基因免疫制备抗SARS病毒N蛋白单克隆抗体

目的通过基因免疫方法,制备抗SAILS病毒N蛋白的单克隆抗体并对单抗进行初步鉴定。方法将含有N蛋白的编码基因的真核重组质粒pSecTagB／N免疫BALB／c小鼠,然后取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,用原核表达的SARS病毒N蛋白筛选阳性克隆。然后通过免疫印迹法进一步证明抗体对N蛋白的特异性,用ELISA方法检测抗体对灭活SARS全病毒的免疫反应。结果筛选得到10株抗N蛋白的单克隆抗体,ELISA和免疫印迹结果表明这些抗体特异性针对N蛋白上的抗原决定簇,且有7株抗体对SARS灭活病毒有阳性反应。结论所得的单克隆抗体特异针对N蛋白。     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。     

SARS病毒S蛋白的原核表达与DNA疫苗的构建

目的探讨SARS冠状病毒的刺突(spike，S)蛋白的免疫学特性，以及S蛋白作为SARS—CoV病毒疫苗组分的可行性。方法将S蛋白基因分段克隆入原核表达载体pET—15b，并在大肠杆菌中表达，经过亲和层析得到纯化的重组蛋白rSa和rSb；将全长S基因克隆入真核分泌表达载体pSecTagB，得到重组DNA疫苗pSecS，免疫小鼠，得到SAS—CoV S蛋白抗血清。然后用纯化的重组蛋白rSa和rSb建立的SARS—CoV S抗体ELISA检测技术研究所构建的S-DNA疫苗的免疫效果。结果分段的重组蛋白rSa和rSb在大肠杆菌中均以可溶性形式得到高效表达，并能与SARS确诊病人血清以及pSecS免疫鼠血清发生特异性抗原抗体反应，原核表达的重组分段S蛋白具有SARS—CoV S蛋白相似的抗原性。结论原核表达的两段重组S蛋白有可能作为抗原组分用于临床SARS—CoV检测中；所构建的SARS—CoV的S基因核酸疫苗能在小鼠体内产生特异性抗体，这为进一步SARS DNA疫苗的研制提供一定的借鉴作用。     

HPV6b L1蛋白在昆虫细胞中的表达及其作为特异性诊断抗原的初步研究

目的：研究人乳头瘤病毒6b结构蛋白（HPV6b L1)在昆虫细胞系统的表达及其作为特异性诊断抗原的可行性,为HPV感染的血清学诊断及基因工程疫苗研究作准备。方法：采用HPV6b L1重组杆状病毒感染sf-9昆虫细胞制备HPV6b L1,经氯化梯度离心纯化,Western blot分析及电镜观察鉴定;用1μg、5μg和20μg三种剂量免疫小鼠,以检测小鼠血清抗体反应;并用HPV6b L1作为诊断抗原检测HPV感染者（尖锐湿疣及宫颈癌）和健康对照者共112例血清特异性抗体。结果：HPV6b L1在昆虫细胞中得到表达,并可自行组装形成VLPs,且予1μg剂量免疫小鼠就能产生阳性血清抗体反应,HPV6b L1 VLPs特异性抗体对HPV6感染的敏感性和特异性分别为78．6％和97．1％。结论：HPV6b L1 VLPs具较强的免疫原性和抗原性,血清中检测到的HPV6b L1抗体对HPV6感染具较高的特异性,可进一步用于HPV感染的血清学诊断及防治尖锐湿疣的基因工程疫苗研究。     

严重急性呼吸综合征患者血清中SARS相关抗体的特异性研究

目的：检测严重急性呼吸综合征(SARS)患者血清中SARS相关抗体的抗原特异性。方法：采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IgG抗体，并采用抗原抗体的预孵育，吸附血清中抗原特异性抗体，检测其抗原特异性。结果：SARS患者血清与SARS患者肺组织以及非SARS患者肺组织均有相似的反应性。阳性血清与非SARS患者肺组织孵育后，其中抗SARS患者肺组织抗体被吸收，吸收率为100％。结论：本组SARS患者血清中存在抗肺组织抗体，其对SARS致病机制的意义值得进一步研究。     

