛋白28通过上皮-间充质转化对肝癌细胞侵袭迁移的影响

目的观察沉默三结构域蛋白28(TRIM28)表达对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响。方法通过RNA干扰技术(RNAi)构建干扰TRIM28表达的短发卡RNA(shRNA)质粒,对高表达TRIM28的肝癌细胞株HepG2和人高转移肝癌细胞(HCCLM3细胞)对照组及实验组转染shRNA 48 h后,应用实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)检测TRIM28基因沉默效率。应用划痕迁移实验和Transwell侵袭实验检测TRIM28基因沉默对肝癌细胞迁移及侵袭能力的影响,并通过RT-qPCR及蛋白质印迹法(Western blot)检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)及β-连环蛋白(β-catenin)表达。使用SPSS 19.0软件进行统计学分析,组间比较采用t检验。结果RT-qPCR结果显示实验组TRIM28表达(HepG20.84±0.02,HCCLM30.69±0.02)在两组肝癌细胞中均低于对照组(HepG21.00±0.05,HCCLM31.00±0.07,t=5.488、7.240,P<0.01),差异有统计学意义。划痕实验结果显示,48 h实验组HepG2和HCCLM3细胞迁移率[(57.83±0.02)%、(21.52±0.05)%]均明显低于对照组[(94.96±0.02)%、(38.10±0.03)%],差异有统计学意义(t=22.971、5.780,P<0.01)。Transwell侵袭实验结果显示,相应实验组穿膜细胞数分别为(57.88±5.24)、(3.33±1.36)个,明显低于对照组(265.52±9.31)、(26.03±3.13)个,差异有统计学意义(t=23.050、13.242,P<0.01)。Western blot结果显示,HepG2和HCCLM3细胞N-cadherin蛋白表达量(0.31±0.06,0.63±0.08,t=4.822、2.951,P<0.05)、Vimentin(0.41±0.03,0.32±0.02,t=2.909、7.944,P<0.05)及β-catenin(0.10±0.03,0.12±0.02,t=2.970、4.157,P<0.05)低于对照组,E-cadherin表达升高(0.25±0.05,0.27±0.07,t=3.242、5.021,P<0.05),差异有统计学意义。RT-qPCR结果显示,实验组E-cadherin表达高于对照组(1.80±0.30,1.40±0.17,t=4.571、3.095,P<0.01),差异有统计学意义,N-cadherin(0.42±0.01,0.84±0.03,t=22.460、8.441,P<0.01)、Vimentin(0.18±0.00,0.84±0.02,t=52.230、6.194,P<0.01)及β-catenin表达低于对照组(0.72±0.07,0.34±0.07,t=2.972、4.174,P<0.01),差异均有统计学意义。结论降低TRIM28表达能抑制肝癌细胞HepG2和HCCLM3的侵袭和迁移能力。     

乙肝病毒L颗粒作为肝癌靶向性基因治疗载体的研究

目的 评估乙肝病毒L蛋白颗粒作为一种新型肝癌靶向性基因治疗转运载体的可行性.方法 通过电穿孔方法(电压=400 V,脉冲时间=60 us,pGFP:L颗粒=4:10)将绿色荧光表达质粒pGFP导入乙肝病毒L颗粒,形成的L/pGFP颗粒转染各种肝来源细胞株以及非肝来源细胞株,以脂质体作为对照转染相同细胞株,荧光湿微镜检测各细胞株基因转运效率.结果 L/pG-FP颗粒对各种肝来源细胞株均保持较高的转染效率.对正常肝来源细胞L02的转染效率(67.0±2.6)%低于肝癌细胞株HepG2(75.0±3.5)%和7721(72.0±2.3)%,然而均显著高于脂质体的转染效率(P<0.05).非肝来源的乳腺癌细胞株MCF-7不能被L/pGFP颗粒有效转染.未接受电穿孔的L颗粒+pGFP混合液不能有效转染任何细胞株.结论 L颗粒能特异性、高效转运外源性基因至各种肝来源细胞,可作为一种安全高效的靶向性转运载体用于肝癌的基因治疗.     

制备人血白蛋白改良载紫杉醇纳米微泡及其特性的实验观察

目的探讨人血白蛋白（HSA）改良载紫杉醇纳米微泡的制备,并观察其性能表征。方法采用薄膜分散法及机械振荡法制备HSA改良的载紫杉醇微泡,观察其外观、形态,检测其粒径大小、分布、Zeta电位及包封率;行CEUS观察兔髂动脉的显影情况。结果HSA改良载紫杉醇纳米微泡外观为乳白色混悬液,光镜下其分布均匀,呈圆球状,平均粒径为（772．9土6．2）nm,表面电位（一13．2士0．3）mV,浓度为（8．64士1．38）×10。／ml;其包封率为（93．51±2．07）％,高于未加入HSA的载紫杉醇纳米微泡[（84．88士4．14）％,P＜0．05]。经外周静脉注射HSA改良载紫杉醇纳米微泡后,兔髂动脉超声增强显影。结论HSA改良载紫杉醇纳米微泡理化性质稳定,药物包封率高,可达到动脉增强显影效果。     

前列腺特异性抗原启动子中雄激素反应元件的克隆和表达

目的:利用前列腺特异性抗原(PSA)启动子的组织特异性表达的特点,克隆出DNA片段并对其表达效率和组织特异性表达进行初步研究。方法:从前列腺组织中提取染色体组,PCR扩增出PSA启动子的两个上游片段a(含ARⅠ和ARⅡ)和b(含ARⅢ),利用报告基因egfp,分别构建3个载体pa-EGFP、pba-EGFP和p△ba-EGFP,并转染细胞HepG2、SMMC-7721、Hela和PC-3,观察表达情况。结果:pba-EGFP在前列腺癌细胞PC-3中的绿色荧光强度明显高于pa-EGFP和p△ba-EGFP,说明片段b(含ARⅢ)能显著增强PSA启动子的转录能力。pa-EGFP、p△ba-EGFP和pba-EGFP转染HepG2、SMMC-7721和Hela细胞,未见表达。结论:基于PSA启动子的组织特异性和调节序列构建的靶向载体,在治疗中加上功能蛋白将为临床实验提供一个坚实的平台。