应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒核心启动子结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(core promoter)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体表面展示技术,以HBV核心启动子的聚合酶链反应产物作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果 噬菌体经富集后,从随机筛选的20个克隆中得到6个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了和HBV核心启动子结合的肝细胞蛋白——羧肽酶N(CPN)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HBV核心启动子的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV的复制机制创造了新的途径。     

应用噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原基因启动子Ⅱ结合蛋白

目的 通过筛选乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原基因启动子Ⅱ(SPⅡ)结合蛋白,为HBV复制机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术,以HBV的表面抗原基因启动子Ⅱ的聚合酶链反应(PCR)产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后,从随机筛选的20个克隆中得到4个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性分析,确定了和HBV SPⅡ结合的肝细胞蛋白——尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶4(NADHDH4)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HBV SPⅡ的结合蛋白,分析了该蛋白的编码基因,为进一步研究HBV的复制、转录、调节机制开辟了新的徐径。     

噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X抗原基因启动子DNA结合蛋白

目的筛选乙型肝炎病毒（HBV）X抗原基因启动子（Xp）DNA结合蛋白,为HBV复制机制研究探索新的途径。方法应用噬菌体展示技术,以HBV-Xp的PCR产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果噬菌体经富集后,从随机筛选的30个克隆中得到17个阳性克隆,成功构建了克隆载体。经测序分析及序列比对,最后得到5种已知基因编码蛋白（人血白蛋白、还原型烟酰胺二核甘酸脱氢酶亚型4、激肽酶原、泛素特异性蛋白酶10、睾丸增强因子转录子）和9种未知功能基因序列。结论从噬菌体人肝cDNA文库筛选得到多种具有不同生物学功能的蛋白,与HBVX抗原基因启动子具有结合作用。     

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A结合蛋白

目的 筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白,为HCV致病机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术,以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子,对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后,从随机挑选的12个克隆中得到2个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过序列同源性分析,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白-丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶5(MAPKAPK5)。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白,为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础。     

噬菌体展示技术筛选诱导型NOS基因启动子DNA结合蛋白的研究

目的筛选诱导型一氧化氮合酶(iNOS)基因启动子DNA结合蛋白。探索iNOS基因的表达调控机制。方法应用生物信息学方法确定iNOS基因启动子序列，以PCR扩增iNOS基因启动子DNA片段，构建真核报告载体pcAT3-iNOSp，并转染HepG2细胞系，用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性以明确所得到的DNA片段具有启动子活性；以iNOS基因启动子片段作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附一洗脱一扩增”富集过程，噬斑裂解液PCR扩增后，进行【)NA序列分析和蛋白质同源性生物信息学搜索。结果pCAT3-iNOSp瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的4．2倍，说明所得到的DNA片段具有启动子活性；噬菌体经富集后，筛选出12个阳性克隆，成功获得了iNOS基因启动子的DNA结合蛋白编码序列。结论所构建的iNOS基因启动子具有顺式激活下游基因表达的作用；筛选得到的iNOS启动子DNA结合蛋白对于研究iNOS基因的转录调节机制具有重要意义。     

用T7噬菌体展示系统筛选与晚期糖基化终产物受体胞内段相结合的蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选在细胞内与晚期糖基化终产物受体(RAGE)结合的蛋白。方法 以重组RAGE为靶蛋白,用谷胱甘肽亲和树脂为介质,筛选T7人肺cDNA文库。结果 筛选6轮后选择64个噬菌体单个噬斑克隆,经EDTA处理后利用特异性PCR引物扩增插入片段,回收PCR产物并进行测序,将所得到的序列用BLAST软件搜索GenBank中的同源序列,得到了25个编码蛋白的序列。结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选新的结合蛋白的一种简单、快速和有效的手段,所筛选的与RAGE胞内段相互作用的蛋白对进一步研究其信号转导通路的复杂功能和调节机制提供了很好的靶点。     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5''''端调控序列功能分析

