应用发根农杆菌Ri T-DNA建立菘蓝的毛状根优质株系和植株再生系统

目的：建立菘蓝（Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ）的毛状根离体培养系统,并诱导毛状根再生植株。方法：分别用发根农杆菌Ａ４,Ｒ１６０１和ＡＴＣＣ１５８３４三种菌株感染菘蓝的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系;测定了毛状根的生长曲线;在含不同激素的培养基上诱导毛状根再生植株;利用高压纸电泳法对毛状根和再生植株进行Ｔ－ＤＮＡ转化的检测。结果：首次利用发根农杆菌Ａ４,Ｒ１６０１和ＡＴＣＣ１５８３４三种菌株成功地从菘蓝中诱导出毛状根;菘蓝毛状根在含ＢＡ的ＭＳ培养基中成功地诱导出再生植株;经高压纸民泳检测,菘蓝毛状根及其再生植株中均含有甘露三,表明Ｒｉ质粒的Ｔ－ＤＮＡ已整合进毛状根和再生植株中。结论：菘蓝毛状根离本培养和植株再生系统的建立,为进一步进行药用活性成分的工业化生产和引入外源基因改良性状奠定了基     

四倍体菘蓝毛状根培养系统的建立及外界因子对其生长的影响

用发根农杆菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ Ｒ１６０１,Ａ４,ＡＴＣＣ１５８３４菌株感染菘蓝Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ,同源四倍体的子叶１０ｄ后,在子叶切口处均能陆续长出毛状根。转化根在不含激素的ＭＳ固体培养基上快速生长并表现出典型的毛根性状,经冠瘿碱分析证明确已被转化。建立了毛状根培养系统并比较了各种外界因子生长的影响。     

远志毛状根诱导及其3,6’-二芥子酰基蔗糖酯测定

目的从远志诱导出毛状根,并检测其寡糖酯类成分的产生。方法应用发根农杆菌A4、R1600和R1000菌株分别感染远志外植体,采用高效液相色谱(HPLC)法检测诱导出的毛状根中3,6’-二芥子酰基蔗糖酯的含量。结果 3种发根农杆菌均能诱导远志外植体产生毛状根,且毛状根中都检测到3,6’-二芥子酰基蔗糖酯,A4菌株诱导远志下胚轴产生的毛状根的3,6’-二芥子酰基蔗糖酯含量高于R1600和R1000菌株(F=5 066.792,P<0.05)。结论用远志毛状根培养物生产寡糖酯类成分是一条值得探索的新途径。     

粟米草毛状根的研究

目的：建立粟米草（Ｍｏｌｌｕｇｏ ｐｅｎｔａｐｈｙｌｌａ Ｌ．）的毛状根培养系统并研究毛状根的生长特性。方法：分别用发根农杆菌Ｒ１６０１,ＡＴＣＣ １５８３４和Ａ４感染粟米草无菌苗的子叶,获得毛状根,并筛选优质株系;用高压纸电泳法对毛状根进行甘露碱检测;测定其生长曲线;比较不同基本培养液、不同ｐＨ 值对毛状根生长的影响。结果：高压纸电泳结果显示,所获毛状根中均含有甘露碱,表明毛状根中确已转入发根农杆菌的Ｔ－ＤＮＡ;１／２ ＭＳ０培养液ｐＨ ５．４～５．８最适合粟米草毛状根的生长。结论：快速生长的粟米草毛状根在药用活性成分的生产上将具有较大潜力。     

毛状根培养在药用植物中的应用概况

1982年Chilton报道在发根农杆菌侵染植物的过程中,在感染部位上或附近能产生大量副产物——发状根。这种发状根又称毛状根,毛状根是由发根农杆菌含有的Ri质粒引起的。发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhi-zobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)一类革兰     

Ri质粒介导药用植物的研究进展

发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(Agrobacterium)一类革兰氏阴性土壤农杆菌，可以侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物，甚至是裸子植物而诱发植物产生毛状根。近30年来，人们逐渐认识到产生这一现象的本质是发根农杆菌携带的Ri质粒侵染植物而使其产生毛状根。     

发根农杆菌诱导广藿香毛状根的研究

目的 筛选诱导广藿香毛状根的最佳条件,建立广藿香毛状根诱导体系,并以此体系作为下一步研究的基础.方法 采用共培养法,用发根农杆菌ATCC15834和C58C1,经预培养、侵染、共培养和除菌操作诱导广藿香外植体产生毛状根.结果 预培养时间为2d,乙酰丁香酮质量浓度为15 mg/L,侵染时间为25 min,共培养时间为2d,发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导率均达到最高,分别为83.3％和80.5％;PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根的基因组中整合及表达,说明广藿香毛状根已经被成功诱导.结论 成功诱导并建立了广藿香毛状根诱导体系.     

