腺病毒介导的p16基因转染对膀胱癌细胞生长影响的研究

目的　探讨复制缺陷型腺病毒介导的 p16基因转染对人膀胱癌细胞生长的影响。 　方法　将 p16重组腺病毒 (Ad p16 )感染p16蛋白表达阴性的人膀胱移行细胞癌T2 4细胞株 ,Ad LacZ、X gal染色法检测重组腺病毒的转染效率 ;Westernblot法检测 p16蛋白的表达 ;MTT法及流式细胞术评估Ad p16对T2 4细胞增殖的影响。　结果　在感染复数 (MOI)为 5 0时 ,重组腺病毒对T2 4细胞的转染率达 97% ;此Ad p16在T2 4细胞中可获高效表达 ;与转染Ad LacZ组及未转染组相比 ,转染Ad p16组T2 4细胞生长受到明显抑制 (P <0 .0 5 ) ,细胞周期分析表明生长抑制主要发生在G1 S节点。　结论　腺病毒载体可有效地将外源 p16基因导入T2 4细胞 ;p16基因重组腺病毒载体转染能抑制T2 4细胞的生长。     

重组腺病毒介导CD自杀基因联合野生型p53基因对直肠癌细胞的杀伤作用

目的 观察重组腺病毒介导胞嘧啶氨酶（ＣＤ）基因和人野生型ｐ５３基因共转染对直肠癌细胞的杀伤作用。方法 用携带ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３基因腺病毒感染直肠癌细胞ＳＷ８３７,计数瘤细胞集落数,采用四唑蓝比色（ＭＴＴ法）检测瘤细胞存活率。于６０只裸鼠移植瘤内注射重组腺病毒、磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）,测定肿瘤生长抑制率。结果 用ＣＤ／ｐ５３、ＣＤ、ｐ５３重组腺病毒感染ＳＷ８３７细胞,加５－ＦＣ后细胞集落形成分别为：６、３８、６９。裸鼠移植肿瘤生长抑制率分别为７８．６％、５６．５％、２２．３％。ＣＤ／ｐ５３重组腺病毒感染组肿瘤细胞集落形成和存活率下降最显著（Ｐ〈０．０１）,对肿瘤的抑制作用明显。结论 ＣＤ自杀基因与野生型ｐ５３基因共转染对肿瘤细胞有更强的杀伤作用。     

p16基因转染对人胰腺癌细胞系生长抑制作用的研究

目的　探讨p16基因对人胰腺癌细胞系JF30 5的生长抑制作用。　方法　用脂质体介导法将外源野生型p16基因转染不表达p16的人胰腺癌细胞系JF30 5 ,对转染后细胞DNA、RNA和蛋白进行分析并观察其生物学特性变化。　结果　外源野生型p16基因已整合入细胞并获稳定表达 ,表达有外源p16基因的细胞生长速度及集落形成率均有部分抑制。细胞周期分析可见G1期增加 ,S期下降。电镜观察超微结构出现生长抑制特征。　结论　p16基因可作为胰腺癌基因治疗目的基因之一。     

外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组（P16转染组）：采用脂质体（Lipofectamine）为载体,将PcDNA3-P16表达质粒寻入Ec109细胞;空载体转染组：用PcDNA－3－neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组：未用PcDNA3－P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。     

反义增殖细胞核抗原联合p16基因转染抑制膀胱癌细胞生长的研究

目的 探讨膀胱癌联合基因治疗的新策略。方法 反义增殖细胞核抗原(PCNA)联合p16转染膀胱癌细胞，观测共转染1—7d后癌细胞增殖活性、DNA合成速率、细胞周期时相、克隆形成能力、细胞凋亡和PCNA、p16基因表达情况。结果 联合转染后癌细胞PCNA表达减弱，p16表达显著增强，增殖活性抑制15．45％—68．47％(P＜0．01)，DNA合成速率减慢65．77％(P＜0．01)，细胞周期阻滞于G0／G1期，克隆形成率抑制64．49％(P＜0．01)，凋亡率为22．00％(P＜0．01)。结论 反义PCNA与p16共转染具有抑制增殖、诱导凋亡的双重作用，有望成为膀胱癌联合基因治疗的新途径。     

