sea基因定位突变体构建及其重组表达产物生物学活性的研究

目的 构建葡萄球菌肠毒素A（SEA）基因及其突变体原核表达系统，了解突变前后重组表达产物的细胞毒性、促淋巴细胞增殖和抑制肿瘤生长活性的变化。方法采用高保真PCR和TA克隆法，从金黄葡萄球菌ATCC13565株DNA中扩增并克隆了不含信号肽序列的湖基因。采用突变引物PCR构建sea基因定位突变体。建立sea基因及其定位突变体原核表达系统。Ni—NTA亲和层析法提纯表达的目的重组蛋白。采用TCID50。法测定目的重组蛋白对Vero细胞的细胞毒性。采用MTT比色法分别检测不同浓度的目的重组蛋白促小鼠脾细胞增殖及对抑制KB和HL-60癌细胞株生长的作用。结果 所克隆的sea基因核苷酸序列与报道序列的相似性为100％，7种突变体均在既定位置获得预期的密码子突变。rSEA和各突变体重组蛋白表达量约为细菌总蛋白的52％。rSEA对Vero细胞TCID50为4．1μg，其突变体重组蛋白分别为5．8～23．5μg。1和5μg/ml的rSEA及其5种突变体重组蛋白rSEA／H187A、rSEA／H225A、rSEA／D227A、rSEA／H187A／D227A和rSEA／H225A／D227A对小鼠脾细胞均有明显的促增殖作用（P〈0．05），10和20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白促小鼠脾细胞增殖活性与100μg/ml PHA相似（P〉0．05）。5～20μg/ml的rSEA及上述5种突变体重组蛋白作用的小鼠脾细胞上清及其上清与脾细胞混合物均能有效地抑制KB和HL-60细胞生长（P〈0．05）。结论 本研究成功地构建了sea基因突变体及其高效原核表达系统，其表达产物的细胞毒性均有所降低。由于rSEA／H225A、rSEA／D227A、rSEA／H225A／D227A细胞毒性较低、促脾细胞增殖和抑制肿瘤细胞生长活性较强，可作为研制升白细胞、抗肿瘤SEA相关药物的候选突变体。     

人截短型凋亡诱导因子的表达对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF基因的表达对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：用RT-PCR法分段克隆全长人AIF基因，经改造截去其N-端线粒体定位信号及部分Spacer区域（1-120位氨基酸）的编码序列，从而获得人截短型AIF（AIF△1-120）基因。将其克隆入pIRES2-EGFP绿色荧光蛋白（EGFP）共表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过荧光显微镜观察。免疫组织化学检测，间接免疫荧光检测，电镜观察等方法。检测目的基因在转染细胞中的表达，以及对转染细胞的形态及生长状况的影响。结果：成功地构建了人截短型AIF（AIF△1-120)基因的真核表达载体。转染HeLa细胞后，可检测到人截短型AIF分子的表达，随着转染后时间的延长，可观察到表达人截短型AIF分子的HeLa细胞呈现典型的凋亡特征。结论：人截短型AIF基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

截短型人凋亡诱导因子AIF△1-400对HeLa细胞的促凋亡作用

目的：观察人截短型AIF（AIF△l-400）对HeLa细胞的促凋亡作用。方法：在AIF△l-120基因克隆成功的基础上进一步改造，构建截去AIF基因线粒体定位信号、FAD结合结构域和NADH结合结构域（1～400位氨基酸）编码序列的AIF△l-400基因，将其克隆人pcDNA3真核表达载体，用脂质体法转染HeLa细胞，通过Western blot检测该基因在转染细胞中的表达通过电镜观察截短型分子对肿瘤细胞的具有促凋亡活性。结果：经酶切鉴定与测序证实，AIFAl-400的真核表达载体构建成功。通过Western blot证实截短型基因在HeLa细胞中表达，电镜观察可见转染细胞骨架的破坏和细胞核固缩等凋亡特征。结论：人截短型AIF（AIF△l-400）基因的表达可诱导HeLa细胞凋亡。     

P3启动子调控融合基因质粒构建及在肝癌细胞中表达(英文)

