CTLL-2细胞的复苏及培养条件的探讨

目的:探讨CTLL-2细胞(细胞毒性T淋巴细胞株)的复苏及培养的最佳条件,解决实验室CTLL-2细胞经液氮冻存后复苏难的问题。方法:将从液氮取出复苏后的CTLL-2细胞分为两组,在实验组培养体系中加大IL-2的剂量,使终浓度为1000U/ml;对照组培养体系中IL-2剂量终浓度为300U/ml,培养观察。     

CTLL—2细胞的复苏及培养条件的探讨

目的:探讨CTLL-2细胞(细胞毒性T淋巴细胞株)的复苏及培养的最佳条件,解决实验室CTLL-2细胞经液氮冻存后复苏难的问题。方法:将从液氮取出复苏后的CTLL-2细胞分为两组,在实验组培养体系中加大IL-2的剂量,使终浓度为1000U/ml;对照组培养体系中IL-2剂量终浓度为300U/ml,培养观察。结果:实验组与对照组比较实验组CTLL-2细胞静止期缩短,细胞折光率强,有增殖现象,细胞形态明显优于对照组。实验组复苏一周后进入正常细胞周期,而对照组细胞数量减少,细胞萎缩最终死亡。值得一提的是实验组进入正常细胞周期后逐渐递减培养体系中的IL-2含量,最后维持在一个恒定的剂量上,CTLL-2细胞仍然稳定增殖传代,这时的CTLL-2细胞可以用来检测IL-2的反应性,这种培养方法的建立解决了实验室CTLL-2细胞复苏难的问题。     

YAC-1细胞冻存方法的研究

目的研究YAC-1细胞保种的冻存方法。方法用3种不同的冻存方法对YAC-1细胞进行冷冻保存,在冻存1年内不同时间段对细胞存活率及复苏24小时后细胞的生长状况进行比较。结果用不同的冻存方法冻存YAC-1细胞,不同时间段复苏后细胞存活率不同,3种方法无显著性差异,生长状况均良好,为实验室选择适合的冻存方法提供了依据。     

YAC-1细胞冻存方法的研究

目的 研究YAC-1细胞保种的冻存方法.方法 用3种不同的冻存方法对YAC-1细胞进行冷冻保存,在冻存1年内不同时间段对细胞存活率及复苏24小时后细胞的生长状况进行比较.结果 用不同的冻存方法冻存YAC-1细胞,不同时间段复苏后细胞存活率不同,3种方法无显著性差异,生长状况均良好,为实验室选择适合的冻存方法提供了依据.     

不同冻存条件下HepG_2细胞存活率的比较

目的探讨不同冻存条件下对HepG_2细胞存活率的影响,以提高复苏细胞的存活率。方法取对数生长期HepG_2细胞,分别配制传统冻存液A、改良冻存液B,采用方法1(人工梯度降温法)和方法2(程序降温盒法)两种冻存方法进行冻存,在冻存1个月、6个月、12个月后分别对细胞进行复苏,检测细胞的存活率并观察复苏细胞的生长状态。结果冻存1个月后复苏,冻存液A、B两组细胞的存活率差异无统计学意义(P>0.05),冻存6个月、12个月后复苏,冻存液A组细胞存活率显著低于B组(P<0.01);B组细胞复苏的生长状态及增殖速度都明显优于A组,两组细胞的数量差异有统计学意义(P<0.05);以方法1、2冻存的细胞,在冻存1个月、6个月、12个月后复苏细胞,方法2细胞的存活率均显著高于方法1(P<0.01)。结论采用含高浓度血清的冻存液及缓慢降温有利于提高细胞复苏的存活率。     

家蝇胚胎细胞系MDEC-07114的储存方法

目的探讨家蝇胚胎细胞系(MDEC~07114)的储存方法。方法采用不同的冻存方法储存MDEC~07114,复苏后观察细胞贴壁及生长情况。结果4℃保存1~2个月内,细胞复苏后能贴壁生长。其他4种方法处理后液氮冻存的细胞,复苏后细胞生长状态均较好。结论短期储存可选用4℃保存法;长期保存细胞,用90%胎牛血清冻存液改良液氮冻存法。     

