甲基莲心碱对人脐静脉血管平滑肌细胞增殖及Cyclin D1,P21Waf1/Cip1表达的影响

目的:观察甲基莲心碱对人脐静脉平滑肌细胞(HUVSMCs)增殖,Cyclin D1及P21Waf1/Cip1表达的影响,旨在探讨甲基莲心碱作用的分子机制。方法:采用MTT法和流式细胞仪观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及甲基莲心碱对HUVSMCs增殖的影响。用免疫印迹法检测Cyclin D1及P21Waf1/Cip1蛋白表达,以半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Cyclin D1及P21Waf1/Cip1rnRNA的表达。结果:AngⅡ对HUVSMCs有明显促增殖作用,其促增殖效应在24 h达到峰值,且在0.001-0.1μmol/L浓度范围内有剂量依赖关系。甲基莲心碱呈剂量依赖性地抑制AngⅡ诱导的HUVSMCs增殖,同时可抑制AngⅡ诱导的Cyclin D1蛋白及mRNA的表达,促进P21Waf1/Cip1蛋白及mRNA表达。结论:甲基莲心碱可通过下调Cyclin D1及上调P21Waf1/Cip1的表达阻滞细胞周期的进程,从而抑制血管平滑肌细胞的增殖,是一种有效的抑制血管平滑肌细胞增殖的药物。     

莲心碱体外吸收对Ang Ⅱ诱导血管平滑肌细胞表型转化的影响

目的 通过检测血管平滑肌A7R5细胞内莲心碱的含量,同时测定不同浓度莲心碱对A7R5细胞活力的影响及莲心碱的药效作用,探究莲心碱进入细胞作用的效率与对A7R5细胞表型转换的影响。方法 体外培育大鼠血管平滑肌细胞A7R5细胞株,将其随机分为6组,分别用不同剂量莲心碱干预（0、5、25、50、100、200μg/mL）,采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF/MS）检测不同浓度的莲心碱干预15 min时A7R5细胞质中莲心碱浓度;采用MTT法筛选莲心碱药物浓度后,选择对细胞无伤害的药物浓度,采用血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）诱导建立A7R5细胞表型转换模型,将其分为空白对照组（完全培养基）、Ang Ⅱ组(1×10^-6 mol/L Ang Ⅱ)、莲心碱组(1×10^-6 mol/L Ang Ⅱ+10μg/mL莲心碱),干预24 h后,双转盘活细胞共聚焦实时成像分析系统观察A7R5细胞中表型转换标志物α-SMA的蛋白表达情况。结果 通过液质联用可检测到破碎细胞中莲心碱的含量,与干预浓度呈剂量依赖,空白对照和末次清洗细胞的PBS中未检...     

川芎嗪抑制血管平滑肌细胞增殖及胶原合成的作用机制研究

目的 研究川芎嗪抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）增殖的作用机制,为中药有效预防血管再狭窄提供实验依据。方法 体外培养大鼠胸主动脉VSMCs,分为：阴性对照组、血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）组（AngⅡ10 －6 mol/L）、低剂量组（川芎嗪20 μmol/L加AngⅡ］、中剂量组（川芎嗪40 μmol/L加AngⅡ）及高剂量组（川芎嗪80 μmol/L加AngⅡ）。MTT法检测细胞增殖率;Western blot和实时荧光定量PCR法分别检测Wnt通路相关蛋白Wnt4、β-catenin、Dvl-1、CyclinD1及胶原Ⅰ（ColⅠ）、胶原Ⅲ（ColⅢ）蛋白、基因表达。结果 与阴性对照组比较,AngⅡ组细胞增殖率明显升高（P<0.05）。与AngⅡ组比较,中、高剂量组细胞增殖率明显降低（P<0.05）。与阴性对照组比较,AngⅡ组Wnt4、β-catenin、Dvl-1、CyclinD1、ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA表达均明显上调（P<0.05）。与AngⅡ组比较,中、高剂量组Wnt4、β-catenin、Dvl-1、CyclinD1、ColⅠ、ColⅢ蛋白和mRNA表达均明显下调（P<0.05）。上述指标在低、中、高剂量组均具有浓度依赖性。结论 川芎嗪通过下调Wnt信号通路在一定程度上抑制了AngⅡ诱导的VSMCs的增殖及胶原分泌。     

甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen-I, TIMP-1及MMP-2的影响

目的: 观察甲基莲心碱对肝星状细胞Collagen-I,TIMP-1及MMP-2 mRNA表达及蛋白分泌的影响。 方法: 体外培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,随机分为5组:对照组、血小板衍生因子(PDGF)组、甲基莲心碱低、中、高剂量组(2,6,10 μmol·L^-1)。分别加入各组药物培养48 h后,收集细胞提取总RNA,采用RT-PCR检测Collagen-I,TIMP-1及MMP-2 mRNA表达,并收集细胞上清液采用ELISA检测3个因子的蛋白含量。 结果: 与对照组相比,PDGF可明显增加肝星状细胞Collagen-I,TMIP-1及MMP2 mRNA表达及蛋白分泌。与PDGF组相比,甲基莲心碱中、高剂量组Collagen-I及TMIP-1 mRNA表达及蛋白分泌明显减少,且随着浓度的增加,减少更明显,而甲基莲心碱低剂量组Collagen-I及TMIP-1 表达及分泌无明显变化。与PDGF组相比,甲基莲心碱3个剂量组的MMP-2 mRNA表达及蛋白分泌均无明显变化。 结论: 甲基莲心碱可抑制PDGF诱导的HSC的Collagen-I和TIMP-1的mRNA表达及蛋白分泌,且随浓度的增加,抑制作用加强,但对MMP-2的表达及分泌无明显影响。     

通脉Ⅰ号抑制自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的机理探讨

目的 探讨通脉Ⅰ号抑制自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的可能机理。方法细胞计数、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及放射免疫等细胞、分子生物学方法。结果通脉Ⅰ号显著地抑制CSMC的增殖；15mg／L的浓度可极显著地抑制VSMC上AngⅡ受体AT1 mRNA的表达，并可降低SHR-VSMC内AngⅡ含量。结论 通脉Ⅰ号对SHR的VSMC增殖的抑制作用机理之一系降低了AT1受体的mRNA表达，拮抗AngⅡ受体。     

丹参酮ⅡA对增殖的大鼠血管平滑肌细胞中钙调神经磷酸酶活性的影响

目的 探讨丹参酮ⅡA（TSN）对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导血管平滑肌细胞（VSMCs）增殖的影响机制。方法 组织贴块法培养VSMCs并用AngⅡ诱导建立其增殖模型, 用酶促反应定磷法观察不同浓度的TSN对血管平滑肌细胞中钙调神经磷酸酶（CaN）活性的影响;应用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）观察CaN mRNA表达水平的变化和应用免疫细胞化学方法观察增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平的变化。结果 与正常对照组比较, AngⅡ组能够明显刺激VSMCs增殖, 细胞增殖活度明显升高（P<0.05）;TSN各组CaN活性、CaN mRNA和PCNA表达水平随TSN的浓度增加而显著下降（P<0.05, P<0.01）。结论 TSN具有抑制血管平滑肌细胞增殖的作用, 并呈浓度依赖性。其机制可能与TSN下调VSMC中CaN活性、抑制了CaN mRNA 和PCNA的表达有关。     

β-谷甾醇对T47D细胞增殖和细胞周期的影响及作用机制探讨

目的：观察β-谷甾醇（BSS）对雌激素受体（ER）阳性人乳腺癌T47D细胞的作用,并进一步探讨其可能的作用机制。方法：以ER拮抗剂ICI182780为工具药,采用MTT细胞增殖实验观察不同浓度BSS对T47D细胞增殖的影响;利用流式细胞术检测其对T47D细胞周期的影响;利用Western-blot和Real-timePCR技术检测其对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）蛋白及mRNA表达的影响。结果：高浓度BSS抑制T47D细胞增殖,使细胞分裂增殖指数降低,且ICI182780不能完全拮抗其对T47D细胞的增殖抑制作用;低浓度BSS可促进T47D细胞增殖,提高细胞分裂增殖指数,且ICI182780可完全拮抗其促增殖作用。Western-blot及Real-timePCR结果显示：低浓度BSS可诱导T47D细胞CyclinD1蛋白和mRNA表达,并且ICI182780能够抑制此诱导作用。结论：BSS通过ER介导调节CyclinD1蛋白与mRNA水平的表达,从而影响ER阳性人乳腺癌T47D细胞增殖活性和细胞周期,发挥植物雌激素样作用。     