HPV6b VLPs检测尖锐湿疣病人血清和宫颈分泌物抗体的意义

目的 :探讨人乳头瘤病毒 (HPV)感染后尖锐湿疣 (CA)病人机体产生的免疫反应及特异性抗体用于HPV感染的诊断价值。方法 :采用重组杆状病毒 昆虫细胞系统制备HPV 6bL1VLPs抗原 ,以酶联免疫吸附试验 (ELISA)分别检测 4 9例CA病人和 4 5例正常对照的血清抗体、4 6例CA病人和 36例正常对照的宫颈分泌物抗体 ,并用血凝抑制试验检测抗体的中和活性。结果 :CA组HPV6bL1VLPs特异性的血清IgG抗体和分泌物IgA抗体的OD值和阳性率均显著高于正常对照组 (P <0 .0 0 1)。HPV 6型与HPV 11型DNA阳性者的血清IgG和分泌物IgA抗体的阳性率差异均无显著性 (P >0 .0 5 )。血清IgG和分泌物IgA抗体血凝抑制试验平均效价较正常对照组为高。结论 :生殖道HPV感染后可产生全身和局部生殖道粘膜抗体反应 ,两类抗体均具中和活性。HPV6型与HPV11型感染者的血清和分泌物抗体均存在交叉反应。血清抗体和局部分泌物抗体可能具有用于诊断HPV感染的价值     

丙型肝炎病毒H株包膜蛋白在昆虫细胞中的表达及意义

目的　获得丙型肝炎病毒 (HCV) H株包膜糖蛋白的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中稳定表达包膜糖蛋白 E1和 E2 ,并初步应用于丙型肝炎患者血清抗体的检测。方法　用 PCR方法自 HCV H株扩增出包膜蛋白 E基因 ,构建重组杆状病毒 ,并在昆虫细胞中稳定表达包膜糖蛋白 E1和 E2。免疫荧光及 Western blot方法鉴定表达产物。用表达的 E1和 E2蛋白与 35例丙型肝炎患者血清反应。结果　昆虫细胞中表达的 E蛋白呈现 3种分子大小 ,E1的相对分子量为 2 1× 10 3和 33× 10 3 ,E2的相对分子量为 6 0× 10 3。在 35份感染者血清中 ,有 4例 E1抗体阳性 ,其中 1例检出 E2抗体。在 9例 PCR检测 HCV RNA阳性而抗 HCV检测阴性的血清中 ,有 3例血清与表达的 E蛋白反应。结论　 HCV E蛋白基因可在昆虫细胞中稳定表达 ,表达的 E1和 E2蛋白可用于 HCV患者的血清学诊断     

SARS病人SARS冠状病毒核壳抗原抗体的变化规律

目的通过监测SARS冠状病毒感染患者的抗体水平,阐明SARS冠状病毒感染机体免疫应答的机制并探讨血清学诊断的意义。方法采用基因重组SARS冠状病毒核壳抗原(N)建立间接ELISA法,检测健康人和SARS患者急性期和恢复期多点血清中特异性IgG和IgM抗体。以D450值=2.1×200例健康人血清中特异性IgG和IgM抗体均值作为抗体阳性判断的临界值。结果IgM和IgG的阳性临界值分别为0.233 和0.239。以此对13例SARS病人急性期和恢复期IgM和IgG抗体检测结果进行判断,结果发现:发病1周内,IgM和IgG抗体检测均为阴性;发病第2周,IgM和IgG检出阳性率分别为83.3%和66.7%;第3周均为100%;发病第2个月,IgM检出阳性率为61.5%,至第3个月,IgM检出阳性率为38.5%;IgG至第1个月时达到高峰,第3个月仍维持在高水平。结论机体产生针对SARS冠状病毒核壳抗原的抗体持续时间长,提示SARS冠状病毒核壳抗原具有强免疫原性,在SARS冠状病毒致病机制中可能起重要的作用、在SARS的血清学诊断方面具有重要的价值。     

