SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体在SARS尸检组织中的表达

目的 观察SARS死者的尸检组织中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的存在与分布情况。方法 应用免疫组化技术检测4例尸检标本肺、脾脏、淋巴结、脑、垂体、心、肝、肾、胰腺、气管、食道、胃肠道和骨髓等组织的SARS-CoVN蛋白。结果 肺泡上皮、肺、脾、淋巴结内浸润的单核细胞／巨噬细胞、脑神经元、肝细胞、肾远曲小管上皮细胞、胰腺腺泡细胞、垂体嗜酸细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、肾上腺皮质细胞、气管及支气管浆液腺上皮细胞、食道粘膜鳞状上皮、胃肠道柱状上皮细胞及胃壁细胞、骨髓早幼粒细胞及小静脉内皮细胞等细胞质内SARS-CoVN蛋白单克隆抗体均为阳性。结论 SARS-CoV可侵犯全身多种器官和组织。SARS-CoVN蛋白单克隆抗体在胃肠道、肾远曲小管及汗腺细胞内的阳性表达，对研究SARS—CoV传播途径具有重要意义。     

重组SARS冠状病毒N蛋白纯化与鉴定

目的分析重组SARS-CoVN蛋白的表达,并予以纯化。方法SDS-PAGE分析N蛋白的表达,于自动蛋白层析系统上,用His·BindTM柱亲和层析纯化。结果重组表达的N蛋白存在于裂解细菌上清中,分子量大小约49000u,N蛋白经亲和层析获得纯化,纯化蛋白能与病人血清反应。结论表明自动层析获得了纯化良好抗原性的N蛋白。     

SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的 原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法 用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E．coli BL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果 实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论 用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。     

SARS冠状病毒N蛋白在酵母中的表达纯化及抗原性分析

目的研究人SARS冠状病毒核壳N蛋白在Pichia pastoris酵母中的表达,获得具有生物学活性的重组N蛋白,并鉴定表达蛋白的抗原性,为下一步的研究奠定基础.方法合成引物扩增SARS冠状病毒N基因,插入含AOX1启动子的Pichiapastoris酵母表达载体中,转化酵母宿主菌KM71H、X-33、GS115,筛选阳性转化子,摇瓶培养,用甲醇诱导表达.表达产物经镍离子柱亲和层析纯化后,以抗SARS冠状病毒N蛋白的小鼠单抗、兔多抗及SRAS病人阳性血清鉴定其抗原性.结果SDS-PAGE和免疫学分析显示,酵母转化子仅在KM71H、X-33中有Mr约70 000的诱导蛋白,表达产物具有良好的抗原性和特异性.结论在酵母表达系统中,初步实现了SARS冠状病毒核壳N蛋白的有效表达.     

SARS冠状病毒PUMC_2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E.coliBL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。     

免疫荧光法检测非典型肺炎患者血清抗冠状病毒抗体

目的：检测非典型肺炎患者血清中抗冠状病毒抗体及其滴度变化，协助临床确诊非典型肺炎。方法：间接免疫荧光法检测患者体内急性期和恢复期血清中的抗冠状病毒抗体。结果：3例临床诊断非典型肺炎患者血清内有特异性抗冠状病毒抗体，且恢复期抗体滴度比急性期的滴度增高4倍以上。结论：用具有高度特异性的免疫荧光技术对怀疑感染非典型肺炎的患者进行血清学检测，可协助临床确定诊断。     

SARS冠状病毒N基因的扩增与克隆

目的 RT—PCR扩增、克隆SARS冠状病毒N蛋白基因。方法 根据GenBank数据库中TOR2株的全基因组序列，利用Primer Premier5．0软件设计引物RT-PCR巢式扩增SARS冠状病毒的N基因，PCR产物克隆后进行测序鉴定。结果 序列分析表明。pMD18-T载体中已成功重组了N基因。结论 N蛋白基因的扩增、克隆成功，为N蛋白的表达、N蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法,制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠,然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性,用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体,ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇,且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。     

SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体在SARS尸检组织中的表达

目的观察SARS死者的尸检组织中SARS冠状病毒(SARS-CoV)的存在与分布情况。方法应用免疫组化技术检测4例尸检标本肺、脾脏、淋巴结、脑、垂体、心、肝、肾、胰腺、气管、食道、胃肠道和骨髓等组织的SARS-CoV N蛋白。结果肺泡上皮、肺、脾、淋巴结内浸润的单核细胞/巨噬细胞、脑神经元、肝细胞、肾远曲小管上皮细胞、胰腺腺泡细胞、垂体嗜酸细胞、甲状旁腺嗜酸性细胞、肾上腺皮质细胞、气管及支气管浆液腺上皮细胞、食道粘膜鳞状上皮、胃肠道柱状上皮细胞及胃壁细胞、骨髓早幼粒细胞及小静脉内皮细胞等细胞质内SARS-CoV N蛋白单克隆抗体均为阳性。结论SARS-CoV可侵犯全身多种器官和组织。SARS-CoV N蛋白单克隆抗体在胃肠道、肾远曲小管及汗腺细胞内的阳性表达,对研究SARS-CoV传播途径具有重要意义。     

BAC-TO-BAC昆虫/杆状病毒系统在真核表达人N端脂多糖结合蛋白的研究中的应用

昆虫细胞表达体系自成功表达人β-干扰素以来,已成为制备基因工程产品的优选体系.我们选用该系统成功构建N端脂多糖结合蛋白(tLBP)基因杆状病毒载体并进行重组蛋白的表达,现就该系统在实验研究中的应用及体会报告如下.     

惠州市少年儿童SARS冠状病毒抗体调查分析

目的　分析惠州市少年儿童人群SARS CoV抗体水平情况。　方法　抽取惠州市学生、学龄前儿童血清标本共 10 2 8人份 ,采用酶联免疫方法进行SARS病毒IgG抗体检测。　结果　 10 2 8份样本 ,SARS病毒IgG抗体阳性率为 2 40 % (2 5 /10 2 8)。学龄前儿童 (0～ 6岁 )阳性率为 4 0 0 % (2 0 /5 0 1) ,其中男童阳性率为 4 0 1% (9/2 74) ,女童为3 96% (9/2 2 7) ,男、女童之间差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;学生儿童 (7～ 14岁 )的阳性率为 0 95 % (5 /5 2 7) ,其中男生阳性率为 1 3 5 % (4 /2 96) ,女生为 0 43 % (1/2 3 1) ,男生和女生差异无显著性 (P >0 0 5 ) ,而学龄前组儿童抗体阳性率明显高于学生组 (P <0 0 5 )　结论　通过对少年儿童人群SARS CoV抗体水平的监测 ,可预防SARS的流行趋势 ,及早作好预防措施     

抗中性粒细胞胞质抗体两种检测方法学的比较分析

目的比较分析间接免疫荧光法(IIF)和免疫印迹法检测抗中性粒细胞胞质抗体(ANCA)结果的一致性。方法回顾性分析133例ANCA相关性疾病同时使用IIF和免疫印迹法检测ANCA的结果,统计分析2种方法结果的一致性。结果①2种方法联合检测出31例ANCA阳性结果,94例ANCA阴性结果,阳性一致性为86.1%,阴性一致性为96.9%,结果一致性较好(Kappa值=0.845);②存在3例类风湿关节炎(RA)患者IIF阴性蛋白印迹法阳性的结果;5例系统性红斑狼疮(SLE)患者IIF阳性蛋白印迹法阴性的结果。结论对于SLE和RA疾病患者,IIF和蛋白印迹法单独检测均有漏检,而两种方法联合检测则有利于减少漏诊率。     

