巢式甲基化特异性聚合酶链反应在p16基因启动子过甲基化检测中的应用

目的　介绍巢式甲基化特异性聚合酶链反应 (nMSP)法 ,探讨了最佳PCR扩增条件 ,并用该法分析新鲜癌组织、石蜡包埋组织及肿瘤患者血清中p16基因启动子的甲基化状态。方法　将基因组DNA变性成为单链 ,用亚硫酸氢盐修饰单链DNA ,将所有未甲基化的胞嘧啶被转变为尿嘧啶 ,而甲基化的胞嘧啶则不变。设计针对甲基化和非甲基化等位基因特异引物 ,进行巢式聚合酶链反应扩增 ,最后经凝胶电泳检测目的片段。结果　在 3种类型的标本中都检测出了p16基因启动子甲基化。用甲基化特异性聚合酶链反应法 (MSP)和nMSP法分别检测 34例非小细胞肺癌 (NSCLC)患者血清 ,p16基因启动子甲基化阳性率分别为 5 3% (18/34)和 74 % (2 5 /34) ,nMSP法具有更高的灵敏度。结论　筑巢式甲基化特异性聚合酶链反应是一种灵敏度高、特异性强的甲基化检测方法 ,可广泛应用于不同类型标本基因启动子甲基化分析。     

半巢式甲基化特异性聚合酶链反应在胃癌p16基因甲基化检测中的应用

目的　改进甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,采用半巢式MSP检测胃癌组织p16基因启动子区CpG岛的甲基化状态。方法　用亚硫酸氢盐修饰被测DNA后 ,采用半巢式MSP(引物分别为MS ,M1A和MS ,M2A) ,分析了 6 0例胃癌组织及相应正常组织中p16基因的甲基化状态。结果　单独用MSP ,胃癌组织中p16基因甲基化的发生率为 80 %。采用半巢式MSP ,甲基化发生率为86 7% ,比单独采用MSP提高了几个百分点 ,并提示胃癌病例的p16基因启动子区存在甲基化发生的不同模式。结论　半巢式MSP能够有效地提高灵敏度和减少假阳性。同时 ,免疫组化的结果也说明了p16基因异常甲基化与胃癌组织P16蛋白的表达密切相关。     

巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究

本研究应用改进的甲基化特异性PCR（MSP）法，即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率，探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株，及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰，再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增，分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明：CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化，而Molt4、K562、HL-60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化。结论：用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态，方法简单，灵敏且重复性强，可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断。     

银屑病患者外周血中p16基因甲基化的检测

目的检测斑块型银屑病患者外周血单个核细胞（PMBCs）中p16基因启动子甲基化的状态,探讨p16基因甲基化的检测在斑块型银屑病发病中的作用和机制。方法收集2011年4月至2012年5月该院门诊和住院48例宽块型银屑病患者（实验组）和18例健康者（对照组）的外周血单个核细胞（PBMCs）,采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）检测PBMCs中p16基因甲基化的状态,并分析p16基因甲基化与患者病程和银屑病皮损面积和严重程度指数（PASI）评分的关系。结果斑块型银屑病患者PBMCs中p16基因甲基化状态（31．3％）明显高于对照组（5．6％）,差异具有统计学意义（Y。=4．71,P〈0．05）,且与PASI评分之间差异具有统计学意义（t=2．63,P〈0．05）,而与患病病程之间差异无统计学意义（t=0．55,P〉0．05）。结论斑块状银屑病患者PBMCs中p16基因呈高甲基化比例明显增高状态,可能参与斑块状银屑病的发病机制。     

白血病等恶性血液病中p15基因甲基化的检测及临床意义

p15基因位于染色体 9p2 1,是一种肿瘤抑制基因 ,其编码产物p15蛋白特异地抑制细胞周期素依赖激酶 4 6 (CDK4 6 ) ,使细胞不能通过G1 期和S期间的监测点 ,从而停留在G1 期。血液系统恶性肿瘤有高频率的p15基因失活[1 ] ,研究发现 5′启动子及转录启始区域内的CpG岛的异常甲基化是p15基因的主要失活方式[2 ] 。Herman等[3] 研究出甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) ,为基因CpG岛甲基化研究提供了有效的方法。对象和方法1　研究对象　急性白血病患者共 4 0例 ,男 2 2例 ,女 18例 ,年龄 14～ 76岁 ,均符合FAB诊断和分型标准 ;其中初治或…     