目的：构建人胰岛素样生长因子Ⅱ基因（IGF-Ⅱ）P3启动子驱动单纯疱疹病毒胸苷激酶（tk）与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合基因穿梭质粒，观察其在肝癌细胞系HepG2及宫颈癌细胞系HeLa细胞中的表达及其作用。方法：应用基因重组技术，构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动EGFP与tk融合表达穿梭质粒载体，脂质体转染技术将其转入HepG2及HeLa中，48 h后荧光显微镜下观察荧光表达,RT-PCR法检测tk和EGFP mRNA表达，四甲基偶氮唑蓝（MTT）实验检测转染融合蛋白载体后给予不同浓度的GCV对HepG2及HeLa细胞毒作用。结果:酶切鉴定和测序分析证实重组质粒构建成功；转染此穿梭质粒的细胞中仅有HepG2细胞检测到绿色荧光；RT-PCR检测到tk和EGFP的mRNA仅在HepG2细胞中表达；GCV对转染了携此质粒载体的HepG2细胞有选择性细胞毒作用。结论:成功构建IGF-Ⅱ P3启动子驱动携带tk与EGFP融合基因穿梭质粒载体，转染后对人肝癌细胞系HepG2有选择性杀伤作用，为进一步靶向性肝癌腺病毒基因治疗奠定了基础。     

牛蒡子苷诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的实验研究

目的：通过牛蒡子苷对肿瘤细胞的体外实验，探讨牛蒡子苷是否对人肝癌细胞（HepG2）具有生长抑制及诱导凋亡作用。方法：HepG2细胞培养液中加入不同浓度的牛蒡子苷，培养72 h，观查HepG2细胞的增殖率；倒置显微镜及投射电子显微镜观察HepG2细胞的形态变化；流式细胞仪（FCM）检测HepG2细胞周期及凋亡率；TUNEL法检测HepG2细胞凋亡率；免疫细胞化学检测HepG2细胞的增殖凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)表达。结果： 牛蒡子苷抑制HepG2细胞生长；阻滞HepG2细胞周期于G0/G1期并诱导细胞凋亡(P＜0.05)；通过下调Bcl-2蛋白表达（P＜0.01），上调Bax蛋白表达（P＜0.05）诱导HepG2细胞凋亡。结论： 牛蒡子苷对体外培养的HepG2细胞生长有抑制作用,其作用机制之一是通过诱导细胞凋亡。     

重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响

目的 克隆人caspase-8催化结构域基因片段，并将其改建成2种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因，转染HeLa细胞，观察重构型人caspase-8基因的表达及其对HeLa细胞生长的影响。方法 用RT－PCR法，克隆人caspase-8催化结构域基因片段，经重组PCR改造，构建大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase-8基因。将其克隆入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pIRES2-EGFP，转染HeLa细胞，用荧光显微镜和倒置显微镜镜观察细胞的形态和结构。结果 用RT－PCR法，成功地克隆了人caspase-8催化结构域基因片段，构建了3种重构型人caspase-8基因及其真核表达载体。转染HeLa细胞后，重构型人caspase-8基因的表达可导致HeLa细胞死亡。结论 重构型人caspase-8基因在HeLa细胞中的表达可以有效地引起HeLa细胞死亡。     

人Epsilon干扰素在CHO细胞中的表达及生物学活性的研究

目的 为了研究新发现的人epsilon干扰素（hIFN-ε）的生物学活性，我们通过RT-PCR克隆了hIFN-ε基因，并构建pcDNA3．1／myc-his（-）A-hIFN-ε（以下简称pcDNA3-1A-hIFN-ε）的真核表达载体，在CHO细胞中表达，并研究真核细胞重组表达的rhIFN-ε的生物学活性。方法 用TNF-α刺激人宫颈癌HeLa细胞，抽提总RNA，经RT-PCR获得全长cDNA，与pcDNA3．1／myc-his（-）A真核表达载体连接，构建重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε并在CHO细胞中进行表达，采用微量细胞病变抑制试验研究表达产物中的rhIFN-ε对多种病毒的抗病毒活性；MTT法检测其对A375、HeLa和A549细胞的生长影响，并通过在Wish、HeLa、A375细胞中诱导MxA抗病毒蛋白的产生研究hIFN-ε的抗病毒机制。结果 经PCR和限制性酶切鉴定以及DNA测序，结果表明已经成功构建了重组体pcDNA3．1A-hIFN-ε，并在CHO细胞中稳定表达了rhIFN-ε蛋白，该蛋白具有抗HSV-I、PolioV、Ad3和VSV病毒的作用，能够抑制HeLa、A375、A549细胞的生长，刺激Wish、HeLa、A375细胞产生MxA蛋白。结论 本研究成功地构建了pcDNA3．1A-hIFN-ε真核表达载体并在CHO细胞中获得稳定表达，证明了ddFN．￡蛋白具有抗病毒和抗增殖活性，其抗病毒效应的分子机理可能与诱导细胞产生MxA抗病毒蛋白有关，为今后研究rhIFN-ε的生物学功能和基因重组药物研制及其开展基因治疗奠定了基础。     