目的克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析.方法以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据,设计并合成D123/D61和D81/D84 两对引物,同时从猪肝中提取猪基因组DNA,并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针,对猪λ噬菌体文库进行筛选.经过4轮杂交和PCR交替筛选,从噬菌体文库中共获得4个基因片段,并对这4个片段进行测序、拼接.以绿色荧光蛋白作为报告基因,对猪血清白蛋白启动子在HepG2细胞中的表达进行研究.结果共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35 kb(GenBank登录号AY663543).将其与人的血清白蛋白基因相比对,发现基因的同源性为53.8%,其中编码区同源性为82.3%.荧光显微镜下可见EGFP在HepG2细胞中的表达.结论获得猪血清白蛋白全基因.猪血清白蛋白基因启动子在HepG2有转录起始功能.此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础,另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料.     

基孔肯雅病毒中和表位的筛选及表达

目的:寻找基孔肯雅病毒中和表位,并将其表达为重组融合蛋白.方法:对噬菌体展示12肽库进行了生物淘洗,随机挑取噬菌体克隆,使用 ELISA方法筛选并鉴定阳性克隆,分析阳性克隆的DNA序列,将其翻译成氨基酸序列进行同源性比较.将其中一个表位连同M13噬菌体PⅢ蛋白结构域Ⅰ～Ⅱ的编码序列用PCR技术扩增后插入原核表达载体pQE30,用IPTG诱导融合蛋白表达.结果与结论:从经过3轮淘洗的噬菌体中随机挑选123个克隆,从中筛选到20个阳性克隆,其中包含7种不同的氨基酸序列,这些序列缺乏同源性,表明该单抗表位应为构象型表位.在室温培养条件下成功地在大肠杆菌周质腔表达了一种可溶性的表位融合蛋白,经亲和层析得到了纯化的表位融合蛋白.     

猪血清白蛋白基因的克隆及其5′端调控序列功能分析

目的：克隆猪血清白蛋白全基因并对其5′端调控序列的转录功能进行分析。方法：以GenBank公布的猪血清白蛋白基因启动子序列和cDNA序列为依据，设计并合成D123／D61和D81／D84两对引物，同时从猪肝中提取猪基因组DNA，并以此为模板PCR扩增猪血清白蛋白部分基因片段作为噬菌斑原位杂交探针，对猪λ噬菌体文库进行筛选。经过4轮杂交和PCR交替筛选，从噬菌体文库中共获得4个基因片段，并对这4个片段进行测序、拼接。以绿色荧光蛋白作为报告基因，对猪血清白蛋白启动子在Hep(泛细胞中的表达进行研究。结果：共获得包括调控区在内的猪血清白蛋白全基因序列约35kb(GenBank登录号：AY663543)。将其与人的血清白蛋白基因相比对，发现基因的同源性为53.8％，其中编码区同源性为82．3％。荧光显微镜下可见EGFP在HepC2细胞中的表达。结论：获得猪血清白蛋白全基因。猪血清白蛋白基因启动子在HepC2有转录起始功能。此项工作一方面为利用基因打靶从猪体内制备生产人血清白蛋白的研究奠定了良好基础，另一方面为利用白蛋白启动子研究外源基因在肝组织的特异性表达及进行基因治疗提供了资料。     

应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白抗原模拟表位

为筛选丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（core)特异性噬菌体12肽模拟表位，应用噬菌体表面展示技术，以抗－HCV核心蛋白抗原的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工化学合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程，随机挑取50个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定，并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV核心抗原的模拟表位。经免疫学鉴定后，从随机筛选的50个克隆中确定10个阳性克隆，进行DNA序列测定，确定氨基酸序列XRQXXPXXXHXX为HCV核心的模拟表位。本实验为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