血浆卵泡抑素结构域跨膜蛋白基因甲基化异常在大肠癌诊断中的价值

2003年Sabbioni等报道，在71％的大肠癌患者血浆中有含表皮生长因子和卵泡抑素结构域跨膜蛋白（TPEF）基因甲基化的改变，TPEF基因异常甲基化有望成为大肠癌早期诊断的有价值的分子标志物。本研究用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术分析32份大肠癌组织标本，以建立检测血浆TPEF基因甲基化异常的方法，现报告如下。     

急性白血病患者p15与p16基因甲基化检测及mRNA表达水平的定量分析

近年研究发现肿瘤细胞中存在DNA甲基化分布异常。即在肿瘤细胞中同时还存在基因组某些区域，特别是在一些抑癌基因的启动子区域高甲基化现象。抑癌基因启动子及转录起始区高甲基化可能也是导致抑癌基因失活和细胞恶性转化的机制之一。抑癌基因p15(CDK2B)和p16(CDK2A)均位于人类9号染色体短臂(9p21)，编码两种细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制性蛋白，参与细胞增殖与分化的调节。为探讨p15与p16在白血病细胞的甲基化状态及与表达水平的关系，我们应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术检测40例初诊急性白血病(AL)患p15和p16甲基化状态，同时用荧光实时定量逆转录聚合酶链反应(RT-QPCR)技术检测p15和p16基因mRNA表达水平。     

痰、血浆中p16基因异常甲基化与肺癌的关系

随着工业现代化的不断发展，肺癌的发病率也随之持续上升。根据世界卫生组织(WHO)2001年公布资料显示，在过去10年问全球癌症的发病及病死率增长了约22％，其中肺癌无论从发病数量(120万／年)，还是死亡数量(110万／年)来看，均为全球最主要的癌症。若仅利用现有的诊断标准和治疗方法，只有不到15％的肺癌患者可以存活，其主要原因是当肺癌患者被确诊时，65％的患者已经发展为进展期，     

白血病白细胞p16基因纯合缺失的检测和临床意义

目的 探讨p16基因纯合缺失与白血开门见山发病的关系。方法 用聚合酶链反应（PCR）检测73例白血病患者白细胞p16基因纯合缺失情况。结果 73例白血病患者中有5例p16基因纯合缺失,其中,21例慢性粒细胞性白血病患者未见p16基因纯合缺失,27例急性非淋巴细胞性白血病（急非淋）患者有1例缺失,缺失率为3.7%(1/27)。25例急性淋巴细胞性白血病患者有4例缺失,缺失率为16%（4/25）。20例正常对照未发现p16基因缺失。结论 p16基因在急性淋巴细胞性白血病（急淋）中有较高的缺失率。     

不同甲基化检测技术对模拟肺癌患者血浆中APC基因甲基化的检测

目的 研究模拟肺癌患者血浆DNA中APC基因甲基化最低检测限,确定不同甲基化检测技术在早期肺癌诊断中的价值.方法 用普通甲基化特异性基因扩增（methylation specific PCR,MSP）方法检测肺癌细胞株NCI-H460细胞APC基因,以酚-氯仿经典方法提取NCI-H460细胞DNA,紫外分光光度计定量并以10倍稀释的浓度梯度依次投入相同的健康人血浆200μl中去,得到模拟肺癌患者血浆,利用磁珠核酸提取方法从模拟血浆样本中提取血浆DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以Sybr-Green Ⅰ为染料进行实时荧光定量MSP检测,同时进行普通MSP检测.结果 NCI-H460细胞中的APC基因启动子1A区719位点存在甲基化,实时荧光定量MSP检测模拟肺癌患者血浆APC基因甲基化的最低检测限为在200 μl血浆中能检测出10^2个肿瘤细胞的DNA,而以普通MSP检测,200 μl血浆中需投入10^3个以上肿瘤细胞的DNA才有弱阳性条带.实时荧光定量MSP检测技术比普通MSP检测的敏感性至少高出10倍.结论 实时荧光定量MSP比普通MSP检测灵敏度高,该技术用于肺癌患者血浆DNA甲基化检测,可能有助于肺癌早期诊断.     