LDH改良法在IL—2活性检测中的应用

随着白细胞介素2(IL-2)在基础理论和临床实践研究中的不断深入,建立快速、敏感、稳定的IL-2检测方法正益受到重视,本文研究了一种新的检测IL-2活性的乳酸脱氢酶(LDH)改良法。LDH存在于IL-2活性检测所用的CTLL-     

胃肠道肿瘤冻存组织原代细胞培养的实验研究

目的探讨冻存胃肠道肿瘤组织复苏后原代细胞培养的可行性方法。方法采用胎牛血清、RPMI Medium 1640培养液、二甲基亚砜（DMSO）配制冻存液,复苏以此冻存液冷冻保存的8例胃肠道肿瘤组织并行原代细胞培养,另复苏2例未加冻存液直接冻存的胃肠肿瘤组织为对照组。结果8例冻存液保存的胃肠道肿瘤组织原代细胞培养均获成功,成功率为100%。对照组2例未加冻存液冻存的肿瘤组织培养失败。结论 复苏应用冻存液冻存的胃肠道肿瘤组织进行原代细胞培养可获得成功,细胞生长时间与冻存时间及肿瘤细胞恶性程度有关,采用高浓度血清冷冻保存效果较好。     

不同冻存液冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株 HepG2的效果比较

目的筛选冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液。方法采用甘油和二甲基亚砜(DMSO)2种不同冻存保护剂,以4种不同比例的冻存液分别冻存慢病毒转染后肝癌细胞HepG2及未转染的HepG2细胞,并对上述细胞复苏后的存活率及增殖能力进行比较分析。结果采用甘油为冻存保护剂时,冻存液[DMEM∶胎牛血清(FBS)∶甘油]比例为0∶9∶1的转染后细胞存活率最高(P=0.001);未转染细胞存活率与冻存液比例无关(P=0.293)。采用DMSO为冻存保护剂时,转染后细胞存活率为0%;未转染细胞存活率在60%及以上,且与冻存液比例无关(P=0.487)。冻存液中血清含量越高,复苏后细胞的增殖能力越强(P<0.05)。结论冻存慢病毒转染后的稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液为90%FBS+10%甘油。     

低温冻存对人脂肪间充质干细胞生物学特性的影响

目的: 比较人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells,hADSCs)冻存前和复苏后的生物学特性,为今后建立低温干细胞库提供实验支持。方法： 采用0.1%Ⅰ型胶原酶消化法从腹部大网膜脂肪组织中分离hADSCs,体外培养扩增,将处于均一稳定生长状态的第3代hADSCs置于液氮中分别冻存1、3和6个月,复苏后台盼蓝染色检测细胞存活率,采用MTT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面抗原,成脂成骨诱导后鉴定多向分化能力,RT PCR检测成脂特异性基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ-2(peroxisome proliferator activated receptorγ-2,PPARγ-2)和成骨特异性基因骨钙素(osteocalcin,OC)的表达情况。结果： 随冻存时间的延长细胞存活率略有下降,但差异无统计学意义(P＞0.05)。MTT结果显示冻存前后细胞增殖能力均很强。流式细胞检测结果显示冻存前后细胞均高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166,低表达CD45和HLA-DR。冻存前后hADSCs均具有向脂肪细胞和骨细胞分化潜能,且RT-PCR结果显示,PPARγ-2和骨钙素mRNA的表达冻存前后差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论： 经液氮冻存后的hADSCs具有高存活率,生物学特性保持稳定且仍具有多向分化潜能。     

兔外周血间充质干细胞的分离培养及冻存

目的建立兔外周血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养及冻存的方法。方法用密度梯度离心法及贴壁培养法分离纯化兔外周血MSCs，MSCs经液氮冻存半年复苏，观察细胞冻存前后的生长状况，并用台盼蓝法测定其存活率。结果MSCs于体外培养2h开始贴壁生长，细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞，增殖活跃；MSCs经6mo冻存后复苏培养，台盼蓝法计数存活率达95％以上，细胞形态及生长状况与冻存前无明显差别，均呈长梭形，细胞生长增殖旺盛。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G-CSF动员后的外周血MSCs，且细胞纯度高，生长增殖活性好，采用液氮冻存MSCs的方法十分有效可行。     

