人羊水来源MSC的分离培养鉴定及其免疫抑制特性的初步研究

目的：体外分离培养鉴定具有间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）特征的人羊水来源细胞,并对其免疫抑制特性进行初步评价。方法：贴壁法体外分离培养人羊水来源细胞,多次传代扩增后,采用形态学观察、流式细胞术分析表型以及定向诱导分化为脂肪样细胞、成骨样细胞等方法进行鉴定后,以细胞计数试剂盒（cellcounting kit-8,CCK-8）体外检测人羊水来源间充质干细胞（amniotic fluid derived-mesenchymal stem cells,AFMSC）对ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,并对其时效、量效关系进行分析。结果：具备MSC形态、表型及分化潜能特征的人羊水来源细胞,可于体外显著抑制ConA刺激的小鼠脾淋巴细胞增殖（P〈0．05）,时效、量效关系显著（P〈0．05）。结论：从免疫抑制特性角度证明羊水可成为替代骨髓的MSC新来源。     

去分化来源表皮干细胞的分离、培养和鉴定

目的 分离培养去分化来源的表皮十细胞(dedifferentiation-derived epidermal stem cells,DDESCs),并进一步观察其表型特征.方法 包皮皮片去除皮下脂肪后,中性蛋白酶消化过夜,分离表皮和真皮.分离的表皮片用Ⅳ型胶原反复粘贴并冲洗去除表皮十细胞后,移植到BALB/c裸鼠背部全层皮肤缺损创面,移植5 d后收集皮片制备单细胞悬液,流式检测CK10、CK19和β1整合素阳性细胞白分数,然后用Ⅳ型胶原粘贴法分离皮片内DDESCs,并采用免疫荧光法和荧光定量PCR法分别检测去分化细胞内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达.结果 流式检测结果表明,皮片移植5 d后,CK10阳性细胞减少(P＜0.01),CK19和β1整合素阳性细胞增加(P＜0.01).Ⅳ型胶原粘贴分离DDESCs,结果表明,移植皮片组在10 min内约有4.56%的贴壁细胞出现.细胞的表型分析结果表明,DDESCs内CK19、β1整合素、Oct4和Nanog的表达量类似于原始表皮干细胞(P＞0.05),但明显高于成熟表皮细胞(P＜0.01).结论 DDESCs的表型特征与原始表皮干细胞相类似,提示去分化细胞有可能代替原始表皮干细胞应用于创伤部位的修复和再生.     

嗅鞘细胞对脊髓源性神经干细胞分化的影响

目的 探讨嗅鞘细胞对脊髓源性神经干细胞分化的作用。方法 应用Millicell插入式细胞培养皿，大鼠脊髓源性神经干细胞与嗅鞘细胞在无血清培养液中共培养，通过免疫化学染色方法，检测脊髓源性神经干细胞分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的比例。结果 共培养7d后，脊髓源性神经干细胞分化为神经元的比例高达43．5％，明显高于对照组的21．4％。结论 嗅鞘细胞提供的微环境可促进脊髓源性神经干细胞分化为神经元。     

去分化来源表皮干细胞的分离与鉴定

目的 分离培养和鉴定去分化来源的表皮干细胞.方法 采用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导表皮细胞去分化形成表皮干细胞,采用Ⅳ型胶原黏附法分离获得去分化来源的表皮干细胞.观察去分化来源表皮干细胞的形态及增殖特点,并通过免疫细胞化学、免疫荧光及流式细胞技术对其形态和表型进行鉴定.结果 去分化来源的表皮干细胞能够表达表皮干细胞及其亚群特异性的表面标志蛋白,如β1整合素、CK19、CK14等,而CK10的表达为阴性.激光共聚焦检测显示a6整合素和CD71在去分化来源表皮干细胞及其亚群中的分布均存在着区域性差异.此外,流式细胞检测结果显示去分化来源的表皮干细胞中主要包含a6+CD71-和a6+ CD71+的两种细胞群落,分别占被检测细胞总数的24.52%±7.88%及66.97%±5.04%.结论 去分化来源的表皮干细胞与机体自身来源的表皮干细胞在形态和表型上具有相似性,可以作为表皮干细胞的替代细胞应用于皮肤重建与再生的相关研究.     

Matrigel对羊水间充质干细胞成组织能力的影响

目的 研究Matrigel对羊水间充质干细胞在裸鼠皮下成组织能力的影响.方法 将羊水间充质干细胞与Matrigel混合,注入裸鼠皮下,14 d后观察新生物的形态外观和组织结构.并以不混合Matrigel的羊水间充质干细胞注入裸鼠皮下作为阴性对照,单纯Matrigel注入裸鼠皮下作为空白对照.结果 实验组和阴性对照组在裸鼠皮下均形成一长圆形瘤样组织,其形态外观基本一致,但组织结构有明显差异,在实验组组织血供丰富,主要为腺样结构,部分含管腔,向平滑肌细胞,上皮细胞和幼稚神经细胞分化.在阴性对照组血供较少,细胞呈单一平铺排列,未观察到明显组织结构,细胞未分化.空白对照组无新生组织形成.结论 MatrigeI能促使羊水间充质干细胞在裸鼠皮下向成熟的组织细胞分化并形成简单的腺样组织结构.     