靶向腺病毒载体介导的EGFP基因在甲胎蛋白阳性肝癌细胞的特异表达

目的：建立一种在甲胎蛋白(AFP)阳性的肝癌细胞中靶向表达目的基因的重组腺病毒载体。方法： 基于腺病毒载体Adeno-XTM Expression system,以300 bp AFP特异启动子替换穿梭质粒Pshuttle中CMV启动子，将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因亚克隆至Pshuttle，HEK293细胞包装腺病毒，收集病毒后分别转染人正常肝脏LO2细胞，人肝癌HepG2细胞及HeLa细胞；通过Northern杂交检测EGFP基因在3种细胞中的转录水平，荧光显微镜下观察3种细胞中绿色荧光蛋白的表达。结果：Northern杂交显示，HepG2细胞中有大量EGFP基因的转录，而正常肝细胞LO2和HeLa细胞中仅能检测到微量基因的转录；荧光显微镜检测发现HepG2细胞内有强绿色荧光表达，而在LO2以及HeLa细胞内见极弱绿色荧光。 结论： 在AFP特异启动子作用下，腺病毒携带的目的基因在AFP阳性的肝癌细胞中得到显著转录和表达，而在非AFP阳性细胞仅微量转录，蛋白表达极弱。该腺病毒载体可作为AFP阳性的肝癌基因靶向治疗的适宜载体。     

靶向XBP1S的RNA干扰质粒对细胞增殖的影响

目的 构建靶向人XBP1S的siRNA真核表达载体(pSUPER-XBP1S)并观察其对人HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.方法 设计并合成针对XBP1S基因的siRNA,退火成互补双链后克隆至真核表达载体pSUPER构建重组质粒,并将其转染入HeLa细胞和HepG2细胞中.采用RT-PCR检测转染前后XBP1S在HeLa细胞和HepG2细胞中的转录,Western印迹检测转染前后XBP1S蛋白的表达;MTT法、细胞计数检测重组质粒对HeLa细胞和HepG2细胞增殖能力的影响.结果 重组质粒能有效地抑制HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S基因的转录和表达;转染HeLa细胞和HepG2细胞后,细胞增殖抑制率及细胞增殖数与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建了靶向人XBP1S的siRNA表达载体pSUPER-XBP1S,并且有效的抑制了HeLa细胞和HepG2细胞中XBP1S的转录和表达,有效抑制了细胞的增殖能力.     

喜树碱诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡及其机制

目的 测定不同浓度的喜树碱（CPT）对宫颈癌HeLa细胞促凋亡作用的影响,并探讨其促凋亡的机制。方法 人宫颈癌细胞系HeLa细胞,加入不同浓度的CPT（100 nmol/L~10 μmol/L）,继续培养24 h。MTT方法检测细胞增殖,并通过倒置显微镜观察细胞形态学变化,细胞核染色法检测细胞凋亡,流式细胞仪检测细胞早期凋亡率。Western blotting法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleave-Caspase-3、细胞色素C（Cyt-C）,聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）的表达。结果 MTT实验及细胞形态学结果显示,CPT对HeLa细胞的生长有明显抑制作用,并可导致细胞形态改变,且具有剂量依赖性,其IC₅₀为2.45 μmol/L;细胞凋亡检测表明,不同浓度的CPT可导致凋亡小体出现,并可使早期凋亡比例增加。Western blotting法检测结果显示,不同浓度CPT可使HeLa细胞Bcl-2蛋白表达降低,而Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表达,胞质Cyt-C,89 kD 5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）蛋白表达增加且呈剂量依赖性。结论 CPT可以诱导HeLa细胞凋亡,其作用机制可能为激活线粒体依赖途径,并活化作用底物PARP而实现。     

重组人CRP的表达纯化及其内化进入HeLa细胞的观察

目的： 构建人C-反应蛋白(CRP)原核表达载体，表达纯化his-EGFP-CRP蛋白，观察其能否内化进入HeLa肿瘤细胞。方法: 利用特异性引物，从p91023/CRP载体上将编码人CRP 的基因序列亚克隆到原核表达载体pET14b/MCS-EGFP-(N)36上；对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定，并将其转化到大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，表达的重组蛋白通过亲和色谱纯化，梯度透析复性，并与HeLa细胞孵育，利用荧光显微镜观察其内化入胞。结果: PCR、双酶切和测序鉴定表明，pET14b/EGFP-hCRP原核表达质粒构建正确；转化实验发现，该质粒在BL21(DE3)中能够被大量诱导表达；蛋白纯化及荧光显微镜观察结果表明，复性后的表达产物可结合于HeLa细胞膜，孵育一定时间后，可定位于胞质及胞核。结论: 成功地构建了带增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标签的人CRP原核表达载体，该载体能够在大肠杆菌BL21(DE3)中被诱导表达重组蛋白his-EGFP-CRP，纯化复性后的重组人CRP能与HeLa肿瘤细胞结合，并能内化入胞，移位入核。     

