高危型人乳头瘤病毒E6蛋白与hTERT的相互作用研究进展

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）是一类能特异性感染人皮肤和黏膜基底上皮细胞的双链闭合环状DNA病毒。宫颈癌的病因学研究表明,生殖道感染高危型HPV（High-risk HPV,HR-HPV）是宫颈癌和宫颈上皮内瘤变（Cervical intraepithel ialneoplasia,CIN）高发的关键诱因。     

人乳头瘤病毒与大肠癌相关性研究

大肠癌是常见的消化道恶性肿瘤 ,近年来我国大肠癌发病率和死亡率有呈逐年上升趋势 ,但其病因及发生机制目前并不十分清楚。许多证据表明 ,人乳头瘤病毒 (ＨＰＶ)与人类肿瘤关系密切 ,因此ＨＰＶ与大肠癌的关系目前也越来越受到关注。为了解大肠疾病中ＨＰＶ感染情况 ,以明确ＨＰＶ与大肠癌的关系 ,作者对 1 1 2例结肠镜活检标本进行了ＨＰＶ检测 ,结果报道如下。1　材料与方法1 .1　ＰＣＲ模板ＤＮＡ制备　通过结肠镜检查 ,获取11 2例标本 ,用甲醛溶液固定 ,石蜡包埋保存。所有标本同时行病理检查确定诊断 ,其中大肠腺癌 4 6例 ,大肠腺瘤 1…     

尖锐湿疣及湿疣样病变人乳头瘤病毒6/11DNA原位杂交病理组织学观察

对48例生殖道尖锐湿疣(CA)及湿疣样病变常规福尔马林固定石蜡包埋组织切片进行人乳头瘤病毒(HPV)6/11型DNA原位分子杂交及病理组织学观察.在12例CA中9例(75%)和湿疣样病变中1例(2.7%)检出HPV6/11DNA,阳性细胞定位于鳞状上皮中表层的凹空细胞及其周围细胞核内,充分显示出6/11型HPV感染鳞状细胞后,病毒的整合,复制依赖于鳞状细胞的分化过程,其引起的相应的病理组织学特点以表皮棘层乳头状增生、典型的凹空细胞、角化过度和炎症为主.在CA与湿疣样病变的鉴别诊断中,HPV6/11型DNA具有重要的价值.     

339例疑似外生殖器人乳头瘤病毒感染基因分型检测及分析

目的：探讨疑似外生殖器人乳头瘤病毒（HPV）感染患者中基因型分布情况及临床意义。方法采用基因芯片分型技术检测339例疑似HPV感染者外生殖器皮损HPV21种亚型感染情况。结果共检出217例HPV阳性者。21种HPV亚型均有检出,共检出363例次。检出前三位的基因型为6型、11型、16型。不同性别患者HPV检测阳性率差异无统计学意义。单一HPV感染占62.67%,多重感染占37.33%,高危型以多重感染形式为主。女性多重感染率高于男性。21~50岁年龄段患者检出阳性者最多。结论疑似外生殖器HPV感染患者中HPV型别主要是低危型,高危型多以多重感染形式存在,性活跃人群阳性检出者最多。     

喉鳞状细胞癌人乳头瘤病毒感染与P53表达表达

一般认为 ,人类乳头瘤病毒 ( HPV)感染与宫颈良、恶性肿瘤及某些上消化道和上呼吸道肿瘤发生、发展密切相关。但有关 HPV与喉鳞状细胞癌( LSCC)关系的研究结果不一 ,意见分歧较大〔1、2〕。P53基因是一种公认的肿瘤抑制基因之一 ,对引起细胞周期阻滞 ,诱导凋亡及促进细胞分化等起着重要的作用。本实验目的在于探讨 LSCC组织中 HPV与 P53蛋白表达状况 ,两者的关系及其在 LSCC发生中可能的作用。1　材料与方法　　随机收集 LSCC的标本 40例 ,所有标本均经4%甲醛固定 ,石蜡包埋。患者男 39例 ,女 1例 ,年龄41～ 79岁 ,平均年龄 57.6…     

人乳头瘤病毒与宫颈癌

子宫颈癌的发病率在全球位列女性恶性肿瘤的第三位,每年子宫颈癌的新发病例为371200例,占所有恶性肿瘤的9．8％,其中78％发生在发展中国家。1976年Zur首先报道了人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)与子宫颈癌的相关性,随后世界各地相继对HPV与子宫颈癌的关系进行了研究,在HPV作为子宫颈癌的病因学研究及HPV作为宫颈癌筛查和指导预后的指标方面均取得了重大进展。现综述如下。     

人乳头瘤病毒分型长链寡核苷酸芯片的制备

目的 制备用于人乳头瘤病毒（HPV）初步检测和分型的长链寡核苷酸基因芯片。方法 对4型HPV（6,11,16,18）全基因组序列进行分析,设计特异性高、熔解温度（Tm）和GC含量相近的HPV型特异性长链寡核苷酸探针,点样制备成寡核苷酸基因芯片,利用限制性显示技术对HPV样品进行荧光标记,并将标记好的样品与芯片杂交,以了解寡核苷酸基因芯片在HPV病毒检测和分型中的作用。结果 荧光标记的HPV样品与多个型特异性HPV探针杂交有明显的荧光信号,可以根据杂交结果进行初步的分型检测。结论 采用设计合理的60mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对HPV的检测和分型。     