肺癌患者癌组织和血浆p16基因甲基化的检测及其临床意义

目的研究非小细胞肺癌患者癌组织和血浆p16基因甲基化及其临床意义。方法选择120例非小细胞肺癌患者,用巢式甲基化特异性聚合酶链反应法检测其肺癌组织、癌旁正常组织和外周血血浆p16基因的甲基化,并对120例正常对照组血浆样品进行p16基因甲基化检测,各组检测结果进行比较。结果肺癌组织p16基因甲基化率44.2%,高于癌旁组织的11.7%(P0.01);非小细胞肺癌患者血浆样品中p16基因甲基化检测率为32.5%,对照组血浆未检测到p16基因甲基化(P0.01);肺癌患者血浆样品与癌组织p16基因甲基化检出率比较差异无显著性(P0.05);患者血浆样品与癌旁组织p16基因甲基化检出率比较差异有显著性(P0.01)。结论肺癌患者癌组织和血浆样本p16基因甲基化的检测都为肺癌的早期筛查和诊断提供了有价值的参考信息。     

实时荧光定量PCR检测人肺癌p16基因启动子异常甲基化阳性参比物的研究

我国肺癌发病率较高，且5年生存率仅有6％～16％，早期发现和治疗可使5年存活率提高到60％-90％。研究证明，p16基因启动子区域的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛（CpG岛）异常甲基化在肿瘤发生组织增生和化生阶段已出现，故对肺癌的早期诊断具有很大价值。因此，本研究用实时荧光定量PCR方法检测p16基因甲基化，以寻找敏感、特异的肺癌诊断标志，这对肺癌早期诊断和预后观察以及高危人群筛查都有重要意义。     

基于LAMP的微流控芯片病原体快速检测方法研究进展

急性传染病具有传播速度快、传播范围广、不易控制等特点,严重威胁着广大人民群众的生命安全,其快速检测、早期诊断尤为重要。环介导等温扩增技术(LAMP)是新型的基因扩增技术,可在恒温环境下快速、灵敏、高效、特异地进行基因扩增,具有特异性强、灵敏度高、检测耗时短、操作简便等优点。     

肺癌诊断中血浆中多基因联合甲基化检测的价值

目的:探讨肺癌诊断中血浆中多基因联合甲基化检测的价值。方法:选取80例肺癌患者的资料作为研究组,选取80例健康体检者为对照组,比较两组多基因检测及甲基化状态。结果:肺癌组织的CDH13、RASSF1A、RUN3基因甲基化率高于癌旁组织甲基化率(P<0.05)。研究组患者的CpG岛甲基化表型阳性率高于对照组(P<0.05)。结论:血浆中多基因联合甲基化检测在肺癌早期诊断中有重要意义。     

结直肠癌患者cdkn2/p16基因异常的检测及临床意义

肿瘤DNA存在于患者血液中，虽然含量极微，但可反映人体对肿瘤的负荷。ckdn2／p16基因是肿瘤抑制基因家族的重要成员，其功能异常多见于各种肿瘤；而其结构异常表现为缺失、点突变及启动子CpG岛的高度甲基化后，使其失活，不能转录和翻译。本研究对同一患者中ckdn2／p16基因几种异常单独或相互作用与病理分型和临床Duke’s分期的相关性进行探讨。     