儿科患者与医务人员血清冠状病毒(变异株)抗体检测

目的本次严重急性呼吸综合征(SARS)流行中,儿童发病率低、症状轻,推测儿童可能存在保护性抗体.对儿科非SARS患者及医务人员进行血清冠状病毒(变异株)抗体检测,试剂盒为北京华大吉比爱生物技术有限公司冠状病毒(变异株)IgG抗体检测试剂盒(国药试字2003004批号20030501).方法用酶联免疫吸附法(ELISA),检测2001及2003年的168例非SARS患儿的血清标本,及与这些患儿有密切接触的171份医务人员血清标本,以86份成人非感染非医务人员血清标本做对照.结果非SARS患儿2001年77份血清标本阳性32例(41.56%),2003年91份阳性36例(39.56 %),医务人员抗体阳性2例(1.17%),成人对照为0%.儿童冠状病毒(变异株)抗体阳性率有随年龄增长逐渐下降的趋势.抗体滴度中位数在2003年患儿(0.200)、2001年患儿(0.170)、医务人员(0.019)及非感染成人(0.054)间存在极显著性差异.结论在非SARS患儿中冠状病毒(变异株)抗体阳性率高达40%,显著高于成人,与其密切接触的医务人员抗体阳性的检出率与对照组无明显差异,抗体滴度无升高.     

SARS病房工作的医护人员血清中特异抗体测定分析

目的检测密切接触SARS患者的医护人员血清中SARS病毒IgM及IgG抗体的水平,对SARS病毒有无隐性感染作初步调查.方法分别用酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay,ⅡFA)检测200例正常人,200例在SARS病房工作1个月的医护人员血清中SARS病毒IgM及IgG抗体的水平.结果正常人及医护人员血清中未检测到SARS病毒IgM及IgG抗体.结论不同于普通的流行性传染性疾病,SARS病毒可能不具有隐性感染性.     

严重急性呼吸综合征病毒基因检测和特异性抗体检测的诊断意义分析

目的探讨严重急性呼吸综合征病毒基因检测和特异性抗体检测的诊断意义和价值。方法采用巢式反转录PCR和ELISA法分别检测健康人、普通发热患者、SARS密切接触医务人员及不同时期SARS患者痰标本中SARS病毒核酸和血清标本中特异性抗体IgG和IgM。结果SARS患者住院1～58d期间,采用巢式RT-PCR检测痰SARS病毒基因,52例患者中33例阳性,阳性率63.5%;而采用间接ELISA检测血清抗SARS病毒抗体,52例患者中30例阳性,阳性率为57.7%。2种方法均阳性的有15例,均阴性的有6例。2种病原学诊断方法检测20例正常人、15例发热非SARS患者和20例SARS密切接触医务人员,结果均为阴性。住院1～13d组(92.9%)巢式RT-PCR基因阳性率明显高于ELISA特异性抗体阳性率(7.1%);住院37～58d组巢式RT-PCR基因阳性率(47.4%)则明显低于ELISA特异性抗体阳性率(94.7%)(P<0.01)。结论痰中SARS病毒基因检测可用于SARS的早期诊断,这对于提前确诊和治疗SARS患者,尽早排除疑似病例具有非常关键和现实的意义。血清特异性抗体检测可用于流行病学调查,但对SARS早期诊断和鉴别没有意义。     

SARS病毒基因和特异性抗体检测效果评估

目的 :评估严重急性呼吸综合征 (SARS)病毒基因检测和特异性抗体检测效果。方法 :采用巢式反转录PCR检测健康人、普通发热患者、不同时期 SARS患者痰标本中的 SARS病毒核酸即 RNA;采用酶联免疫吸附试验(EL ISA)法检测上述几组血清标本中的特异性抗体 Ig G和 Ig M。结果 :SARS患者住院 6 d～ 5 7d期间 ,采用巢式 RT-PCR检测痰 SARS病毒基因 ,5 6例患者中 34例阳性 ,阳性率 6 0 .7% ;而采用间接 EL ISA检测血清抗 SARS病毒抗体 ,5 6例患者中 32例阳性 ,阳性率为 5 7.1%。两种方法均阳性的有 15例 ,均阴性的有 6例。2种病原学诊断方法检测2 0例正常人和 15例发热非 SARS患者 ,结果均为阴性。住院 6 d～ 13d组 (92 .3% )巢式 RT- PCR基因阳性率明显高于 EL ISA特异性抗体阳性率 (7.7% ) ;住院 >35 d组巢式 RT- PCR基因阳性率 (36 .8% )则明显低于 EL ISA特异性抗体阳性率 (94 .7% ) (P<0 .0 1)。结论 :痰中 SARS病毒基因检测可用于 SARS的早期诊断 ,这对于提前确诊和治疗SARS患者 ,以及尽早排除疑似病例具有非常关键和现实的意义。血清特异性抗体检测可用于流行病学调查 ,但对SARS早期诊断和鉴别没有意义。     