4种中药单体对人胰腺癌PANC-1细胞移植瘤生长的影响及分子机制探讨

目的:研究淫羊藿次苷Ⅱ,知母皂苷AⅢ,甲基莲心碱,红景天苷对PANC-1移植瘤的作用.方法:建立PANC-1皮下移植瘤模型,成瘤后随机分组,治疗组给予中药单体腹腔注射,23 d取瘤称重,部分组织中性福尔马林固定做免疫组化,其余组织液氮速冻,然后转移至-80℃冰箱保存做基因蛋白分析.免疫组化Ki67观察肿瘤增殖情况,RT-PCR检测瘤组织VEGF mRNA表达情况,Western blotting检测瘤组织VEGF蛋白表达.结果:与模型组比较,知母皂苷AⅢ(1.0 mg·kg-)能抑制肿瘤生长(P＜0.05),能降低VEGF mRNA(P＜0.05)和VEGF蛋白表达(P＜0.05),活化Caspase-3蛋白.淫羊藿次苷Ⅱ,甲基莲心碱,红景天苷的抗肿瘤作用不显著.结论:知母皂苷AⅢ其抗肿瘤作用与抑制VEGF及促进肿瘤凋亡有关.     

基于主动脉Ang Ⅱ/AT1通路研究蒙花苷对高血压血管重构的影响

目的基于主动脉血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)/血管紧张素受体1型(AT1)通路研究蒙花苷对高血压大鼠血管重构的影响。方法采用自发性高血压大鼠(SHR)自然形成高血压血管重构模型,观察蒙花苷对SHR血压、眩晕时间、主动脉组织形态学及胶原纤维分布的影响。采用Ang Ⅱ诱导原代血管平滑肌细胞(VSMCs)建立体外血管重构模型,通过MTT和结晶紫实验观察蒙花苷对VSMCs异常增殖的影响,通过细胞划痕及小室实验观察其对VSMCs迁移的影响;检测Ang Ⅱ/AT1信号通路相关分子Ang Ⅱ、AT1、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、Src、p-Src、Syk和p-Syk蛋白表达。结果蒙花苷能明显缩短SHR眩晕时间及降低SBP、DBP及MBP水平,并能改善主动脉中膜增厚、VSMCs增生肥大且排列紊乱等,减少主动脉中膜胶原纤维分布;能显著抑制Ang Ⅱ诱导的VSMCs异常增殖和迁移;能抑制活性氧(ROS)的产生,降低Ang Ⅱ、AT1、MMP-2、MMP-9和p-Src的蛋白表达水平。结论蒙花苷可能是通过抑制主动脉中AngⅡ/AT1信号通路的活化,继而抑制血管平滑肌细胞的异常增殖和迁移,从而起到抗高血压血管重构的作用。     

固本化痰通脉方含药血清对大鼠血管平滑肌细胞增殖及细胞周期素D1的影响

目的：观察固本化痰通脉方对大鼠血管平滑肌细胞生长增殖、细胞周期及细胞周期素D1表达的影响，以探讨其作用机制。方法：血小板源生长因子BB（PDGF-BB）刺激体外培养的大鼠血管平滑肌细胞使其快速增殖生长，加入不同浓度的固本化痰通脉方含药血清作用一定时间后，通过MTT法测定其对血管平滑肌细胞生长的抑制率，流式细胞技术测定细胞周期及细胞周期素D1的表达。结果：固本化痰通脉方能明显抑制PDGF-BB刺激的血管平滑肌细胞增殖，还以浓度依赖方式减少S期细胞、阻滞细胞于G0／G1期，并下调细胞周期素D1的表达。结论：固本化痰通脉方能抑制血管平滑肌细胞的增殖生长，阻滞细胞周期的进行，因而可能具有抗动脉粥样硬化的作用，其作用机理可能与调控血管平滑肌细胞细胞周期素D1的活性有关。     

PTEN的表达对宫颈癌细胞周期的影响及意义

目的通过观察PTEN在宫颈癌中的表达及构建PTEN过表达载体研究PTEN在宫颈癌发生和发展中的意义。方法首先通过免疫组织化学法检测PTEN在宫颈癌组织的表达情况,进一步在宫颈癌细胞系中用Western blot检测PTEN的表达,根据不同细胞系PTEN的表达水平的差异选取表达水平较低的C33-A细胞系进行过表达载体的转染,并筛选出高表达PTEN的单细胞克隆进行后续的细胞周期的检测及周期相关蛋白P21、P27、Cycli—nA及CyclinD1的蛋白水平检测。结果宫颈癌组织PTEN阳性率与正常宫颈上皮组织、CINⅠ～Ⅱ相比明显减少（P均〈0．05）。过表达PTEN的细胞克隆处于GO期的细胞百分数高于阳性对照（P〈0．05）,而处于S期的细胞百分数低于阳性对照（P〈0．05）。对周期相关蛋白P21、P27、CyclinA及CyclinD1的蛋白表达的检测发现P21、P27表达上调,CyclinD1表达下调。结论PTEN在宫颈癌中的表达是减少的甚至是缺失的。通过人工构建PTEN过表达载体得到PTEN过表达克隆后,高表达的PTEN对细胞周期是抑制的,其可能是通过PI3K—Akt途径调节细胞周期相关蛋白P21、P27及CyclinD1发挥了抑制细胞周期GO／S期转换的作用,进而抑制了宫颈癌细胞的增殖。     