Nodosin对HepG2细胞株的增殖抑制作用及对Bcl-2和Bax表达的影响

 目的:研究传统中药提取物nodosin对体外培养的人肝癌细胞株HepG2的增殖抑制作用,并探讨其对Bcl-2和Bax表达的影响。方法:将不同浓度组（1.25、2.5、5、10和20 μmol/L）nodosin预作用于HepG2细胞24 h,用倒置显微镜观察nodosin对细胞形态学的影响,采用MTT法检测细胞生长抑制率,用流式细胞术检测细胞凋亡率和Bcl-2、Bax的表达。结果:形态学结果显示,随着nodosin剂量的增加,细胞皱缩和漂浮细胞数量增加,流式细胞术检测结果显示随着nodosin药物浓度的增加,HepG2细胞凋亡率增加。Bax的表达随着nodosin剂量的增加逐渐增加, Bcl-2的表达逐渐减少。结论: Nodosin能抑制HepG2细胞株的增殖,呈明显的剂量依赖性,对HepG2细胞的抑制作用是通过增加Bax的表达以及降低Bcl-2的表达诱导细胞凋亡实现的。     

逆转录病毒介导IL-18基因在大鼠胶质瘤细胞C6中的表达

目的 :建立表达IL 18基因的大鼠胶质瘤细胞C6 /IL 18,并探讨外源性IL 18基因对C6细胞生长的影响。方法 :应用逆转录病毒载体 ,将IL 18基因导入C6细胞。经G4 18筛选后 ,获得表达IL 18分子的细胞克隆C6 /IL 18。用RT PCR法检测目的基因mRNA的表达 ;用流式细胞和免疫细胞化学染色法检测目的蛋白的表达。用ELISA法检测C6 /IL 18细胞培养上清诱导脾细胞分泌IFN γ的能力 ,以确定IL 18的生物学活性。用MTT比色法检测细胞体外增殖的状况 ,用流式细胞技术检测细胞的增殖活性 ,并建立大鼠胶质瘤模型 ,观察C6 /IL 18细胞体内致瘤性的改变。结果 :外源IL 18基因于mRNA水平和蛋白水平可获得稳定表达 ,并可诱生大鼠脾细胞分泌IFN γ。同时 ,该细胞系的体外增殖率及体内致瘤性 ,均较亲代C6胶质瘤细胞明显下降。结论 :外源性IL 18基因能部分地抑制C6细胞的体外增殖率和体内致瘤性。建立了可进一步用于相关肿瘤基因免疫和基因治疗研究的大鼠胶质瘤细胞系C6 /IL 18。     

金黄葡萄球菌肠毒素A诱导的免疫应答

目的 研究超抗原金黄葡萄球菌A型肠毒素(SEA)在体内诱导的体液免疫反应、T淋巴细胞增殖及免疫无应答的规律和作用.方法 利用重组SEA蛋白免疫小鼠,酶联免疫吸咐试验(ELISA)检测特异性抗体及其亚类水平,观察两者的产生过程及变化规律.RT-PCR反应检测免疫后小鼠脾脏内细胞因子的mRNA表达水平,EUSPOT法检测rSEA对脾细胞分泌IFN-γ能力的影响,流式细胞术检测T淋巴细胞表面抑制性受体PD-1的表达.结果 BALB/c小鼠在低剂量的rSEA初次免疫后2周,即产生了高水平的特异性抗体,此时体内以体液免疫应答为主,IgG2a/IgG1＜1;而在免疫早期,Th1型细胞因子的mRNA表达水平高于Th2型,以细胞免疫应答为主.短时期内进行再次免疫后脾细胞的IFN-γ分泌频率显著下降;流式细胞仪在rSEA激活的T淋巴细胞表面检测到了PD-1(programmed death-1)分子的表达,其表达量随时间及免疫次数增加.结论 超抗原SEA初次免疫即能引起强大的体液免疫应答与细胞免疫应答;再次免疫引起了免疫无应答,这与PD-1介导的抑制作用增强有关.     

