白细胞介素12和共刺激分子B7-1联合修饰肿瘤细胞疫苗诱导抗肿瘤免疫治疗的实验研究

目的　探讨经白细胞介素 1 2 (IL 1 2 )和共刺激分子 (costimulatorymolecule)B7 1 基因联合修饰的肿瘤细胞疫苗诱导机体抗肿瘤免疫反应 ,对大鼠卵巢上皮癌腹腔转移瘤的治疗效果。方法采用酶切、去磷酸化、连接、重组的方法 ,构建携带B7 1 基因的逆转录病毒表达载体pLmB7 1 SN ,以脂质体介导法 ,建立高表达细胞株NuTu 1 9/B7 1 、NuTu 1 9/IL 1 2及双基因联合表达细胞株NuTu 1 9/IL 1 2 B7 1 ,并以转染空载体pLXSN的细胞NuTu 1 9/Neo为对照组。观察各组细胞在大鼠体内的致瘤性 ;将经丝裂霉素C处理的各组肿瘤细胞 ,以皮下接种方式免疫动物 ,观察其对卵巢癌腹腔转移大鼠模型生存期的影响 ,及对大鼠脾淋巴细胞增殖及诱导细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)杀伤活性的作用。结果　本研究构建pLmB7 1 SN成功。建立的NuTu 1 9/B7 1 、NuTu 1 9/IL 1 2和NuTu 1 9/IL 1 2 B7 1 细胞株中mB7 1 和mIL 1 2稳定表达。与对照组细胞相比 ,各组肿瘤细胞在动物体内的致瘤性有不同程度下降。B7 1 组[NuTu 1 9/BT 1 (B7 1 单独免疫 ) ]和IL 1 2组 [NuTu 1 9/IL 1 2 (IL 1 2单独免疫 ) ]大鼠的脾淋巴细胞增殖指数 (PI)分别为 2 4和 4 6 ,后者与对照组 (PI=1 0 5)相比 ,差异有显著性 (P <0 0 5) ,而联合组 [NuTu 1 9/IL 1 2 B7 1     

共刺激分子B7基因诱导小鼠抗宫颈癌

目的探讨共刺激分子B7基因能否在体内诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫应答。方法将B7基因转染小鼠宫颈癌细胞株即U14,建立高表达B7的U14细胞株即B7+U14。随后分4组进行体内实验(1)实验A组将B7+U14（1×107个细胞）接种于同系615小鼠的右侧背部皮下（n=6）。(2)实验B组用B7+U14（1×106个细胞）皮下注射免疫615小鼠,7d后将U14（1×107个细胞）接种于免疫后的小鼠背部皮下（n=6）。(3)对照A组在615小鼠右侧背部皮下接种U14（1×107个细胞）,其余条件同实验A组。(4)对照B组用U14（1×106个细胞）免疫615小鼠,其余条件同实验B组。观察4组小鼠的成瘤情况、生存时间;体外分别检测经B7+U14和U14免疫后的小鼠（n=4×2）T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。结果(1)小鼠皮下接种B7+U14后,体内的致瘤能力明显降低（P<0.01）。(2)用B7+U14免疫后再皮下接种U14可有效预防移植瘤产生（P<0.01）。(3)体外检测经B7+U14和U14免疫后的小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞作用,前者明显高于后者（P<0.01）。结论B7基因转染小鼠宫颈癌细胞株U14能诱导机体有效的抗肿瘤主动免疫应答,提示应用B7基因转染法可能成为临床治疗宫颈癌的有效方法。     