改良hela细胞冻存与复苏方法的实验研究

目的:建立一种改良的hela细胞冻存和复苏的方法.方法:取生长状态良好的HELA细胞分别进行传统和改良方法冻存,于冻存后1年分别行传统和改良的复苏方法.用MTT法测细胞生长曲线,应用两因素析因分析统计方法评定不同冻存方法、不同复苏方法单独和/或组合对细胞复苏率的影响.结果:HELA体外生长良好.电镜观察细胞超微结构没有明显改变.细胞的复苏率均受不同冻存方法和复苏方法单、双因素影响.冻存复苏后生长曲线良好.结论:改良后的HELA冻存和复苏方法可使细胞保持最佳生物学特性,细胞的复苏率高,适合用于体外实验研究.     

CCK-8法检测重组人白细胞介素-2的活性

目的:建立快速、简便、稳定的检测白细胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)活性的方法.方法:利用CCK-8(cell counting kit-8)试剂盒,检测3个生产厂家的IL-2对CTLL-2细胞株增殖的影响.结果:IL-2浓度在2～2 000 U/ml范围内,IL-2浓度与细胞增殖成正比,3个厂家的I...     

IL-2激活的TIL对自体肿瘤细胞的杀伤活性及其与LAK细胞活性的比较

肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)经白细胞介素2(IL-2)体外培养后具有很强的体内外抗肿瘤作用,且有一定的靶细胞特异性,其抗肿瘤效果强于淋巴因子激活的杀伤细胞即LAK细胞(P<0.01)。从瘤体中新鲜分离到的TIL对自体肿瘤细胞的杀伤活性极低,经IL-2体外培养后,其杀伤活性逐渐增高,以培养至7～25d的杀伤活性最强,这与IL-2使TIL分泌3种抗癌淋巴因子包括IL-2、IFN-γ、淋巴毒素(LT)增加有关。体外培养25d后,TIL的抗肿瘤活性下降,实验表明这与培养过程中TIL的Lyt-2~+细胞(Tc)减少而L3T4~+细胞(T_H)增多有关。TIL经冻存复苏和IL-2体外培养后仍保持很强的抗肿瘤活性,冻存前后比较未见显著差异(P>0.05),这为间断地运用TIL治疗复发性、晚期肿瘤提供了一条可行的途径。     

体外诱生人白细胞介素-2的实验条件

探讨用植物血凝素(PHA)诱导人外周血单核的细胞(PBMC)产生白细胞介素-2(IL-2)的实验条件,并用PHA诱导正常人PBMC产生IL-2及用IL-2依赖细胞株(CTLL-2)增殖试验来滴定IL-2活性单位。结果:(1)PHA-M诱导人PBMO产生IL-2的最适条件:PBMC为1×10~3/ml、PHA-M浓度为0.5～1％、诱生时间为24h、RPMI1640营养液中需加入2～10％灭活的人AB型血清;(2)无论是PHA-M或PHA在较高剂量时(分别≥0.25％和6.25μg/m1)均抑制aTLL-2的生长;(3)用PHA-M诱导19例正常人PBMG产生IL-2,其活性单位为64±65u/mL(±SD,范围4～260)。     

HIPK2在IL-2撤除诱导T细胞凋亡中的作用

目的 研究同源结构域相关的蛋白激酶2（homeodomain-interacting protein kinase 2,HIPK2）在白介素2（interleukin 2,IL-2）撤除诱导的T细胞凋亡中的表达及其作用.方法 IL-2依赖性的T细胞株（CTLL-2）,撤除IL-2后可诱导凋亡.运用PI染色和DNA凝胶电泳检测细胞凋亡,实时定量RT-PCR检测HIPK2及其他细胞凋亡相关基因的表达.通过反义技术下调HIPK2的表达,观察HIPK2在IL-2撤除诱导的T细胞凋亡中的作用.结果 随IL-2撤除时间延长,CTLL-2细胞凋亡率增加,细胞基因组DNA发生了明显片段化.参与死亡受体凋亡途径的基因FasL和Fas表达没有明显改变（P＞0.05）,Bcl-2家族中促凋亡基因Bim表达明显上调（P＜0.01）,抗凋亡基因Bcl-xL表达明显下调（P＜0.05）,HIPK2表达明显上调（P＜0.05）.下调HIPK2的表达可以显著降低CTLL-2在IL-2撤除后的细胞凋亡率（P＜0.01）,促凋亡基因Bim的表达被显著下调（P＜0.01）,而抗凋亡基因Bcl-xL明显上调（P＜0.05）.结论 HIPK2可以促进IL-2撤除诱导的CTLL-2 T细胞凋亡,这种作用可能与HIPK2上调促凋亡基因Bim和下调抗凋亡基因Bcl-xL的表达相关.     