脂肪来源干细胞的多向分化性及其在组织工程中的应用

近期研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）可以从脂肪组织获得,这类细胞被称为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）。ADSCs与骨髓来源MSC具有相似的多向分化性,并且存在容易获取、取材创伤小和细胞获得量大等优点,因此有望成为组织工程中另一种很有前景的种子细胞来源。本文介绍了ADSCs多向分化性的最新研究进展,以及在各种组织工程中的应用情况。     

骨髓间充质干细胞培养并向骨骼肌诱导分化的实验研究

目的 研究大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的定向分化及其在体内的形态发育情况。方法 Wistar大鼠24只，向其左胫前肌处注射0．2ml无水乙醇，致其无菌坏死，右胫前肌注射等渗盐水0．2ml作为对照，制成动物模型后备用；取大鼠第3代BMSCs，5-氮杂胞苷、成肌调节因子（MyoD）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）联合进行诱导分化。诱导后第9天，收集BMSCs，用BrdU标记并诱导后注射到大鼠双下肢胫前肌处，分别在3，6，9和12d取材进行形态观察和免疫组织化学检查。结果 注射诱导后3d，实验组的成活率明显高于注射单纯注射BMSCs的对照组，BrdU标记细胞向骨骼肌分化，结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白均为弱阳性表达，6，9d可见BrdU标记细胞向骨骼肌分化，结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白阳性表达，第9天更为明显，注射后12d后可见新生骨骼肌细胞形成肌小管，细胞核结蛋白、骨骼肌特异肌球蛋白强阳性表达。结论 大鼠损伤肌肉的微环境中，BMSCs可向骨骼肌定向分化，并伴有结蛋白和骨骼肌肌球蛋白阳性表达；定向诱导后BMSCs在体内成活率高，增殖速率快，向骨骼肌分化纯度更高。     

SD大鼠神经干细胞培养鉴定实验研究

为探讨从SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质分离并鉴定神经干细胞的可行性 ,以从上述部位分离的细胞作为种子细胞来源 ,在本实验室特制“CYTOKINE·神经干细胞培养基”中进行了神经干细胞培养诱导 ,单细胞连续传代培养 ,并分别以Nestin、NSE及GFAP免疫抗体鉴定神经干细胞、神经元和神经胶质细胞。结果发现 ,4种来源的组织细胞在相应培养条件下均有神经干细胞快速增殖 ,并有由多细胞组成的神经球形成 ,经鉴定 ,该细胞球表达特殊的胚胎神经干细胞Nestin抗原 ;进一步将这些细胞球分离成单细胞并重新以克隆密度进行培养 ,单个的细胞又很快形成神经球。对神经干细胞进行连续培养或加血清传代培养可使其进一步分裂增殖 ,有小芽形成并发育成突起、建立神经纤维联系 ,其中有的胞体增大 ,逐渐发育为较成熟的长突起细胞 ,长突起相互连接 ,交织成网 ,经鉴定为神经元及神经胶质细胞。 4种组织来源的细胞中所含有的干细胞数量不同 ,胎鼠较成年鼠更富含神经干细胞 ,室管膜或脑室下区所含神经干细胞较皮质更丰富 ,皮质来源的神经干细胞和室管膜来源的神经干细胞在形态学和分化程度上无特殊区别。该结果提示 ,SD胎鼠室管膜、皮质以及SD成年大鼠脑室下区、皮质 4种组织来源的细胞均含有神经干细胞 ;神经干     

人诱导多能干细胞体外多向分化能力的方法验证

 目的 探讨人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)体外多向分化能力的方法。方法 iPSC通过形成拟胚体(embryonic body, EB)的阶段,将其诱导为间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)样细胞,倒置显微镜下观察诱导过程中细胞形态的变化,流式细胞术检测iPSC来源的MSCs(iPS-MSCs)表面标志物的表达,并进一步将iPSC-MSC诱导为成骨、软骨细胞;或直接EB接种,将其诱导成神经细胞。通过上述方法验证iPSC的多向分化能力。结果 诱导后的 iPSC-MSC 逐渐向外生长变为长梭形; CD29、CD105在 iPSC -MSCs 中表达阳性, 而 CD34、CD45则为阴性; 碱性磷酸酶、甲苯氨兰染色结果表明iPSC -MSCs 具有成骨、成软骨的能力;iPSC亦可直接从EB阶段诱导成神经细胞。结论 通过上述方法,可成功诱导iPSC 为成骨、成软骨、成神经细胞,为 iPSC进一步的研究与应用提供了技术基础。     