共刺激分子B7基因诱导小鼠抗子宫颈癌主动免疫的研究

目的　探讨共刺激分子B7基因能否在体内诱导小鼠抗宫颈癌主动免疫应答。方法　将B7基因转染小鼠宫颈癌细胞株即U14,建立高表达B7的U14细胞株即B7 U14。随后分 4组进行体内实验 :(1)实验A组 :将B7 U14(1× 10 7个细胞 )接种于同系 6 15小鼠的右侧背部皮下 (n =6 )。(2 )实验B组 :用B7 U14(1× 10 6个细胞 )皮下注射免疫 6 15小鼠 ,7d后将U14(1× 10 7个细胞 )接种于免疫后的小鼠背部皮下 (n =6 )。 (3)对照A组 :在 6 15小鼠右侧背部皮下接种U14(1× 10 7个细胞 ) ,其余条件同实验A组。 (4 )对照B组 :用U14(1× 10 6个细胞 )免疫 6 15小鼠 ,其余条件同实验B组。观察 4组小鼠的成瘤情况、生存时间 ;体外分别检测经B7 U14和U14免疫后的小鼠 (n =4× 2 )T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。结果　 (1)小鼠皮下接种B7 U14后 ,体内的致瘤能力明显降低 (P<0 0 1)。(2 )用B7 U14免疫后再皮下接种U14可有效预防移植瘤产生 (P <0 0 1)。(3)体外检测经B7 U14和U14免疫后的小鼠T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞作用 ,前者明显高于后者 (P <0 0 1)。结论　B7基因转染小鼠宫颈癌细胞株U14能诱导机体有效的抗肿瘤主动免疫应答 ,提示应用B7基因转染法可能成为临床治疗宫颈癌的有效方法     

RNAi沉默CD147基因对卵巢癌细胞HO-8910pm生物学行为的影响

目的:采用RNA干扰(RNA interference,RNA i)技术,利用构建的稳定转染CD147 shRNA表达质粒载体的HO-8910pm/pGE-1 CD147shRNA细胞株观察卵巢癌细胞系HO-8910pm CD147基因的沉默作用及生物学效应。方法:用免疫细胞化学法、激光共聚焦检测HO-8910pm细胞CD147的表达;MTT法绘制细胞生长曲线,观察裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的成瘤性。结果:pGE-1CD147shRNA转染人卵巢癌细胞系后,CD147的表达受到高效且特异的抑制,细胞侵袭力减弱,荷瘤裸鼠成瘤力下降,抑瘤率达58.8%(P<0.01)。结论:RNA i沉默CD147基因可影响卵巢癌的侵袭和成瘤,有可能成为治疗卵巢癌的新途径。     

CD_(80)基因导入人卵巢癌细胞系及其体外诱导细胞毒T淋巴细胞的研究

目的　用逆转录病毒载体将CD80 基因导入人卵巢癌细胞系TYK ,观察表达CD80 基因的TYK(TYK hCD80 )细胞体外诱导细胞毒T淋巴细胞 (CTL)的增殖及其杀瘤活性。方法　用逆转录病毒载体将CD80 基因导入TYK细胞 ,流式细胞仪测定其CD80 基因的表达。用TYK hCD80 细胞在抗CD3 单克隆抗体 (单抗 )存在下刺激外周血单个核细胞 (PBMC) ,诱导CTL ,3 H 胸腺嘧啶核苷掺入法测定其增殖活性 ,四甲基偶氮唑蓝法测定CTL的杀瘤活性。结果　转染后经G418(geneticin ,是一种氨基糖甙类抗生素 )筛选 ,流式细胞仪检测 ,CD80 基因表达率最高为 84 9%。TYK hCD80 、TYK在抗CD3 单抗存在下刺激PBMC增殖时 ,3 H 胸腺嘧啶核苷掺入量分别为 (4 0 6 0 4± 842 )、(80 0 0± 5 94)cpm ,两者比较 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。TYK hCD80 体外诱导的CTL较TYK诱导者对TYK细胞的杀伤率显著增高(P <0 0 5 )。结论　表达CD80 基因的卵巢癌细胞在抗CD3 单抗存在下能诱导产生CTL ,增殖快且有较高的杀伤活性 ,可能为卵巢癌的免疫基因治疗提供实验依据     

小鼠雄激素受体真核表达载体的构建与鉴定

目的:克隆小鼠雄激素受体(androgen receptor,AR)基因的cDNA,构建AR真核表达载体,并在睾丸支持细胞TM4中进行表达和鉴定。方法:应用RT-PCR法从小鼠睾丸中扩增AR,将测序正确的PCR产物克隆至pcDNA3.1(-)真核表达载体中,再将载体以脂质体方式转染至TM4细胞系中,通过G418筛选稳定转染AR的TM4细胞株,以RT-PCR法和Western blotting法检测转染前后AR在TM4细胞系中的表达情况。结果:RT-PCR法和Western blotting法检测的结果显示,转染pcDNA3.1(-)/AR质粒的细胞中AR基因的表达水平显著高于转染pcDNA3.1(-)质粒的对照组。结论:成功构建了小鼠AR真核表达载体pcDNA3.1(-)/AR和稳定转染的TM4细胞系,为进一步研究AR在睾丸支持细胞中的作用及其分子机制建立了细胞模型。     