人乳头瘤病毒16／18感染和端粒酶活性的表达与胃癌的关系

目的：探讨胃癌及癌前病变组织中的高危人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV)感染和端粒酶活性（Telomerase activity,TA)的表达情况以及在肿瘤发生、发展过程中所起的作用。方法：应用分子原位杂交技术检测96例胃腺癌及癌前病变组织的HPV－16、18亚型和TA的表达、分析相互之间的关系。结果：HPV－16、18亚型、TA的阳性率分别为34．38％（33／96）、8．33％（8／96）、66．66％（64／96）；腺癌组织中的阳性率分别为38．15％（29／76）、9．21％（7／76）、80．26％（61／76）。HPV－16、TA在腺癌与癌前病变组织的阳性表达之间差异有显著性意义（P＜0．05）。胃腺癌I组与Ⅱb之间的TA表达，差异有显著性意义（P＜0．05）。在胃癌组织中，HPV－16感染与TA的阳性表达密切相关（P＜0．01）。结论：HPV－16感染和TA的表达与胃癌的发生有密切关系；HPV－16感染与TA密切相关；HPV和TA在胃癌的发生、发展过程中起着重要的作用。     

人乳头瘤病毒感染与宫颈癌前病变的临床研究进展

人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)于1949年由Strauss在电镜下发现.1974年,德国病毒学家Harald Zur Hausen 首次提出HPV感染与宫颈癌密切相关.宫颈癌的病因学研究近10余年来取得了一系列突破性进展.随后的各项研究及临床调研均证实,HPV感染是子宫颈癌发生的必要条件,99.7%的宫颈癌病变组织中均可检测到HPV;未感染HPV者几乎不会发生宫颈癌(阴性预测值＞99%)[1].     

人胰岛素样生长因子1基因转染关节软骨细胞及其稳定表达

目的　研究人胰岛素样生长因子 1 (hIGF 1 )基因转染关节软骨细胞获得稳定表达的可行性。方法　用脂质体转染法将含有hIGF 1cDNA的真核表达载体转染兔关节软骨细胞 ,经G4 1 8筛选 ,形成阳性细胞克隆。继续培养 4周 ,原位杂交检测hIGF 1的表达 ,免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原的表达。结果　G4 1 8筛选后所获得的阳性细胞克隆 ,原位杂交检测表明hIGF 1基因得到稳定表达 ,免疫细胞化学检测显示转染后的软骨细胞仍表达Ⅱ型胶原。结论　外源性hIGF 1基因能够在软骨细胞内获得稳定表达 ,而转染后的软骨细胞仍能稳定表达Ⅱ型胶原     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

人巨细胞病毒UL82基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 pp71蛋白基因 ,构建高效表达 pp71蛋白的工程菌。 方法 :在传代培养的人包皮成纤维细胞中接种人巨细胞病毒 (HCMV) ,待绝大多数的细胞出现了细胞病变效应后 ,用冻融法收获细胞 ,用PCR技术扩增目的基因 ,将基因片段插入表达载体pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5 α,TPTG诱导其表达。结果 :获得的工程菌所表达的 pp71蛋白大小约为 710 0 0 ,约占菌体总蛋白的 3 0 0 %。结论 :成功的构建了 pGEX/ pp71重组表达质粒 ,并在DH5 α 中高效表达出pp71蛋白 ,为下一步pp71蛋白的大量表达和纯化奠定了基础。     

乙型肝炎病毒DNA聚合酶反式调节人类新基因HBVDNAPTP1的克隆及原核表达与组织表达分析

目的 克隆应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选得到的乙型肝炎病毒(HBV)DNA聚合酶反式调节新型靶基因HBVDNAPTP1,构建HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中表达,并进一步分析HBVDNAPTP1在组织中的分布表达水平.方法 应用RT-PCR技术扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导以获得HBVDNAPTP1融合蛋白的表达,利用Western blot证实表达蛋白的特异性.应用UniGene数据库对HBVDNAPTP1基因的染色体中定位及组织分布表达水平进行分析.结果 RT-PCR扩增获得HBVDNAPTP1基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21(DE3)受体菌,经IPTG诱导获得了HBVDNAPTP1重组蛋白的表达,Western blot证实了表达的重组蛋白的特异性.HBVDNAPTP1在多数组织中低表达,仅在脑垂体腺、扁桃体、舌、胸腺、气管与脐带中无表达.结论 成功构建了HBVDNAPTP1基因的原核表达载体,利用大肠埃希菌原核表达系统获得了重组蛋白的表达,并初步了解了HBVDNAPTP1基因的染色体定位与组织表达水平.     