SARS患者病原学诊断及病毒传播规律研究

目的探讨血清抗SARS—CoV特异性LgG、IgM；外周血单核细胞、漱口液以及粪便SARS—CoV特异性套式RT-PCR检测SARS—COV RNA在SARS确诊中的意义，并通过研究其系列标本，进一步探讨SARS—CoV特异性IgG、IgM出现规律及病毒传播规律。方法临床诊断SARS患者28例，1周采集2次血清、大便及漱口液系列标本。ELISA测定血清抗SARS—CoV特异性IgG、IsM，套式RT—PCR检测外周血单核细胞、漱口液以及粪便SARS—CoV RNA。结果血清SARS—COV—IgM阳性率为50％(14／28)；SARS—COV—IgG阳性率为78．6％(22／2s)。早期(-10天)IgG可出现；4周阳性率最高；IgG出现晚(11天-)，2—3周阳性率最高；持续时间短(11天-)，4周后大部分患者阴转。PBMC SARS—COVRNA阳性率为32．1％(9／28)，病程10—14天阳性率最高；漱口液SARS—COVRNA阳性率为57．1％(16／28)，大便SARS—COVRNA阳性率为60．7％(17／28)；病程2—3周阳性率最高。85．7％(24／2．8)可确诊SARS；14．3％不能确诊SARS。结论SARS诊断必须加入病原学诊断标准，而且必须结合特异性抗体、外周血单核细胞、漱口液以及大便SARS—CoVRNA检测，综合判断。由于SARS患者特异性抗体出现晚等特点。因此，SARS特异性抗体不能作为早期诊断。SARS患者病程2—3周传染性可能最强，而早期(10天内)传染性可能弱。     

免疫印迹法在实验大鼠汉坦病毒监测中的应用及与间接免疫荧光法之比较

用汉坦病毒汉滩株（７６－１１８）重组核蛋白作为免疫印迹法（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ以下简称ＷＢ）的诊断抗原，用于实验感染大鼠血清抗体效价测定。同时与用汉城株（ＳＲ－１１）感染的Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞作抗原的间接免疫荧光法（以下简称ＩＦＡ）进行比较。ＷＢ法对３／４标本在大鼠接种病毒后第３天测得血清ＩｇＭ阳性，而ＩＦＡ法仅１／４标本出现阳性，ＩＦＡ效价为１：５１２０的血清，ＷＢ效价为１’：４０９６０，且在血清１：１０稀释时反应带亦清晰。两种方法分别测定６４份大鼠血清。甩ＩＦＡ法，４４份（６８．８％）出现类似阳性的荧光颗粒，而用ＷＢ法测定，无特异的反应带出现。非感染Ｖｅｒｏ－Ｅ６细胞作ＩＦＡ抗原，３０份（４６．９％）与正常细胞抗原有反应，此结果表明ＷＢ法在特异性和敏感性方面均高于ＩＦＡ法。ＩＦＡ法中的非特异性反应系血清与细胞成份之反应。     

间接免疫荧光法检测麻疹抗原在麻疹早期诊断中的临床应用

目的:探讨间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence Assay,IEA)检测麻疹病毒抗原对儿童麻疹病毒(measles virus,MV)感染的早期诊断价值.方法:观察86例临床诊断麻疹的患儿,在发病的不同阶段IFA检测痰液MV抗原和酶联免疫吸附试验(engymelinked imgmunosorbent assay,ELISA)检测血清中MV特异性LgM抗体,采集30份上呼吸道感染患者痰液进行IFA麻疹病毒抗原检测,比较分析检测结果.结果:86例中发病7 d内IFA测抗原ELISA测抗体两种方法的阳性率为分别为97.1%和16.2%;7 d后为33.3%和88.9%,P均＜0.01.IFA测抗原阳性率与检测时间的相关系数为-0.91,P=0.02;ELISA测抗体阳性率与检测时间的相关系数为0.97,P=0.04.30份对照组的标本MV抗原检测均为阴性,IFA测抗原的特异性与敏感性分别是100%和97.1%.结论:IFA测抗原在疾病早期检出阳性率高,阳性检出率与检测时间成负相关,IFA测抗原痰液麻疹病毒抗原是一种早期快速、特异敏感的实验室检测方法.     