Beclin1基因对SKOV3/DDP细胞生长增殖与侵袭转移的影响

目的:观察自噬基因Beclin1对卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP增殖与侵袭转移的影响,并探讨其可能作用机制。方法:脂质体包裹重组构建的pcDNA3.1-Beclin1和pSUPER-Beclin1质粒,分别体外转染SKOV3/DDP细胞并筛选稳定表达株。采用实时荧光定量RT-PCR检测不同细胞株中Beclin1 mRNA表达,Western blot法检测Beclin1、VEGF及MMP-9蛋白水平变化,MTT法测定细胞生长增殖情况,Transwell小室观察对细胞侵袭和转移能力的影响。结果:pcDNA3.1-Beclin1转染的SKOV3/DDP细胞株中,Beclin1表达上调、VEGF与MMP-9表达被抑制、细胞增殖受到抑制。Beclin1过度表达可显著降低SKOV3/DDP细胞侵袭与转移的能力,而干扰Beclin1表达可增强细胞的侵袭转移能力。结论:Beclin1能减弱卵巢癌SKOV3/DDP细胞的侵袭和转移能力,其机制可能与抑制肿瘤细胞增殖、降低VEGF和MMP-9的表达有关。     

p53基因转染对卵巢癌MDR细胞药物敏感性及恶性表型的影响

目的研究p53基因导入已知内源背景的肿瘤MDR细胞所致的恶性表型和MDR表型的改变及两者的关系.方法用磷酸钙沉淀法将含有野生型及全长反义p53cDNA的逆转录病毒戴体pDWp53及pDAp53转染病毒包装细胞PA317,测定病毒滴度.用此病毒感染卵巢癌多药耐药细胞株A2780/ADM,SouthernBlot鉴定,检测转导基因后细胞株的恶性度、多药耐药性等情况.结果野生型及反义全长p53cDNA均转入PA317细胞获得效价为(1～1.5)×105CFU/ml的前病毒,以此感染卵巢癌多药耐药细胞株A2780/ADM,SouthernBlot证实p53基因导入该细胞并整合到基因组DNA中,进一步测试观察到①导入野生型p53基因的A2780/ADM细胞生长被抑制、恶性度降低,细胞形态和生长曲线改变,软琼脂集落形成率及裸鼠接种成瘤率降低;②细胞多药耐药性减弱,对ADM耐药性下降,P-gp表达降低;③反义p53的导入也对A2780/ADM恶性度有一定的影响;④野生型p53导致的MDR细胞恶性表型与MDR水平的降低似有平行关系.结论p53基因对肿瘤细胞mdr-1基因的表达可能起调控作用,p53发生突变的MDR细胞内导入野生型p53在一定程度上可逆转MDR,为p53导入肿瘤细胞在分子水平上逆转耐药提供了直接的实验依据.     

逆转录病毒介导的p16基因对人卵巢癌细胞系生长抑制作用的研究

目的研究逆转录病毒介导的ｐ１６基因对人卵巢癌细胞系ＣＡＯＶ３生长与致瘤性的抑制作用。方法应用脂质体介导法,将外源性野生型ｐ１６基因转染不表达ｐ１６的人卵巢癌细胞系ＣＡＯＶ３,对转染后细胞ＤＮＡ、ＲＮＡ和蛋白进行分析并观察其生物学行为变化。结果外源性野生型ｐ１６基因已整合于细胞并获稳定表达,表达有外源ｐ１６基因的细胞生长速度、集落形成率及裸鼠致瘤性均有部分抑制。细胞周期分析可见Ｇ１期增加,Ｓ期下降。电镜下超微结构出现生长抑制特征。结论ｐ１６基因可明显抑制癌细胞生长,在卵巢癌发生、发展的过程中起重要作用。     

逆转录病毒介导的p16基因对人卵巢癌细胞系生长抑制作用？…

目的 研究逆转录病毒介导的Ｐ１６基因对人卵巢癌细胞系ＣＡＯＶ３生长与致瘤性的抑制作用。方法 应用脂质体介导法，将外源性野生型Ｐ１６基因转染不表达Ｐ１６的人卵巢细胞系ＣＡＯＶ３，对转染后细胞ＤＮＡ，ＲＮＡ和蛋白进行了分析并观察其生物学行为变化。结果 外源性野生型Ｐ１６基因已整合于细胞并获稳定表达，表达有外源Ｐ１６基因的细胞生长速度，集落形成率及裸鼠致瘤性均有部分抑制，细胞周期分析可见Ｇ１期增加，Ｓ期     