超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定

目的：构建pRSET-SEA重组表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxin A，SEA)，进行分离、纯化及western bolt鉴定。方法：采用PCR技术，从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI100基因组DNA中获得SEA全长序列，克隆人pUC19中，进行测序，构建pRSET-SEA表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，通过异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG）诱导表达，分离、纯化及western blot鉴定。结果：PCR获得超抗原SEA基因片段，DNA测序结果与文献报道一致；构建了pRSET-SEA表达质粒，并成功地诱导表达出32000u的蛋白；Western blot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论：本研究成功地克隆了SEA全长，并进行了原核表达和分离、纯化，获得了SEA蛋白。     

超抗原SEA活化淋巴细胞抗肿瘤活性的实验研究

纯化SEA在 10 -12 ～ 10 -5g/ml浓度范围对体外培养的BALB/c鼠脾细胞表现了细胞增殖诱导能力 ,并呈剂量依赖关系 ,其中 10 -7～ 10 -5g/mlSEA的作用强于最适量 ( 2 5 μg/ml)PHA。在E/T为 5∶1～ 2 0∶1条件下 ,10 -5g/mlSEA活化 48h的BALB/c鼠脾细胞对YAC 1细胞的杀伤活性高于NK细胞 ,但SEA未能增强BALB/c鼠脾细胞对B16细胞的杀伤活性。 5 μg和5 0 μgSEA体内用药对L615白血病无治疗作用 ,但转输经SEA活化的同系小鼠脾细胞对L615白血病有一定疗效。实验结果提示 ,SEA活化淋巴细胞对NK敏感的淋巴瘤、白血病有杀伤及治疗作用 ,这种作用依赖于较大数量级SEA活化淋巴细胞的存在 ,并且与SEA活化T细胞分泌的细胞因子有关     

索拉非尼对敏感人肝癌细胞株MAPK信号通路基因表达的影响

 目的：筛选对索拉非尼敏感的人肝癌细胞株,检测索拉非尼作用于敏感细胞株后MAPK信号通路基因表达谱的变化。方法：索拉非尼作用于人肝癌细胞株Huh7、 MHCC97H、 HepG2 、SMCC7721、 HepG2.2.15和PLC,流式细胞术检测肝癌细胞凋亡,CCK-8测定细胞增殖的抑制率,筛选敏感肝癌细胞株;采用实时定量PCR基因芯片,观察索拉非尼作用于敏感细胞株前后MAPK信号通路基因的表达。结果：索拉非尼作用后,流式细胞术的结果显示,凋亡较明显的细胞株为PLC和HepG2.2.15,相对不明显的细胞株为SMCC7721和MHCC97H;CCK-8测定索拉非尼对PLC、HepG2.2.15、Huh7、HepG2、MHCC97H和SMCC7721细胞的IC50值分别为5.25 μmol/L、5.30 μmol/L、6.80 μmol/L、7.01 μmol/L、11.7 μmol/L和15.0 μmol/L。对索拉非尼相对敏感细胞株和不敏感细胞株分别为PLC和SMCC7721。索拉非尼作用敏感细胞株PLC后,MAPK信号通路表达 >2.0倍的有2个,≤0.5倍的有6个。结论：PLC为对索拉非尼相对敏感的人肝癌细胞株;索拉非尼主要导致MAPK信号通路中与调控细胞周期和活化转录因子相关的基因表达发生变化。     

rhTGF-β1及转染TGF-β1基因对兔角膜内皮细胞增殖的影响

目的： 探讨不同浓度的重组人转化生长因子-β₁(rhTGF-β₁)及TGF-β₁基因转染对体外培养兔角膜内皮细胞增殖的影响。方法: 用MTT法检测不同浓度rhTGF-β₁作用下角膜内皮细胞的增殖。用脂质体介导转染方法，将TGF-β₁基因转移入培养的兔角膜内皮细胞，HE染色法观察细胞组织形态学变化；ELISA法检测转染细胞培养上清中TGF-β₁表达量；流式细胞仪检测细胞生长周期变化；DNA电泳法检测转染细胞凋亡情况。结果: MTT检测示5-20 μg/L rhTGF-β1抑制角膜内皮细胞增殖；0.5-1 μg/L组对增殖无影响；0.05~0.1 μg/L组促进细胞增殖。TGF-β₁基因转染细胞形态无明显异常，细胞培养上清中TGF-β₁的浓度约为(98±3)ng/L。流式细胞仪检测示，基因转染组S期和G₂/M期细胞比例减少、PI值降低，但加入EGF后细胞生长基本正常。DNA电泳检测示基因转染组未见凋亡带。结论: rhTGF-β₁对角膜内皮细胞增殖的影响具有剂量依赖性；TGF-β₁基因转染影响角膜内皮细胞增殖、但不诱发凋亡，其抑制作用可被外源性EGF拮抗。