间接免疫荧光法与线性免疫印迹法联合检测抗核抗体在系统性红斑狼疮诊断中的意义

目的分析以间接免疫荧光法(IIF)法筛查的抗核抗体谱(ANAs)、抗双链DNA(dsDNA)抗体结果与线性免疫印迹法(LIA)检测ANAs的结果,了解2种方法是否可以相互取代及其联合检测的意义。方法 230例临床送检样本同时采用2种方法检测ANAs、抗dsDNA抗体与ANAs特异性抗体,分析检测结果的相互关系并寻找对临床有价值的检测方法。结果 2种方法检测结果总体符合率为57.0%;IIF(-)/LIA(+)患者中最易漏检的抗体为抗SSA抗体、Ro52、Jo-1、线粒体(AMA)-M2抗体。IIF(+)/LIA(-)中系统性红斑狼疮(SLE)组与非自身免疫病(AID)组在各个滴度间比较,差异均有统计学意义。检测抗dsDNA抗体,绿蝇短膜虫抗原片(CL)-IIF法的特异性和敏感性都超过了LIA法。SLE患者单一检测IIF-ANA敏感性较高,而LIA-ANAs特异性较高。2种方法联合诊断,敏感性提高。结论无论单独使用哪种检测方法都可能出现漏检的情况。2种方法不能互相代替,需同步检查。CL-IIF法检测抗dsDNA抗体的结果较LIA法更理想。     

SARS患者血清特异性抗体的检测及临床诊断意义

目的 :评估临床诊断SARS患者血清特异性抗体产生规律对疾病诊断的意义。方法 :随机选取不同病程临床诊断为SARS的患者 15 6例 ,通过酶联免疫吸附的方法分别检测患者血清中特异性IgG型和IgM型抗体水平 ,分析SARS特异性抗体的产生与疾病病程的关系及对临床诊断的意义。结果 :血清IgG型抗体阳性 118例 ,阳性率为 75 .6 %。IgM型抗体阳性 6 5例 ,阳性率为 4 1.7%。IgG、IgM均为阴性 37例 ,占 2 3.7%。IgG型抗体产生阳性率随病程延长而逐渐增高 ,病程为 5 0～ 6 0d组阳性率最高达到了 94 .5 %。IgM型抗体阳性率也随病程延长而逐渐增高 ,但在病程 4 0～ 5 0d抗体阳性率即达最高 ,随后迅速下降。IgG与IgM抗体阳性率在其各自不同病程差异均十分显著 (P <0 .0 1)结论 :SARS患者血清特异性抗体检测可以作为SARS临床诊断的重要参考指标 ,但目前尚不宜作为诊断的金标准 ,SARS特异性IgG、IgM抗体同为阴性不能完全排除SARS诊断     

血、便、痰和尿标本中SARS冠状病毒核酸的检测和病毒基因谱的初步建立

目的：利用冠状病毒全基因组芯片检测SARS患者血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸并试图建立其基因谱。方法：提取SARS患者血、便、痰和尿样本中的冠状病毒RNA，经全基因组随机反转录和PCR扩增标记成荧光探针，与SARS病毒全基因组芯片进行杂交，同时用体外培养的病毒RNA和从健康人血液中提取的RNA做对照。结果：SARS患者的4种标本中都能检测到冠状病毒核酸的存在，与整个病毒基因组相比，大都为一些不连续的片断。其中尿、痰和便标本中的基因谱较为相似，另外，发现编码S1蛋白的核酸在一些标本中是连续的，具体为23份血标本中有2份是连续的，13份痰标本中有8份是连续的，51份便标本中有48份是连续的，2份尿标本中都是连续的。结论：冠状病毒全基因组芯片能够检测出SARS患者血、便、痰和尿标本中的冠状病毒核酸，并能建立各来源标本中病毒核酸的基因谱。