Study of cellular immunity response of Mb7-1 gene transfected mouse ovarian cancer cell line and its tumorigeneeities in vivo

Objective: To investigate the cellular immunity response in vitro and the tumorigenecities in vivo of mB7-1 gene transfected murine ovarian cancer cell line. Methods: mB7-1 gene was transfected into the NuTu-19 cell line by retrovirus vector, and the expression of mB7-1 gene was confirmed by flow cytometry(FCM).NuTu-19/neo and NuTu-19/mB7-1 cells were injected subcutaneously into syngeneic Fischer 344 rats respectively, and their tumorigenecities were recorded. Proliferation indices of lymphocyte were assayed after syngenieic mixed tumor-lymphocyte cultures(MTLCs). The lysis activity of CTL toward tumor cells was determined using methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay. Results: Successful transfection of mB7-1 gene into NuTu-19 cell line was comfirmed with FCM. In vitro study showed that there was no obvious changes in cell growth of gene transfected cell line, compared with the cell line NuTu-19. NuTu-19/mB7-1 cells could induce more effective proliferation of effector lymphocytes( P ＜ 0.05). The lysis activity of CTL activated by NuTu-19/mB7-1 was stronger than that of NuTu-19/neo ( P ＜ 0.01). Tumor sizes were smaller in the NuTu-19/mB7-1 receptance syngeneic Fischer 344 rats compared with those in the control group. Conclusion: mB7-1 genetically modified ovarian cancer cells could induce the cellular immunity response in vitro and the tumorigenecitiy of NuTu-19 cells was decreased after inoculation with the experimental vaccine.     

Study of cellular immunity response of mB7-1 gene transfected mouse ovarian cancer cell line and its tumorigenecities in vivo

Ovariancarcinomaremainsthefourthleadingcauseofcancerdeathsinthefemalepopulationandcarrieswithitadisproportionatelyhighmortalityratecomparedwithotherfemalepelviccancers .Althoughgreatapproacheshavebeengotteninsurgery ,chemotherapyand/orradiotherapy ,noobviousincreaseinfive yearsurvivalrateinthisneoplasmcouldbeseen[1] .Itisreasonableforgynecologiststosearchfornewtreatmentstrategyaswellasperfectthecurrenttherapeuticprocedures .Grossinvestigationshaveshowedthatsomeapproachesmaybeparticularlyeffect…     

人端粒酶逆转录酶启动子调控下胞嘧啶脱氨酶-胸苷激酶融合基因治疗卵巢癌的体外研究

目的　探讨人端粒酶逆转录酶 (hTERT)启动子调控下的融合双自杀基因———胞嘧啶脱氨酶 胸苷激酶 / 5 氟胞嘧啶 更昔洛韦 (CD TK/ 5 FC GCV)系统对人卵巢癌细胞及正常细胞的体外杀伤作用。方法　应用脂质体转染法将hTERT核心启动子报告质粒pBTdel 2 79转染人卵巢癌细胞系3AO、正常卵巢上皮细胞 (NOEC)和人胚肺成纤维细胞株HELF ,用荧光素酶分析检测hTERT启动子活性 ;应用RT PCR技术检测hTERTmRNA的表达水平。应用基因克隆技术分别构建hTERT启动子和巨细胞病毒 (CMV)启动子调控下的CD TK基因真核表达载体pBTdel 2 79 CD TK和pcDNA3 CD TK ,以及hTERT启动子调控下的TK基因表达载体pBTdel 2 79 TK。用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法和流式细胞术检测pBTdel 2 79 CD TK/ 5 FC GCV系统和pcDNA3 CD TK/ 5 FC GCV系统对上述 3种细胞不同的杀伤作用 ;应用RT PCR技术检测pBTdel 2 79 CD TK和pcDNA3 CD TK转染前后 3AO和NOEC细胞中CD和TK基因的表达情况。用扫描电子显微镜观察pBTdel 2 79 CD TK/ 5 FC GCV作用后 3AO细胞的形态变化。结果　卵巢癌细胞系 3AO中hTERT启动子活性增高 ,为 2 4 1% ,RT PCR检测hTERTmRNA为阳性 ,而在正常细胞NOEC和HELF中 ,hTERT启动子活性仅为 0 3%和 0 7% ,hTERTmRNA为阴性。与p     