小青龙汤干预哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖作用的研究

目的：探讨小青龙汤对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用机制。方法：40只清洁级雄性SD大鼠随机分为正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组和小青龙汤组,每组10只。观察哮喘大鼠气道平滑肌形态学变化;采用SYBR Green Real Time PCR测定哮喘大鼠肺组织中ERK1、ERK2和Cyclin D1的mRNA表达变化。结果：哮喘模型组肺组织中ERK1、ERK2和Cyclin D1的mRNA表达显著高于正常对照组（P〈0.01）,小青龙汤组和地塞米松组肺组织中ERK1、ERK2和Cyclin D1的mRNA表达显著低于哮喘模型组（P〈0.01）。结论：小青龙汤抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖可能是通过抑制ERK1、ERK2的磷酸化和降低Cyclin D1的表达实现。     

透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞Cyclin D1 mRNA表达的影响

目的:观察透骨消痛胶囊含药血清对软骨细胞CyclinD1 mRNA表达的影响,探讨透骨消痛胶囊治疗骨性关节炎的可能作用机制.方法:采用抽签法将16只12周龄雄性新西兰大白兔随机分为空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组4只.低剂量组按5 mL·kg-体质量以5 mg·mL-1透骨消痛胶囊溶液灌胃,中剂量组按5 mL·kg-体质量以10 mg·mL-1透骨消痛胶囊溶液灌胃,高剂量组按5 mL·kg-1体质量以20 mg·mL-1透骨消痛胶囊溶液灌胃,空白组按5 mL·kg-1体质量以生理盐水灌胃.每天灌胃2次,连续7d,最后1d连续2次灌胃,中间间隔2h.末次灌胃后3h提取各组实验兔含药血清低温保存备用.将6只4周龄雄性新西兰兔处死,取其膝关节软骨,置入盛有Ⅱ型胶原酶的培养皿中进行消化,建立软骨细胞体外培养体系,并采用甲苯胺蓝染色法鉴定细胞功能.将体外培养的第3代软骨细胞随机分为空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,并分别加入含空白血清、低剂量中药血清、中剂量中药血清、高剂量中药血清的DMEM培养液中继续培养72 h后,采用MTT法检测软骨细胞的增殖情况,采用RT - PCR法检测CyclinD1 mRNA的表达,并在透射电子显微镜下观察细胞形态.结果:Ⅱ型胶原酶消化法成功建立了软骨细胞的体外培养体系,甲苯胺蓝染色可见软骨细胞内呈紫红色异染颗粒.干预72 h后,各组软骨细胞光密度值比较,差异有统计学意义(F=6.209,P=0.004);中剂量组、高剂量组软骨细胞光密度值高于空白组(P=0.005,P=0.002);中剂量组、高剂量组软骨细胞光密度值高于低剂量组(P =0.034,P=0.011).各组软骨细胞CyclinD1 mRNA表达量比较,差异有统计学意义(F=8.262,P=0.001);中剂量组、高剂量组软骨细胞CyclinD1 mRNA表达量高于空白组(P=0.002,P=0.001);中剂量组、高剂量组软骨细胞CyclinD1 mRNA表达量高于低剂量组(P =0.012,P=0.004);中剂量组、高剂量组可见较多处于分裂期的细胞.结论:透骨消痛胶囊的含药血清能促进软骨细胞G1期正性调节因子CyclinD1 mRNA的表达,从而促进软骨细胞增殖,这可能是透骨消痛胶囊在临床上治疗骨性关节炎具有较好疗效的部分机理,而有关透骨消痛胶囊治疗骨性关节炎的具体作用机制还需作更进一步的深入研究,以便为临床应用提供理论依据.     