SARS病毒S1蛋白N端片段在大肠杆菌中的表达、纯化与鉴定

目的:获得纯化的重组SARS病毒S1蛋白N端部分,研究其与机体产生针对SARS病毒免疫应答的规律和机制.方法:将编码SARS病毒S1蛋白N端334个氨基酸残基的基因进行克隆,并在原核表达系统中表达,获得了纯化的重组蛋白.利用SARS患者恢复期已知的SARS抗体阳性血清,鉴定纯化的重组S1蛋白片段.结果:克隆表达的重组蛋白基因序列与公布的SARS病毒S1蛋白N端的基因序列相同,所表达的重组蛋白相对分子质量约为64 000.3份SARS患者恢复期的血清均与重组蛋白反应,在相对分子质量64 000处形成特异性的反应条带,而来自SARS流行前的正常人对照血清则不能与重组蛋白反应.结论:获得的重组蛋白与SARS病毒抗体呈现特异性的反应,为进一步研究SARS病毒感染免疫应答机制和制备SARS病毒的重组疫苗奠定基础.     

重组杆状病毒表达轮状病毒SA11毒株VP4蛋白

从培养的SA11病毒中提取病毒dsRNA作为模板，经逆转录、多聚酶链反应（RT-PCR）获得编码VP4蛋白的全基因，全长2362bp.完整的VP4基因克隆到杆状病毒转移载体pVL-1393中，转染Sf9细胞进行同源重组，用声、杂交法筛选出表达VP4蛋白的重组杆状病毒。表达的VP4蛋白能被抗轮状病毒抗体所识别，表达产量约占总蛋白的10％。用表达的VP4蛋白免疫动物后可产生高水平抗亲本SA11毒株中和抗体。抗体能阻断SA11病毒在MA104细胞上引起的细胞病变（CPE），免疫荧光和Westernblot也证实抗体可特异性识别轮状病毒抗原。结果表明，重组杆状病毒表达的VP4蛋白具有良好的抗原性和免疫原性，可望用VP4基因研制轮状病毒重组疫苗和亚单位疫苗。     

小鼠诺如病毒间接免疫荧光检测方法的建立

目的建立小鼠诺如病毒(MNV)的间接免疫荧光试验(IFA)的检测方法。方法将MNV-1接种RAW264.7细胞,培养36 h收集病毒培养物及未感染细胞培养物,点制抗原玻片;以107TCID50的MNV-1灌胃接种BALB/c小鼠,收集感染血清做阳性对照血清。收集人工感染后不同时间点的血清样品,以1:10的稀释度使用IFA法测定感染血清MNV抗体滴度。选取80份送检小鼠血清样品,以IFA和ELISA方法测定,差异样品使用Western blot方法进行验证。结果 MNV-1感染RAW264.7细胞(36~48)h,细胞感染率为60%,以36 h感染细胞状态为佳;IFA法测定感染小鼠血清,小鼠感染1周后抗体水平逐渐提高,在4周时抗体滴度达到最高值,之后维持稳定,采集感染4周的动物血清做IFA方法的阳性质控品;80份血清中,IFA法测定阳性27份,阴性53份,ELISA法测定阳性32份,阴性48份;Western blot方法对差异样品验证,其中阳性3份,阴性2份,IFA法和ELISA法检测符合率分别为96.0%和97.5%。结论 IFA方法检测小鼠诺如病毒基本可以反应小鼠的感染情况,偶有假阴性的出现,可以选择IFA方法和ELISA方法作为初筛,差异样品用Western blot方法验证。     