脂质体转染白介素-12基因至卵巢癌SKOV3细胞检测VEGF表达及抗肿瘤作用探讨

目的:观察含mIL-12基因的质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞,效应细胞存在情况下对卵巢癌细胞株血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。方法:用脂质体转染技术将基因质粒及空质粒转染至SKOV3卵巢癌细胞(SKOV3/IL-12)及SKOV3/neo;用ELISA法检测IL-12及INF-γ的表达;用逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)半定量法测定SKOV3/IL-12+S(脾细胞)0,12,24,36,48,60hVEGFmRNA含量;用ELISA法测定细胞培养上清液中VEGF蛋白含量及其抑制率。结果:基因转染至SKOV3可检测到IL-12蛋白表达;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ,12h时迅速出现,作用后24h表达量最高;SKOV3/IL-12细胞与脾细胞作用12h后即出现VEGFmRNA表达抑制,24h达到高峰,与对照组有显著差异(P0.05);培养24h后上清中VEGF蛋白含量减少,与对照组有显著差异(P0.05)。结论:将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞并表达IL-12;分泌的IL-12蛋白具有活性,使脾细胞产生INF-γ;SKOV3/IL-12与效应细胞脾细胞作用后产生INF-γ能在核酸水平下调VEGF并能抑制VEGF蛋白的表达。     

人卵巢癌干细胞的分离培养和初步鉴定

目的:从人卵巢癌细胞株SKOV-3中分离培养卵巢癌干细胞,并鉴定其生物学性质。方法:卵巢癌SKOV-3细胞在含有生长因子的无血清培养基(SFM)中悬浮培养得到肿瘤细胞球。流式细胞术、Transwell小室侵袭实验分别检测SKOV-3细胞及其细胞球CD44和CD117的表达,筛选细胞表面标记物和观察体外侵袭能力;将肿瘤细胞球传代扩增,并用含血清培养基(SSM)培养促使其分化,并将细胞球和普通SKOV-3细胞分别接种于96孔板,CCK-8法检测增殖能力及其耐药性。结果:卵巢癌SKOV-3细胞能在SFM中形成可以稳定传代的细胞球,并显示很强的自我更新和增殖能力,含血清环境能够诱导其分化而贴壁生长;肿瘤细胞球中高表达CD44和CD117抗原标记,特别是CD44,其侵袭能力显著高于正常SKOV-3细胞(P0.05);细胞球对顺铂具有更强的耐药性,将顺铂作用于细胞球及贴壁分化细胞24,48及72h后,细胞球抑制率分别为2.59%,8.43%,12.08%,显著低于分化贴壁细胞(抑制率分别为10.73%,28.13%,39.17%),分别比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:采用无血清悬浮培养法从人卵巢癌细胞系中获取的细胞球,可能含有一小部分具有增殖和分化能力的卵巢癌干细胞,多表达CD44和CD117抗原标记,且CD44更具有特异性。     

CD80基因导入人卵巢癌细胞系及其体外诱导细胞毒T淋巴细胞的研究

目的　用逆转录病毒载体将CD     

组织蛋白酶L基因与卵巢上皮性癌细胞侵袭及转移的关系

目的 构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒,通过体外实验研究CTSL基因与卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞侵袭、转移的关系.方法 采用逆转录(RT)-PCR技术从卵巢癌组织总RNA中扩增CTSL基因的cDNA全长,克隆至pMD18-T载体上;酶切、纯化CTSL基因后与pcDNA3.1载体连接,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-CTSL.应用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒转染卵巢癌HO8910细胞,RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检验CTSL mRNA和蛋白的表达情况,细胞增殖能力测定分别采用四甲基偶氮唑蓝法和集落形成实验,细胞周期检测、细胞体外侵袭、转移、黏附能力测定分别采用流式细胞仪、细胞体外侵袭重建基底膜实验、穿膜小室(transwell小室)实验、体外黏附实验.结果 RT-PCR和蛋白印迹法结果证实,HO8910细胞转染pcDNA3.1-CTSL质粒后有CTSL基因和蛋白的表达.HO8910-CTSL细胞的生长速度加快,但与对照的HO8910-pcDNA3.1及HO8910细胞分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05).HO8910-CTSL细胞的S+G2+M期细胞比例为37.9%,与HO8910-pcDNA3.1细胞及HO8910细胞(分别为32.9%、31.8%)比较虽有增加,但差异均无统计学意义(P>0.05).HO8910-CTSL细胞的侵袭、转移能力增加(分别为0.34±0.18、1.252±0.114),与HO8910-pcDNA3.1细胞(分别为0.17±0.04、0.486±0.027)及HO8910细胞(分别为0.16±0.05、0.459±0.674)分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);HO8910-CTSL细胞的黏附能力(0.16±0.04)与HO8910-pcDNA3.1细胞(0.19±0.04)及HO8910细胞(0.19±0.03)比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 CTSL基因真核表达质粒转染使卵巢癌细胞的体外侵袭和转移能力增加,有可能成为抗卵巢癌侵袭和转移的分子靶点.     