健骨颗粒含药血清对大鼠成骨细胞G_1期调节蛋白的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对成骨细胞G_1期调节蛋白的影响。方法采用酶消化法培养SD大鼠成骨细胞,健骨颗粒含药血清干预,以生理盐水大鼠血清为对照,运用流式细胞术检测成骨细胞增殖周期,免疫细胞化学法、RT-PCR法检测成骨细胞G_1期调节蛋白细胞周期蛋白(Cyclin)D1、CDK4、P21表达。结果 20%健骨颗粒含药血清能推进成骨细胞增殖周期进程,促进其增殖;成骨细胞核中存在Cyclin D1、CDK4、P21等蛋白表达;与生理盐水血清比较,健骨颗粒含药血清干预24、48、72 h均能提高成骨细胞CyclinD1、CDK4蛋白及mRNA表达(P0.05或P0.01),而降低P21表达(P0.05,P0.01)。结论健骨颗粒含药血清能从mRNA及蛋白层面上提高体外培养成骨细胞Cyclin D1、CDK4表达,抑制负性调节因子p21的表达,调节G_1期调节蛋白,促进成骨细胞增殖。     

人参皂甙对不同代龄人胚肺成纤维细胞的增殖及Cyclin D1基因表达的影响

目的 :探讨人参皂甙对衰老的人胚肺成纤维细胞增殖及CyclinD1基因表达的调节作用 ,以进一步研究人参皂甙抗细胞衰老的机制。方法 :用体外培养的人胚肺成纤维细胞为细胞衰老模型 ,通过细胞流式分析、免疫组化及RT PCR方法 ,观察了人参皂甙对成纤维细胞的增殖周期、DNA合成 ,CyclinD1mRNA和蛋白质表达情况。结果 :衰老的成纤维细胞用人参皂甙连续处理 4代后 ,处于G1期的细胞数明显减少 ,进入S期的细胞由 16 7%增加到 33% (P <0 0 5 ) ;CyclinD1mR NA表达比对照组下降 ,CyclinD1蛋白质表达由原来的 77 1± 2 9明显下降为 5 2± 6 3(P <0 0 0 1) ,DNA合成增加 17% (P <0 0 5 )。人参皂甙对低代龄细胞的CyclinD1RNA合成有所增加 ,对CyclinD1蛋白质、DNA的作用影响不大。结论 :人参皂甙对人胚肺成纤维细胞具有双向作用 ,对高代龄细胞具有促进细胞增殖 ,调节CyclinD1基因表达的作用     

搜风祛痰法对血管紧张素Ⅱ诱导血管内皮细胞iNOS mRNA及ET-1 mRNA表达的影响

目的观察搜风祛痰法对血管紧张素Ⅱ致体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）iNOS及ET-1 mRNA表达的影响。方法制备兔活心汤含药血清。采用酶消化法培养HUVECs2-3代用于实验,采用RT-PCR法测定内皮细胞iNOSmRNA及ET-1 mRNA。结果活心汤可抑制AngⅡ导致的内皮细胞损伤,减少iNOSmRNA及ET-1 mRNA的表达。结论活心汤可抑制AngⅡ所致的HUVECs损伤,保护血管内皮细胞功能。     

淫羊藿苷对血管平滑肌细胞周期及周期相关蛋白表达的影响

目的 研究淫羊藿苷（icariin．ICA）对同型半胱氨酸（homocysteinemia,HCY）诱导增殖的血管平滑肌细胞（vascular smooth musckle cell．VSMC）细胞周期的影响及其机制。方法建立HCY诱导的兔VSMC增殖模型,与不同浓度的ICA共同培养48h后,用流式细胞仪检测VSMC细胞周期变化及细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1和CDK4的表达。结果0．2mg／L、0．4mg／L ICA组G0／G1期细胞数明显增多,s期细胞数明显减少,与HCY组相比有统计学意义（P〈0．01）;CyclinDl和CDK4的表达量均随ICA剂量增加而减少。结论 ICA桔抗HCY诱导的兔VSMC增殖．其主要机制可能与Cyclin D1及CDK4的低表达所致的细胞周期抑制有关。     

搜风祛痰法中药对AngⅡ诱导人脐静脉内皮细胞NF-κB mRNA及ET-1 mRNA表达的影响

目的观察搜风祛痰法对血管紧张素Ⅱ致体外培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）核转录因子（NF-κB）mRNA及内皮素-1（ET-1）mRNA表达的影响。方法制备兔活心汤含药血清。采用酶消化法培养HUVECs2-3代用于实验,采用RT-PCR法测定内皮细胞NF-κB mRNA及ET-1 mRNA,随机分为5组：正常对照组,血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）组,低浓度中药血清＋AngⅡ组,中浓度中药血清＋AngⅡ组,高浓度中药血清＋AngⅡ组。结果活心汤可抑制AngⅡ导致的内皮细胞损伤,减少NF-κB mRNA及ET-1 mRNA的表达。结论活心汤可抑制AngⅡ所致的HUVECs损伤,保护血管内皮细胞功能。