何首乌毛状根培养及大内酚的含量测定

目的 测定何首乌毛状根中大黄酚的含量。方法 用发根农杆菌Ri 15834菌株感染何首乌茎、叶外植体,均可诱导出毛状根,并能合成大黄酚,采用薄层扫描法测定毛状根中大黄酚。结果 毛状根中大黄酚的含量为0．0164％。结论 该毛状根具有典型的毛状根形态特征,大黄酚含量低于何首乌药材。     

发根农杆菌Ri T—DNA对墨旱莲的遗传转化

目的 建立墨旱莲Eclipta prostrata的毛状根离体培养系统。方法 分别用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株感染墨旱莲的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系,测定了毛状根的生长细线;利用高压纸电泳法对毛状根进行-DNA转化的检测。结果 首次利用发根农杆菌A4,R1601,ATCC15834 3种菌株成功地从墨旱莲中诱志出毛状根;经高压纸电泳检测,墨旱莲毛状根中含有甘露碱,表明Ri质粒的T-DNA已整合进毛状根中。结论 墨旱莲毛状根离体培养的建立为进一步进行药物活性成分的工业化生产奠定了基础。     

短葶飞蓬毛状根的诱导及黄酮类成分测定

目的通过诱导培养短葶飞蓬毛状根产生有用次生代谢产物。方法利用发根农杆菌C58C1感染短葶飞蓬无菌苗叶盘诱导毛状根,小量提取脱农杆菌完全的毛状根DNA用于rol基因的PCR检测,经PCR检测阳性的毛状根采用4种不同液体培养基振荡扩大培养,对于获得的毛状根系测定其中总黄酮和灯盏花素的量。结果发根农杆菌感染10min共培养2d可取得较好的转化效果,继代培养约两个月后可脱菌完全,获得的毛状根PCR检测阳性率为52.9%,4种液体培养基中B5培养基更适合于毛状根的生长,毛状根中总黄酮量要明显高于正常根中的量,但灯盏乙素的量明显低于正常根中的量。结论通过短葶飞蓬毛状根大量培养可获取灯盏黄酮类药用成分。     

菘蓝不同栽培居群的等位酶分析

目的：对菘蓝Ｉｓａｔｉｓ ｉｎｄｉｇｏｔｉｃａ Ｆｏｒｔ,不同栽培居群进行等位酶分析研究。方法;在全国各地采集菘蓝１３个二倍体栽培居群的种了,异地栽培于上海市崇明岛同一块试验田。以水平切片淀粉凝胶电泳方法,对菘蓝等位酶多态性进行研究,分析了８个酶系统的１５个等位酶位点。结果：等位酶多态位点陌分为１３．３％～３３．３％,每个位点的位基因平均数Ａ为１．１～１．５,预期杂合度Ｈｅ为０．０２７～０．１００     

天山大黄发根培养物中蒽醌化合物的产生

目的：探索用发根培养法生产植物次生代谢物的途径。方法：用发根农杆菌Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ９４０２所含Ｒｉ质粒遗传转化药用植物天山大黄以诱导发根用纸电泳法检测发根中冠瘿碱的存在；用高效液相色谱法测定发根中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素、大黄素甲醚、大黄酚８甲醚等游离蒽醌化合物的含量。结果：诱导出了天山大黄发根，并建立了发根离体培养系；从发根中检测到甘露碱、农杆碱的存在；定量分析发现，天山大黄发根中含有多种蒽醌类成分，其中大黄酸、芦荟大黄素、大黄素、大黄酚８甲醚的含量分别高于原植物根中的含量。结论：天山大黄发根能产生与原植物药用部位种类相似的化学成分     

中药菘蓝过氧化物同工酶的测定

目的:对菘蓝不同器官的POD同工酶进行分析测定。方法:采用聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳。结果:菘蓝的POD同工酶酶谱具有一定的器官特异性和稳定性。结论:同工酶变化与生物的生长发育之间具有特异性关系,可为生物生长发育的调控研究提供参考。     

Effect of sucrose and potassium nitrate on biomass and saponin content of Talinum paniculatum Gaertn. hairy root in balloon-type bubble bioreactor