Mda7/IL-24基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表达

目的 :克隆人黑素瘤分化相关基因 (melanomadifferentiationassociatedgene ,mda 7/IL 2 4 ) ,并在大肠杆菌中表达。方法 :从PHA刺激培养的人外周血淋巴细胞提取总RNA ,根据mda 7/IL 2 4基因序列设计引物 ,用PCR法扩增mda 7/IL 2 4基因。将mda 7/IL 2 4基因插入表达载体pET 2 8a(+)中 ,构建表达载体pET 2 8a mda 7/IL 2 4 ,用IPTG诱导目的蛋白在E .coli中表达。通过Western印迹分析对表达产物进行鉴定。结果 :经RT PCR从人外周血分离的淋巴细胞中扩增到mda 7/IL 2 4cDNA ,序列分析与文献报道一致 ;SDS PAGE分析表明 ,经 0 .5mmol/LIPTG 37℃诱导 4h后在E .coli中有大量mda 7/IL 2 4融合蛋白表达 ,相对分子质量约为 2 8× 10 3 ,融合蛋白约占诱导菌总蛋白的30 % ;Western印迹分析提示 ,诱导表达产物能与His单抗发生特异性反应。结论 :从人外周血淋巴细胞中获得了mda 7/IL 2 4的全长cDNA ,融合蛋白在E .coli中获得高效表达。     

人线粒体核糖体蛋白S17 cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的克隆人MRPS17cDNA,并在大肠杆菌中表达纯化。方法从人原代培养毛乳头细胞中分离总RNA,采用RTPCR及序列测定等方法获得人MRPS17cDNA,然后克隆至原核表达载体pET28a,转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达;C末端融合了6×His纯化标签的表达产物行Western印迹法分析并用Ni2 NTA离子交换树脂进行纯化;纯化蛋白行SDSPAGE纯度分析。结果获得了人MRPS17cDNA,与GenBank报道的序列一致,并成功构建了高效原核表达质粒pET28aMRPS17;Western印迹结果表明,经IPTG诱导,在大肠杆菌中表达了分子量约13kD的目的蛋白;表达产物经Ni2 NTA离子交换树脂纯化,纯度>90%。结论克隆得到了人MRPS17cDNA,并在E.coli中成功表达和纯化了MRPS17蛋白,为后续研究奠定了基础。     

UROC28基因cDNA的克隆及其原核表达

目的：克隆人UROC28基因cDNA并在原核细胞中表达。方法：用RT-PCR从前列腺癌PC-3细胞系中扩增UROC28基因cDNA,并克隆到载体pUC-19中。经测序证实后,用HindⅢ/EcoRI双酶切,亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,并转化E.coliDH5α菌株。取工程菌,用IPTG诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE鉴定。结果：①经RT-PCR、测序和酶切鉴定,成功地克隆了人UROC28基因cDNA;②经IPTG诱导的重组质粒pGEX-4T-UROC28表达出相对分子质量（Mr）约为42000的融合蛋白,与预期的结果相符。结论：成功克隆到人UROC28基因cDNA,并在E.coliDH5α中表达出GST-UROC28融合蛋白。     

人白细胞介素6在HT-29结肠癌细胞系中的转基因表达

将含IL-6cDNA的PMAM重组载体用脂质体法转染大肠癌细胞株HT-29,克隆出抗性细胞,经Southern印迹杂交证明有IL6基因片段的插入.RNA点杂交结果表明:IL-6基因转染细胞有较强的IL-6mRNA转录,而未转染细胞的转录水平很弱;7TD1-MTT法检测转染前后细胞的上清显示:抗性细胞分泌的IL-6活性明显增强.     

HCMV gp52基因的克隆与表达

目的：克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)gp52基因，制备特异性抗原，用于HCMV早期诊断。方法：从感染的HCMV细胞上清液中提取病毒的DNA，用PCR扩增gp52蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA片段，并将其克隆到pGEM-Teasy载体测序，然后将其克隆到含有谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-5x-3中表达，表达产物经GST亲和层析柱纯化后，采用ELIA和免疫印迹(Westem blotting)检测重组蛋白的抗原性。结果：经序列测定gp52基因片段的序列正确，并在pGDX-5x-3表达载体中得到了高效表达。表达的融合蛋白用亲和层析柱纯化后经免疫印迹和ELISA分析具有良好的抗原性，能够与HCMV IgM阳性血清呈特异性反应。结论：通过基因工程制备的重组gp52蛋白可作为抗原用于HCMV感染者的早期诊断。     

人α-磷酸丙酮酸水合酶原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的 构建带PET-28a标签的人ENO1基因原核表达产物,观察其表达并纯化出带PET-28a标签的ENO1融合蛋白,为研究肿瘤糖酵解的相关机制奠定实验基础.方法 以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增出ENO1基因编码片段,将其插入到PET-28a载体中,鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate,小量诱导表达后,利用PET-28a-琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化PET-28a-ENO1融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测,获得纯度较好的PET-28a-ENO1蛋白.结果 利用PCR技术从乳腺文库中扩增得到大小约1300 bp的目的基因片段,插入PET-28a载体中,经双酶切鉴定及测序,结果表明PET-28a-ENO1质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为57×103的目的蛋白.结论 成功获得了人糖酵解相关基因ENO1的原核表达产物,为进一步研究ENO1在糖酵解过程中的作用机制奠定基础.