人羊膜不同位置上皮细胞的类胚胎干细胞性质差异研究

目的了解足月人羊膜上皮不同位置上皮细胞在类胚胎干细胞性质方面的异质性。方法分层消化收集人羊膜上皮近表层与近基底层细胞,运用流式细胞术、免疫荧光、免疫组织化学等方法观察测定其干细胞表面抗原及分子标记物Nanog、Oct4、Sox2、SSEA1、SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81、CD73的表达情况;同时将足月人羊膜全层及经胰酶消化去上皮后的人羊膜行组织学染色,测定SSEA3、TRA1-60、TRA1-81表达情况。结果人羊膜上皮近基底层细胞表达Nanog、Oct4、Sox2、SSEA3、SSEA4、TRA1-60、TRA1-81普遍高于近表层细胞;表达SSEA4最强、最显著的细胞主要为较小的近圆形细胞,分布于羊膜上皮近基底层处。结论人羊膜上皮不同位置细胞的干细胞特性不同,近基底层细胞比近表层细胞具有更强的类胚胎干细胞性质,因而有望成为临床干细胞的来源。     

悬滴培养对人脂肪间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨悬滴培养对人脂肪来源间充质干细胞(hADSCs)成骨诱导分化的影响。方法利用酶消化法分离培养hADSCs,采用流式细胞术检测其表面标志的表达。对hADSCs进行悬滴培养,贴壁后添加诱导剂对其进行成骨诱导分化,以平板培养组为对照,诱导分化7d及21d时,利用RT-PCR检测成骨基因Runx2及Osteopontin的表达。结果分离培养的hADSCs表达干细胞表面标志CD44、CD90、CD105,不表达CD34、CD45;悬滴培养3d的hADSCs可形成大小均一的球状三维结构;RT-PCR结果表明,在成骨诱导分化的不同时间点,hADSCs悬滴培养组的成骨基因Runx2及Osteopontin表达均比平板培养组高,表明悬滴培养可促进hADSCs的成骨诱导分化。结论悬滴培养有利于hADSCs的成骨诱导分化,有助于提高其成骨诱导效率。     

人骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定及标记

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养、鉴定和标记的方法以及生物学特性。方法无菌条件下穿刺人髂后上嵴抽取骨髓,采用直接贴壁法分离纯化hMSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的hMSCs进行鉴定,同时检测第3代和同代溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2’-deoxyuridine,BrdU)标记的hMSCs细胞周期。结果体外培养的原代hMSCs在培养24小时内可见少量贴壁细胞,7天达到融合,免疫细胞化学示CD44和CDl05表达阳性,CD34表达阴性,流式细胞仪示CD44阳性率为89．64％,CD34为0．11％。大部分hMSCs核抗BrdU染色阳性,阳性率达90％。细胞周期显示第3代和同代BrdU标记的hMSCs约有90％的细胞处于G0／GI期,第10代为80％。结论hMSCs在体外很容易分离培养和扩增,但随着传代次数的增加,hMSCs变得宽大扁平且增殖速度减慢,出现衰老现象;用BrdU标记hMSCs对其细胞周期无明显影响,可作为标记细胞的一种有效手段。     

miRNAs在人骨髓间充质干细胞中的表达

目的观察miRNAs在人骨髓间充质干细胞(MSC)中的表达情况。方法以从骨髓中分离培养的人骨髓MSC为实验对象,分离提取细胞内小片段RNA(≤200nt),经多聚腺苷酸化和5'连接子连接后进行反转录,扩增克隆到得到大约109bp的DNA片段,测序后经生物信息学分析确定miRNAs的表达情况。选取部分miRNAs和新发现miRNAs,合成相应探针,与从人骨髓MSC、人成骨肉瘤细胞系SOSP-9607和大鼠成骨肉瘤细胞系UMR-106中分离出的小片段RNA进行杂交验证(Northernblot)。结果成功从骨髓中分离培养出骨髓MSC,流式细胞仪检测93%以上的MSC表达CD44,但不表达CD34、CD45。从MSC中克隆测序得到194个克隆体,经生物信息学分析发现52个miRNAs(27种),其中包括26种已知的miRNAs和1种Nature杂志预测的miRNAs(PRE-DICTED-miR-202)。选取4条miRNAs(miR-495、miR-34a、miR-17-5p和PREDICTED-miR-202)进行Northernblot验证,发现它们均在MSC中表达。其中miR-34a和PREDICTED-miR-202只表达于MSC,miR-495在MSC和SOSP-9607中表达,miR-17-5p在3种细胞中均有表达。结论筛选出了在人骨髓MSC中表达的miRNAs,为miRNAs参与调控MSC的自我更新提供了依据,同时为miRNAs在干细胞中的潜在应用奠定了基础。     