p16基因对前列腺癌细胞的体外作用研究

目的：研究可控性表达的p16基因对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法：通过可诱导的真核表达载体pMDNA-3-p16将外源野生型p16基因转染至该基因表达功能丧失的人前列腺癌细胞PC3中,使用ZnSO4作为诱导物,观察p16基因的可控性表达及其对前列腺癌细胞生物学特性的影响。 结果：转染了野生型p16基因的人膀胱癌细胞PC3-pMDNA3-p16经ZnSO4诱导后,开放了p16基因的转录和翻译,p16蛋白得到高水平表达,细胞生长速度及集落形成率均有了部分抑制,细胞周期分析可见G1期增加,S期下降。结论：P16基因与前列腺癌的发生、发展有关,为用p16基因进行前列腺癌的基因治疗提供了实验依据。     

p16基因逆转录病毒载体的构建及其对人胃癌细胞生长的抑制作用

我们构建了ｐＬＮＣＸ ｐ16逆转录病毒载体 ,并将其转染至人未分化胃癌细胞 ,观察其对胃癌细胞生长的抑制作用。资料与方法1.一般资料 :白细胞采自正常人外周血 ,人未分化胃癌细胞株ＨＧＣ 2 7购自中科院上海细胞所 ,ＤＨ5α、逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ为本实验室保存 ,ＰＣＲ试剂盒、反转录ＰＣＲ扩增试剂盒、ＤＮＡ连接试剂盒和限制性内切酶购自宝生物工程(大连 )有限公司。ＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。2 .方法 :(1)野生型ｐ16基因逆转录病毒载体的构建及鉴定 :自正常人外周血…     

腺病毒介导凋亡素基因对人胆管癌细胞凋亡的研究

目的探讨凋亡素基因转染对人胆管癌细胞凋亡的影响,为胆管癌的治疗探索新方法。方法采用含凋亡素基因的重组腺病毒感染胆管癌细胞株QBC939,在确定其感染复数后通过光镜、荧光观察其凋亡情况,同时通过TUNEL染色统计凋亡率。结果胆管癌细胞株QBC939的重组腺病毒的感染复数为65,在感染后第3天凋亡素基因能引发胆管癌细胞株QBC939的凋亡,并且随着时间的推移其作用越明显,在第7天凋亡率达到61.9%。结论凋亡素能明显引发人胆管癌细胞的凋亡,在胆管癌的治疗上具有较大潜力。     

腺病毒介导多基因对肝癌细胞生长的影响

目的 研究腺病毒介导的多种基因在肝癌细胞中的表达和对肝癌细胞生长的影响。方法 构建含人ｐ５３、Ｂ７－１、ＧＭ－ＣＳＦ和ＩＬ－２ ４种目的基因的重组腺病毒载体,感染３种肝细胞癌细胞系和肝细胞系Ｌ０２,运用ＥＬＩＳＡ、免疫组化、流式细胞仪等方法,检测目的基因在肝癌细胞中的表达,和对肝癌细胞生长的抑制及诱导其凋亡的作用。结果 肝癌细胞对腺病毒高度易感,腺病毒多重感剂量为５０（５０ＭＯＩ时）,可使９０％左     

外源性p16基因导入对人膀胱癌细胞的作用

目的 通过外源性野生型Ｐ１６基因,纯翕生缺失及具有内源性Ｐ１６基因表达的膀胱癌细胞系２５３Ｊ和ＥＪ,地肿瘤细胞的生长抑制作用,并探讨共作用机制。方法 构建Ｐ１６逆转逆转录病毒表达载体,经细胞ＰＡ３４１７包装,膀胱癌细胞系;应用Ｎｏｒｔｈｅｍ杂交及免疫细胞化学方法检测外源１６基因的表达;流式我仪检测细胞周期;原位细胞凋亡检测及透射电镜观察细胞凋亡;并对导入的Ｐ１６基因的细胞进行鼠致瘤能力及病理不特性     