正常人群血清中SARS病毒特异抗体的检出

[目的]检测正常人群血清中抗体，了解SARS病毒非致病性感染状况。[方法]利用SARS病毒全病毒裂解液抗原酶联免疫法检测81例志愿者血清中的SARS病毒抗体IgG和IgM。[结果]81例血清中，抗SARS病毒IgG抗体阳性3例，阴性78例；IgM抗体均为阴性。[结论]大连地区正常人群可能有过sARS病毒或类似病毒的非致病性隐性感染。     

三种方法检查食蟹猴血清STLV-1抗体的研究

本文用乳胶凝集试验（ＰＡ）、免疫荧光试验（ＩＦＡ）和蛋白印迹试验（ＷＢ）对１０３份食蟹猴血清作了ＳＴＬＶ－１抗体检查。结果表明，１３份ＷＢ检查为ＳＴＬＶ－１抗体阳性的血清，ＰＡ和ＩＦＡ检查均为阳性，而９０份ＷＢ检查为ＳＴＬＶ－１抗体阴性的血清，ＰＡ检查有３份为阳性，ＩＦＡ检查有１份为阳性结果。     

免疫荧光技术检测肺吸虫病抗体的初步研究

<正> 间接荧光抗体方法(Indirect fluorescent antibody test,IFA)是组织化学结合免疫学应用显微示踪的一种新技术。目前国内外已广泛用于微生物学和免疫学的诊断和研究并已取得显著的成就。在寄生虫学领域里,国外应用也很广泛,许多人体寄生虫病如血吸虫病、丝虫病和弓浆虫病等均已用荧光抗体方法进行诊断。国内已成功地用于疟疾和丝虫病的流行病学调查和诊断。Cho KM等报告用卫氏并殖吸虫的碎片固定于玻片上作为抗原。用荧光抗体方法     

Evaluation by indirect immunofluorescent assay and enzyme linked immunosorbent assay of the dynamic changes of serum antibody responses against severe acute respiratory syndrome coronavirus

Background Severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) is a newly emerging virus that gives rise to SARS patients with high rates of infectivity and fatality. To study the humoral immune responses to SARSCoV, the authors evaluated lgG and IgM specific antibodies in patients‘ sera.Methods Two methods, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and indirect immunofluorescent assay (IFA) , were used to detect specific serum IgG and IgM against SARS-CoV in 98 SARS patients and 250 controls consisting of patients with pneumonia, heahh-care professionals and healthy subjects. The serum antibody profiles were investigated at different times over one and a half years in 18 of the SARS patients.Results The sensitivity and specificity of ELISA for detecting IgG against SARS-CoV were 100.0% and 97.2% and for IgM 89. 8% and 97.6% respectively; the figures using IFA for IgG were 100.0% and 100.0% and for IgM 81.8% and 100.0% respectively. During the first seven days of the antibodies trace test, no IgG and IgM were detected, but on day 15, IgG response increased dramatically, reaching a peak on day 60,remaining high up to day 180 and decreasing gradually until day 540. On day 15,IgM was detected, rapidly reached a peak, then declined gradually until day 180 when IgM was undetectable.Conclusion The detection of antibodies against SARS virus is helpful in the clinical diagnosis of SARS.     

非SARS患儿体内SARS冠状病毒抗体的检测分析

目的探讨非急性重症呼吸综合征(SARS)患儿体内是否存有SARS冠状病毒相关抗体。方法采用国家药品生物制品检定所正式检定通过的2种SARS抗体诊断试剂(间接免疫荧光检测试剂和双抗原夹心ELISA试剂),对广州地区1 060例非SARS患儿血清样本进行检测。结果1 060例非SARS患儿血清样本,间接免疫荧光法检测IgM、IgG均为阴性。双抗原夹心ELISA法检测也仅有2例出现弱阳性。结论非SARS患儿体内并未存在SARS病毒相关抗体。