Objective:To increase biomass and saponin production in hairy root culture of Talinum paniculatum Gaertn.(T.paniculatum)in balloon-type bubble bioreactor(BTBB).Methods:Hairy roots which were collected from leaf explants of T.paniculatum were infected by Agrobacterium rhizogenes strain LB510.The hairy roots were cultivated at400 m L Murashige and Skoog liquid medium without growth regulator(MS0)in1 000 m L BTBB.Each BTBB had 2 g hairy roots as initial inoculum and these cultures were treated with various concentrations of sucrose(3%,4%,5%,6%w/v)and potassium nitrate(0.5,1.0,1.5 and 2.0 strength of MS medium).Cultures were maintained for 14days.Fresh and dry weights of hairy roots at the end of culture were investigated.Results:Various concentrations of sucrose influenced the biomass accumulation of hairy roots.Maximum biomass was reached by MS medium supplemented with 6%sucrose and it was approximately threefold higher than control.Culture supplemented with potassium nitrate at 2.0 strength of MS0 could increase biomass accumulation of hairy roots until 0.14 g dry weight and it was almost threefold higher than control.However,the maximum saponin content was obtained by MS medium supplemented with 5%sucrose and 2.0 strength potassium nitrate of MS.Conclusions:Based on this research,those conditions can be used to produce biomass and saponin of hairy root of T.paniculatum in the large scale.     

药用植物商陆毛状根培养系统的建立

目的:建立药用植物商陆(Phytolacca acinosa Roxb.)的毛状根离体培养系统.方法:分别用发根农杆菌A4、R1600、C58C1 3个菌株感染商陆的子叶外植体,获得毛状根,并筛选了优质株系;考察了影响毛状根生长的因素;测定了毛状根的生长曲线;利用PCR和高压纸电泳法对毛状根进行tDNA转化的检测.结果:利用发根农杆菌A4、R1600、C58C1 3种菌株成功地从商陆中诱导出毛状根;以水解酪蛋白为氮源、以麦芽糖为碳源最有利于商陆毛状根的生长;毛状根的生长曲线呈"S"形,24 d时质量达到最大(增长18倍);PCR及高压纸电泳检测结果表明Ri质粒的tDNA已整合进毛状根中.结论:成功建立了商陆毛状根离体培养系统,为进一步进行药用成分的工业化生产和引入外源基因改良性状奠定了基础.     

植物表达载体在三分三发根中的高效表达

目的建立基于发根培养的三分三Anisodus acutangulus遗传转化体系及在三分三发根中表达外源基因的方法。方法由种子直接萌发得到无菌苗,建立了三分三的无菌苗培养系统。将植物高效表达载体pCAMBI-A1304 导入经过“disarmed”改造的根癌农杆菌C58C1(携带pRiA4质粒),获得了携带外源基因表达载体的重组C58C1工程菌。取生长良好的幼嫩真叶作为外植体,在乙酰丁香酮的诱导下用重组C58C1进行感染,诱导发根。选取在无激素培养基上生长迅速,分支多的发根单克隆进行继代培养。经过3次继代培养,PCR(polymerase chain reaction,聚合酶链式反应)检测用于验证发根型质粒pRiA4和表达型质粒pCAMBIA1304 是否整合到三分三发根基因组内。结果建立了基于发根培养的三分三遗传转化体系,发根诱导频率达到100%,PCR检测表明pRiA4和pCAMBIA1304 质粒共转化率达到32%。结论该方法可以用于在三分三发根中高效表达外源基因,为实现基于发根的三分三产托品烷类生物碱的代谢工程奠定了基础。     

四倍体菘蓝转抗虫基因研究Ⅱ.转半夏凝集素基因菘蓝的分子生物学检测

目的 获得转基因菘蓝的分子生物学证据。方法 对经卡那霉素筛选的抗性再生菘蓝苗进行聚合酶链式反应(PCR)，Southern杂交和RT—PCR检测。结果 PCR和Southern杂交检测结果表明，外源半夏凝集素基因已经整合到转基因菘蓝的基因组中，RT—PCR结果表明其DNA可以正常转录成mRNA。结论 可以利用农杆菌介导的基因转化技术培育抗虫的菘蓝新品系。     

异地栽培大青叶和原栽培品种的抗内毒素作用比较

比较异地栽培后的大青叶和其原栽培品种的抗内毒素作用,结果显示生态环境改变后,大青叶仍能保持其原栽培品种品质;不同居群大青叶在药理活性方面的差异也不因生态环境的趋同而丧失。表明大青叶是一类种质主导型的药材,环境因素对药材品质的形成不起主要作用。