p53对胃癌细胞BGC823中Survivin基因表达的影响

目的 探讨p53基因对胃癌细胞株BGC823中Survivin基因表达的影响及其作用机制。方法 应用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot技术检测胃癌细胞株BGC823中Survivin和p53基因表达情况；利用质粒pcDNA3．0-rpS3转染该细胞株。应用实时聚合酶链反应（PCR）和Western blot检测细胞在培养后不同时间点Survivin mRNA和蛋白表达水平。结果 确认了胃癌细胞株BGC823中Survivin和突变型p53基因的表达。受野生型p53质粒转染的胃癌细胞在培养16和24h后，Survivin mRNA和蛋白质水平呈明显下降趋势。结论 野生型p53在转染胃癌细胞株BGC823后可显著抑制后者Survivin基因的转录和表达。     

携带小鼠白细胞介素-12基因的增殖型腺病毒对胃癌细胞的作用

目的观察携带小鼠白细胞介素12(mIL12)基因的增殖型腺病毒载体对胃癌细胞的杀伤作用及mIL12表达情况。方法以携带目的基因的增殖型腺病毒CNHK200mIL12感染人胃癌细胞株SGC7901、人正常肝细胞株L02。首先,通过荧光显微镜下观察、细胞杀伤实验等观察病毒对细胞的杀伤能力;其次,通过Westernblot分析及双抗体夹心法(ELISA)检测mIL12表达情况。结果CNHK200mIL12感染SGC7901后,当MOI=10时即可杀伤大部分的肿瘤细胞,与ONYX015相当,而对正常细胞无明显杀伤。ELISA检测表明mIL12基因表达量达(267.2±34.6)ng/5×105个细胞/48h,较复制缺陷型腺病毒载体高近百倍。结论CNHK200mIL12能在胃癌细胞中复制及增殖杀死胃癌细胞,并高水平表达目的基因。     

4-1BBL基因转染对小鼠体内胃癌细胞生长的影响

目的观察共刺激分子4-1BBL基因导入小鼠胃癌MFC细胞后在小鼠体内诱导的抗肿瘤效应以及对小鼠免疫状况的影响。方法用脂质体法把pMKITneo/4-1BBL和pMKITneo质粒导入615小鼠胃癌细胞MFC内,再用MFC、MFC/pMKITneo和MFC/4-1BBL细胞分别接种615小鼠,观察其成瘤情况,并测定肿瘤细胞的凋亡率及外周血的CD4~+、CD8~+T细胞和NK细胞的含量。结果4-1BBL基因转染后的胃癌MFC细胞在615小鼠体内成瘤所需的时间长、瘤体的重量轻；且MFC/4-IBBL组的癌细胞凋亡率(22．45±4．11)%明显高于MFC组(18．47±3．34)%及MFC/pMKITneo组(17．87±4．04)%(P＜0．05)；MFC、MFC/pMKITneo组小鼠外周血CD8~+T、NK细胞数明显低于正常对照组和MFC/4-1BBL组(P＜0．05),且MFC、MFC/pMKITneo两组间差异无统计学意义(P＞0．05)。结论4-1BBL基因导入胃癌MFC细胞后能够提高荷瘤机体的免疫能力、延缓肿瘤的发生、抑制肿瘤的发展、促进肿瘤细胞的凋亡。     

p16与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合基因疗法治疗小鼠肾癌的研究

目的 探讨瘤体内直接注射途径的Ｐ１６抑癌基因疗法与粒细胞－巨噬细胞落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）的基因疗法联合应用对小鼠肾癌（ｒｅｎｅａ）的治疗效果及其免疫学机理。方法 建立皮下荷瘤肾癌小鼠模型,干接种肿瘤细胞３天后将荷瘤小鼠随机分为５组,分别给予不同的治疗,检测每组小鼠的免疫功能,观察每组小 的存活期,并行肿瘤病理学分析。结果 Ａｄｐ１６＋ＡｄＧＭ－ＣＳＦ联合治疗组有２只长期存活（存活时间〉９０ｄ）     