影响外周血DNA提取质量因素分析

目的探讨人体外周血冻存标本存放时间对提取DNA质量的影响。方法使用外周血DNA提取试剂盒FlexiGene DNA Kit(250),对-80℃冻存1a、2a、3a和4a的外周血标本进行DNA提取,NanoDrop-2000分光光度仪检测DNA浓度和OD260/OD280比值,1%琼脂糖进行电泳检测,采用单因素方差分析比较DNA质量。结果冻存1a、2a和3a的外周血DNA浓度之间无差异(P>0.05),冻存4a的外周血提取DNA浓度明显低于冻存1~3aDNA的浓度(P<0.05)。冻存1a的外周血DNA纯度明显高于冻存2a及以上的样品(P<0.05)。结论外周血标本-80℃冻存时间超过3a对提取DNA的质量有明显的影响。     

软骨细胞培养及其冻存复苏后的生物学特性比较

目的 了解冻存复苏过程对保持软骨细胞生物学特性的影响。方法 对冻存1周组、1个月组、2个月组和新鲜制备组的软骨细胞进行倒置相差显微镜动态观察、特殊染色以及透射电镜等观察，在其形态和功能方面进行比较。结果 各组间软骨细胞的生长过程、特殊染色及透射电镜观察的结果差异均无显著性，但随冻存时间的延长，其存活率有所下降。结论 冻存软骨细胞与新鲜制备的软骨细胞相比保持了一些相似的生物行为，但冻存时间长短对冻存的软骨细胞存活率有影响。     

低温冻存对人脐带间充质干细胞生物学特性的影响

目的比较人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)冻存前与复苏后的生物学特性,为规模化储备UC-MSCs提供试验支持。方法采用胶原酶消化法从脐带中分离UC-MSCs,贴壁培养传代,将第3代UC-MSCs利用程控降温仪冷冻,置于-196℃液氮中冻存6个月后复苏,比较冻存前和复苏后UC-MSCs的细胞形态、生长曲线、免疫表型及多向分化潜能等生物学特性。结果复苏后UC-MSCs仍呈成纤维样形态生长,生长曲线与冻存前相似;免疫表型仍高表达CD73、CD90、CD105,不表达CD34、CD45、CD40、CD80、CD86、CD154、HLA-DR;在特定的体外诱导条件下,仍可以向骨、脂肪、软骨分化。结论冻存复苏后UC-MSCs的生物学特性仍保持稳定。     

中国首个卵巢组织冻存库冻存患者特征及冻存效果分析

目的 评估中国首个卵巢组织冻存库进行卵巢组织冻存患者的特征及冻存效果。方法 对首都医科大学附属北京妇产医院(中国首个卵巢组织冻存库)卵巢组织冻存患者数据库里面的217例女性患者的数据进行统计学分析,初步了解这部分人群所患疾病类型、年龄分布、所在城市、冻存前是否接受了放射治疗及化学药物治疗等情况。对其中的46位患者,每位患者取直径2 mm的标本共4个,采用数字表法随机选取其中2个用于新鲜卵巢组织的卵泡计数,剩余2个标本进行程序化冷冻/复苏,对比两组之间卵泡活性计数的差异。结果 进行卵巢组织冻存患者的疾病类型以宫颈癌患者为主,占49.31%;年龄段主要在31～35岁,占总人数的36.4%,其次是26～30岁,占总人数的25.3%。新鲜卵巢组织组与冻存/复苏后卵巢组织组间卵泡活性计数差异无统计学意义(P>0.05)。结论 首都医科大学附属北京妇产医院(中国首个卵巢组织冻存库)进行卵巢组织冻存患者的主要疾病类型是宫颈癌,人卵巢组织冻存/复苏技术能够有效保存患者生殖力。