小鼠富含半胱氨酸分泌蛋白-1真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的:构建小鼠富含半胱氨酸分泌蛋白-1(Crisp-1)真核表达载体,并观察其在COS-7细胞中的表达。方法:从小鼠附睾组织中提取总RNA,RT-PCR扩增Crisp-1基因开放阅读框(ORF),将目的基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1上,经脂质体介导转染COS-7细胞,并利用间接免疫荧光和RT-PCR检测其在COS-7细胞中的表达。结果:酶切电泳鉴定结果显示Crisp-1基因克隆入载体中,测序结果证实克隆的基因序列与基因库(GeneBank)中的Crisp-1序列相符。脂质体转染后,间接免疫荧光和RT-PCR结果均表明重组质粒pcDNA3.1-Crisp-1能在COS-7细胞中表达。结论:成功获得了能在COS-7细胞中表达的小鼠Crisp-1DNA疫苗的真核表达质粒pcDNA3.1-Crisp-1,为后续研究其生物学活性及免疫避孕效应奠定了基础。     

NOSTRIN基因克隆及其在人脐静脉内皮细胞中的表达

目的 :构建内皮型一氧化氮合酶运输介导物 (endothelialnitricoxidesynthasetrafficinducer ,NOSTRIN)基因的真核表达载体 ,通过质粒转染人脐静脉内皮细胞 (humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)获得高表达NOSTRIN基因的细胞克隆。方法 :构建真核表达载体pcDNA3.1 NOSTRIN ,采用脂质体介导将重组质粒导入体外培养的HUVEC ,Westernblot检测转染细胞和未转染细胞中NOSTRIN蛋白质的表达。结果 :成功构建了真核表达载体pcDNA3.1 NOSTRIN ,并用脂质体介导的方法获得了高稳定表达NOSTRIN的细胞克隆 ;Westernblot显示转染前后的细胞均有 5 8kD的蛋白质表达 ,转染后表达量明显增高。结论 :重组质粒pcDNA3.1 NOSTRIN经转染能在HUVEC细胞中高效表达 ,为进一步研究NOSTRIN对HUVEC的生物学影响奠定了基础     

尿激酶型纤溶酶原激活因子介导的卵巢上皮癌细胞浸润转移体外的实验研究

目地:探讨尿激酶型纤溶酶原激活因子在卵巢上皮癌浸润转移中的作用机制。方法:用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA基因cDNA全长,克隆至pGEM-T Easy Vector,鉴定后与真核表达载体PCMV-HA连接,酶切及测序。用脂质体法将重组质粒DNA转染至SKOV3细胞。加压筛选并培养PCMV-HA-uPA及对照细胞。分别用RT-PCR和W estern blot方法检测转染前后SKOV3细胞uPA的表达。细胞增殖能力测定用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验,细胞周期测定用流式细胞仪法,细胞体外侵袭,迁移和黏附能力测定分别采用Matrigel Invasion,TranswellM igration和Adhersion Assay方法。结果:(1)uPA阳性表达能介导SKOV3细胞克隆形成,与对照组细胞的差异有统计学意义(P<0.05);(2)uPA阳性表达能介导SKOV3细胞的细胞周期中S期比例增加,与对照组细胞的差异有统计学意义(P<0.05);(3)uPA阳性表达介导SK-OV3细胞的体外侵袭,迁移和黏附能力均明显强于对照细胞株,差异有统计学意义(P=0.0002,<0.0001和0.0049)。结论:uPA通过促进肿瘤细胞侵袭,迁移和黏附能力在卵巢上皮癌浸润转移中起了重要作用。