重组腺病毒载体介导外源基因转移至痉挛脑血管的研究

目的　探讨蛛网膜下腔出血后腺病毒载体介导外源基因转移至痉挛颅内血管的可行性。方法　采用“枕大池 2次注血法”建立兔迟发性脑血管痉挛模型 ,在第 2次注血同时枕大池内注入 2 5 0 μl复制缺陷型重组腺病毒载体 (Ad5CMV5GFP) ,滴度为 2 .5× 10 9pfu/ml,2、4d后 (初次注血第 5天和 7天 )行荧光显微镜、免疫组织化学和RT PCR检测颅内血管和血管周围组织中外源基因GFP(绿色荧光蛋白 )的表达情况。结果　 2d时在基底动脉外膜可见GFP表达 ,4d时消失 ,而中膜和内膜未见GFP表达 ;2～ 4d时颅底软脑膜细胞、小血管外膜和平滑肌层可见GFP表达。结论　经脑池内注入重组腺病毒载体可以将外源基因转移至痉挛脑血管和软脑膜中 ,为迟发性脑血管痉挛的防治提供方法     

胃癌组织中细胞周期素G和p53的表达及意义

目的研究胃癌组织中细胞周期素G(cyclin G)和p53基因的表达以及它们与胃癌生物学特性可能存在的相关关系。方法应用免疫组织化学S-P法检测42例胃癌组织的cyclin G和p53蛋白表达情况。结果胃癌组织中的cyclin G和p53的阳性表达率分别为69.0%和28.6%,二者呈低相关性,cyclin G的表达与肿瘤分期、淋巴结转移有关。结论cyclin G和p53可能是胃癌相对独立的始动因素,并互相促进参与胃癌的发生和发展。     

吗啡对胃癌细胞生物学性状的影响

目的 观察吗啡对人胃癌MGC-803细胞生物学性状的影响.方法 将吗啡加入细胞培养液中使吗啡浓度分别稀释至0.1、10、1000 μmol/L,分别与胃癌MGC-803细胞一同孵育,应用噻唑蓝(MTT)比色法绘制12、24、36、48、60、72h的细胞生长曲线并计算细胞增殖率,7d后应用克隆形成实验检测MGC-803细胞生长增殖的变化;应用流式细胞仪检测MGC-803细胞周期和细胞凋亡的变化,用透射电子显微镜观察MGC-803细胞超微结构的变化.结果 吗啡使胃癌细胞生长缓慢,0.1 μmol/L吗啡组、10 μmol/L吗啡组、1000 μmol/L吗啡组细胞增殖率分别为对照组的(81.89±6.44)%、(78.52±4.68)%和(78.53±5.68)%(P＜0.05),3组细胞的克隆形成率分别为(0.76±0.18)%、(0.72±0.17)%和(0.56±0.18)%,低于对照组的克隆形成率(1.19±0.29)%(P＜0.05);与对照组比较,各吗啡组细胞周期G2/M期比例上升,G0/G1期和S期比例下降(P＜0.05);0.1μmol/L吗啡组、10 μmol/L吗啡组、1000 μmol/L吗啡组细胞凋亡率分别为(17.20±2.95)%、(19.13±3.86)%、(24.38 ±4.94)%,明显高于对照组的凋亡率(11.40±2.86)%(P＜0.05);透射电镜显示吗啡使胃癌细胞出现明显的凋亡表现.结论 吗啡抑制胃癌MGC-803细胞的生长增殖,促进胃癌细胞的凋亡.     

RNA干扰E2F-1表达对胃癌MGC803细胞生物学行为的影响及其机制

目的 利用基因表达谱芯片技术探讨E2F-1小分子干扰RNA(E2F-1-siRNA)影响胃癌细胞MGC803生物学行为的分子机制.方法 分别抽取E2F-1-siRNA转染组和对照组(negative control-siRNA)的细胞总RNA,分离纯化mRNA并逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记cDNA探针,与含有21522条人类22k基因表达潜芯片进行杂交.采用LuxScan 10K/A双通道激光扫描仪扫描芯片上两种信号,应用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行处理和分析.结果 在21522条基因中,两组胃癌细胞间差异性表达基因为18条,其中上调基因8条,下调基因10条,下调的基因中有1条功能信息不明.结论 体外干扰E2F-1基因表达后,胃癌MGC803细胞生物学行为的变化是多基因相互作用、多种信号通路相互调节的结果,其中的关键基因和信号传导通路值得进一步研究.