人肝再生增强因子的cDNA克隆与序列分析

利用大鼠肝再生增强因子核苷酸序列，从人胎肝ｃＤＮＡ文库中筛选到人肝再生增强因子ｃＤＮＡ克隆，该克隆含有１．５ｋｂ的外源插入片段，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核苷酸序列测定表明含３７５ｂｐ的读码框架，能编码１２５个氨基酸的蛋白质；与大鼠肝再生增强因子相比，核到序列同源性达８７％，氨基酸序列同源性达８４．８％。     

构建人补体膜辅助调节蛋白真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH 3T3细胞

目的：构建人补体膜辅助调节蛋白（membrane cofactor protein，MCP）真核表达载体并利用壳聚糖（Chitosan）转染小鼠NIH 3T3细胞。方法：应用PCR方法，从MCP-pGEM-T Easy Vector克隆相关的DNA序列，插入到具有相应酶切位点的真核表达载体pSecTag2／HygroB中，构建pSecTag2／HygroB-MCP真核表达质粒，并进行酶切鉴定及序列测定；利用壳聚糖包裹质粒，转染小鼠NIH 3T3细胞，并对转染细胞进行抗MCP免疫组织化学染色。结果：MCP基因大小为1065bp，与Genebank中记载的人MCP cDNA序列结果基本一致；抗MCP免疫组织化学染色显示转染细胞胞浆弥漫阳性。结论：成功构建了人MCP真核表达载体并通过壳聚糖介导转染NIH3T3细胞，为进一步探讨及研究转基因肝脏奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术筛选XTP4蛋白反式调节基因

目的 筛选、克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg）反式激活基因XTP4转染肝癌细胞后的反式调节基因,探索XTP4基因表达对肝细胞基因表达谱的影响。方法 常规的分子生物学技术构建真核表达载体peDNA3．1(-)-XTP4,应用抑制性消减杂交(SSH)技术对重组表达质粒peDNA3.1(-)-XTP4转染的HepG2细胞和空载体转染的相同细胞差异表达的mRNA进行研究,将富集的二次PCR产物与T／A载体连接,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 消减文库扩增后得到21个阳性克隆,PCR分析显示其中16个克隆含有200～1000bp的插入片段。对插入片段进行测序及生物信息学分析,结果共获得9种蛋白编码基因。这些差异表达的基因与肝细胞纤维化形成、肿瘤发生、线粒体氧化还原代谢、细胞生长调节密切相关。结论 应用SSH技术成功筛选了XTP4对肝癌细胞的反式调节基因,为进一步阐明HBxAg对肝细胞蛋白的反式调节作用提供了理论依据。     

人脑胶质瘤中cyclin B1的表达及其与细胞增殖活性的关系

目的研究人脑胶质细胞瘤中细胞周期素B1(cyclin B1)的表达水平,及其胶质瘤细胞增殖活性的关系。方法采用SABC免疫组化方法检测62例人脑胶质瘤和14例正常脑组织标本中cyclinB1和增殖细胞核抗原(PCNA)的表达水平,观察并对比各病理等级中表达水平。结果cyclin B1在正常脑组织中表达率为7.1%(1/14),其阳性率和平均标记指数随着胶质瘤病理分级的增高而明显升高(P<0.05)。双元相关性分析发现cyclin B1与PCNA的表达呈显著正相关(Pearson相关系数r=0.576,P<0.01)。结论人脑胶质瘤中cyclin B1的表达与病理学分级和肿瘤细胞增殖活性关系密切,可能是肿瘤恶性增殖的促进因素。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5A（HCV NS5A）反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，克隆HCV NS5A蛋白反式激活相关基因。以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(－）-NS5A转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1(－）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，经RsaI酶切后，将实验组cDNA分成两组，分别与两种不同的接头衔接，再与对照组cDNA进行消减杂交及两次抑制性PCR，将产物与T／A载体连接，构建cDNA消减文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到121个阳性克隆，经菌落PCR分析，得到115个200－1000bp的插入片段，对其中的90个片段测序，并进行同源性分析，显示31种在基因编码蛋白和15种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示，成功构建了HCV NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，该文库的建立为进一步阐明HCV NS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。