锶对人骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的影响

目的观察锶(Sr)对人骨髓间充质干细胞(hMSCs)增殖及成骨分化的影响并探索其最佳作用浓度。方法抽取健康成年志愿者骨髓6ml,体外分离、培养原代hMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型。取第4代细胞进行实验,共分为5组,A组为空白对照,培养液中仅加入骨诱导剂(地塞米松10-8mol/L、抗坏血酸50μg/ml、β-甘油磷酸钠10mmol/L,B、C、D、E组培养液在加入骨诱导剂后分别加入3.75×10-3、3.75×10-2、3.75×10-1、3.75mmol/L的SrCl2。定期测定各组hMSCs的增殖情况(MTT法)、碱性磷酸酶(ALP)活性(酶标法)和骨钙素(OCN)含量(放免法),并观察细胞茜素红钙结节染色情况,分析各组钙结节数量及面积。结果随培养时间延长,各组细胞增殖和成骨分化均明显提高(P<0.01)。组间比较显示,第7天时的细胞增殖水平,第7、14天的ALP活性,第14、21天的OCN含量以及第21天的茜素红钙结节数量和面积测定结果,B-E组均明显优于A组(P<0.05);D、E组第7天时的细胞增殖水平及第14天的ALP活性均明显高于A、B、C组(P<0.05),而D组与E组比较无显著差异(P>0...     

猴骨髓间充质干细胞的分离及原代培养特性的研究

目的：探讨猴骨髓间充质干细胞(MSCs)低分化干细胞方面的特性。方法：以Percoll(质量密度1073g/L)非连续密度梯度离心分离出骨髓悬液中的骨髓间充质干细胞，用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液培养，观察细脑的形态、生长状况及其超微结构。结果：原代培养的骨横间充质干细胞增殖缓侵，细胞增殖率和形态分化不均一。如有一些细脑在4wk的培养时间内末见明显增殖，这些增殖不明显的细胞有的未见明显的伸展，呈圆形，有的伸展充分，成片状；在培养2wk后也可见一些明显增殖的细胞，分别形成克隆团状或条状的增生细胞群；培养过程中可见有神经元样及多核细胞出现。原代培养的骨髓间充质干细胞的超微结构也显示了低分化的干细胞特点，如细胞表面具有微绒毛，脑浆内内质网丰富、激离核糖体数量多、线粒体小，核仁大而不规则、可见核裂，超微结构还显示了一些中胚层来源于细瘤的结构特点，如大量的微丝。结论：经Percoll细胞分离介质分离出的骨髓间充质干细胞，在非诱导条件下原代培养过程中，从形态分化、增殖率等方面显示了其多向分化潜能；从超微结构等方面显示了其中胚层来源低分化细胞的特点。这些特点可作为骨髓间充质干细胞鉴定的佐证之一，说明Percoll非连续密度梯度离心法对骨髓间充质干细胞的分离具有可靠性。     

大鼠肝干细胞体外诱导分化的实验研究

目的 分离成体大鼠肝干细胞,观察体外培养条件下肝干细胞分化为肝细胞和胆管细胞的过程以及形态学变化.方法 采用AAF/PH肝干细胞刺激模型,通过胶原酶Ⅳ分步消化分离和Percoll梯度离心纯化的方法得到肝干细胞,联合应用地塞米松、DMSO和EGF、HGF、SCF等生长因子诱导肝干细胞增殖并分化为肝实质细胞.结果 分离得到的肝干细胞呈卵圆型,直径是肝细胞的1/4～1/6,免疫荧光检测显示其表达c-kit和OV6两种干细胞抗原,PCR分析显示其表达CK19和白蛋白mRNA.体外诱导培养条件下细胞首先分化成大而圆的成熟肝细胞,继而出现分支样的胆管细胞,而且可见从卵圆形细胞到成熟肝细胞的中间变化过程.结论 新分离的肝干细胞同时表达c-kit、OV6、CK19和白蛋白多种抗原,诱导分化条件下可见从体积较小的卵圆形肝干细胞到体积大许多倍的肝细胞的形态学变化过程.     

人胚胎骨髓间充质干细胞的分离与鉴定

目的：摸索分离和鉴定高纯度的人胚胎骨髓间充质干细胞。方法：采用密度梯度离心法，分离含有间充质干细胞的人胚胎骨髓细胞悬液，获得人胚胎骨髓间充质干细胞。用流式细胞仪检测获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量。结果：获得的细胞中人胚胎骨髓间充质干细胞含量达85％。结论：密度梯度离心法分离获得的人胚胎骨髓间充质干细胞纯度高。