血浆Septin9基因甲基化检测在胃肠道病变中的临床应用价值评价

目的探讨血浆Septin9基因甲基化在胃肠道病变进展过程中的临床应用价值。方法纳入2017年5月至2020年11月在福建医科大学附属第一医院行血浆Septin9基因甲基化检测(PCR荧光法)的受检者(包括结直肠癌和胃癌患者、消化系统良性病变患者及无疾病证据受检者)2128例,收集相关临床资料,并进行ROC曲线分析。结果术前结直肠癌和胃癌患者、消化系统良性病变患者、无疾病证据受检者血浆Septin9基因甲基化的阳性率分别为57.67%、43.71%、17.72%和4.88%。与无疾病证据受检者组相比较,术前结直肠癌和胃癌患者Septin9基因甲基化检测的敏感性分别为57.71%和43.71%,特异性分别为95.12%和95.12%。临床分期为Ⅲ~Ⅳ期的结直肠癌(68.92%)和胃癌(48.80%)患者的血浆Septin9基因甲基化的阳性率高于Ⅰ~Ⅱ期结直肠癌(50.51%)和胃癌(18.82%)患者,术前行该检测的结直肠癌(57.76%)和胃癌(43.71%)患者的阳性率亦高于术后行该检测的结直肠癌(31.45%)和胃癌(33.76%)患者,且有63.33%结直肠癌与69.23%胃癌患者在术后该指标由阳性转变为阴性。ROC曲线分析结果表明,单独血浆Septin9基因甲基化在筛查结直肠癌患者与结直肠良性病变患者或无疾病证据受检者组中ROC曲线下面积(AUC^ROC)分别为0.681和0.764,在筛查胃癌患者与胃良性病变患者或无疾病证据受检者组中的AUC^ROC分别为0.649和0.694。在筛查结直肠癌与结直肠良性病变患者组中,Septin9联合癌胚抗原检测的AUC^ROC可提高至0.789。结论血浆Septin9基因甲基化检测在结直肠癌和胃癌中具有一定的诊断价值,但仍需结合其他的诊断方法。     

p16／MTSI基因缺失在骨髓增生异常综合征发病中作用的研究

目的 探讨多肿瘤抑制基因(p16／MTSI)缺失与骨髓增生异常综合征(MDS)发病的关系。方法 采用PCR技术．对30例MDS的p16／MTSI基因缺失情况进行了分析。结果 30例MDS患者未见有p16基因缺失。结论 提示p16基因缺失和MDS的发病关系不大。     

应用聚合酶链反应技术检测重症感染患者血中细菌DNA的临床评价

重症感染病死率高，目前其临床确诊主要依据细菌学培养，而现行的血培养阳性率较低。本研究拟探讨采用规范的聚合酶链反应(PCR)技术，从基因水平直接检测细菌16SrRNA基因，为感染的准确诊断提供依据。     

MSP技术检测慢性淋巴细胞白血病患者孕激素受体B基因甲基化异常

目的 建立检测慢性淋巴细胞白血病患者孕激素受体B基因CpG岛甲基化状态改变的方法.方法 提取外周血DNA,经亚硫酸盐修饰,然后采用甲基化特异性PCR技术检测9例慢性淋巴细胞白血病患者及5例正常对照外周血DNA 孕激素受体B基因CpG岛甲基化状态.结果 在9例慢性淋巴细胞白血病患者外周血中5例成功地检测到孕激素受体B基因甲基化异常,而正常对照均没有发现甲基化异常.结论 建立的检测慢淋孕激素受体B基因异常甲基化的方法是可靠的,该方法可能对监测肿瘤进程有一定作用.     

骨髓增生异常综合征患者ZO-1基因甲基化状态检测的临床意义

本研究探讨紧密连接蛋白（zonula occludens-1,ZO-1）基因异常甲基化在骨髓增生异常综合征（MDS）诊断中基因标志作用的临床意义。采用甲基化特异性-PCR（MS-PCR）方法分析30例健康人骨髓标本及85例MDS患者骨髓标本的ZO-1基因启动子区甲基化状况。结果显示：ZO-1基因在30例健康人标本中均呈完全非甲基化状态;MDS患者骨髓中ZO-1基因甲基化阳性率（56.5%）明显高于健康人,二者差异有统计学意义（p〈0.05）。MDS各亚型病人骨髓ZO-1基因启动子区甲基化阳性率均高于健康人,其差异也具有统计学意义（p〈0.05）。MDS亚型RA、RAS、RAEB、RCMD间ZO-1基因甲基化阳性率差别无统计学意义（p〉0.05）。结论：与健康人相比,MDS病人骨髓中ZO-1基因启动子区呈高甲基化状态并具有特异性。MDS是一种常见的克隆增殖性血液系统疾病,在临床诊断中有时很难与其他疾病相鉴别,而ZO-1基因甲基化模式的改变与MDS的发生密切相关,因此ZO-1基因作为有价值的诊断标志具有重要的临床意义,它可能是一个潜在的血液系统恶性疾病的相关基因。