体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层克隆兔角膜缘干细胞

目的研究兔胚胎成纤维细胞体外克隆兔角膜缘干细胞。方法兔胚胎成纤维细胞经丝裂霉素C(MMC)处理成饲细胞,用消化法培养兔角膜缘基底层细胞并接种于含有经MMC处理饲细胞的12孔培养板,进行原代培养。观察其光镜特征、电镜结构,用间接免疫细胞化学染色等对克隆的细胞进行综合鉴别。结果克隆的细胞呈典型的上皮细胞形态,电镜下可见微绒毛、桥粒、张力丝等典型上皮细胞结构,单克隆抗体AE1、PCNA染色后细胞大多数阳性,单克隆抗体AE5染色后细胞染色偶见阳性。结论体外兔胚胎成纤维细胞为饲养层成功地克隆出兔角膜缘干细胞。     

组织块联合胰酶消化法培养兔角膜缘干细胞的初步探索

目的：建立一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养方法。

方法：获取兔角膜缘组织,采用组织块联合胰蛋白酶消化法进行兔角膜缘干细胞体外培养,倒置显微镜下观察细胞生长情况,HE染色观察细胞形态和结构特点,并运用免疫组织化学技术进行细胞鉴定。

结果：采用组织块联合胰蛋白酶消化法可以简便、快速地培养出兔角膜缘干细胞,显微镜下动态观察细胞生长良好,有较高的增殖能力; HE染色证实细胞形态和结构正常; AE5及P63免疫组织化学鉴定呈阳性。

结论：采用组织块联合胰蛋白酶消化共同培养的方法,建立了一种简便、高效的兔角膜缘干细胞原代培养模式。     

以纤维蛋白凝胶为载体培养兔角膜缘上皮细胞

目的 研究兔角膜缘上皮细胞(corneal limbus epithelial cell,CLEC)在纤维蛋白凝胶上的最佳接种方式及其生长情况.方法 取角膜缘上皮组织块进行细胞培养.用针对鼠抗兔角蛋白3(CK3)的单克隆抗体AE5和抗增殖细胞核抗原(PCNA)抗体行间接免疫荧光鉴定.MTT法测定CLEC增殖活性.将传第二代的细胞分A、B两组分别接种到纤维蛋白凝胶表面和凝胶体内进行培养,在接种后5d、10 d、15 d时将凝胶溶解离心后计数细胞数,比较两种接种方式下细胞的增殖力.结果 传第一、二代细胞培养3～5d后胞浆AE5染色阳性,胞核PCNA染色阳性,传第一代阳性细胞比例分别为31％、65％,传第二代阳性细胞比例分别为45％、79％.传第一代细胞在接种后6h内贴壁,1～2d时处于潜伏期,2～3 d时处于快速生长期,3d时达85％以上汇合,细胞增殖活性最高,4d时细胞汇合达95％以上,增殖活性逐渐降低.接种后5d时A组细胞数低于B组,差异有统计学意义(P＜0.05);10d和15 d时A组细胞数均高于B组,差异均有统计学意义(均为P ＜0.05).结论 以纤维蛋白凝胶为载体培养CLEC时将细胞接种在凝胶表面比包埋在凝胶体内更有利于细胞增殖,适合用于CLEC移植培养的研究.     

角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的实验研究

目的 建立兔角膜缘上皮细胞体外培养、冻存和复苏的方法。方法 兔角膜缘上皮细胞组织块接种培养。取第三代细胞进行冻存。于冻存后第2周，3、6个月复苏细胞。用MTT法测细胞生长曲线。结果 兔角膜缘上皮细胞体外生长良好。培养细胞AE1单克隆抗体染色阳性，PAS染色阴性。冻存细胞复苏成功。冻存细胞复苏后生长曲线良好。结论 兔角膜缘上皮细胞可以在体外培养、冻存和复苏。     

人角膜缘干细胞体外培养后生物学特性的变化

目的 探讨人角膜缘干细胞体外培养后细胞形态学，抗原性和增殖能力的变化。方法 消化培养法体外培养人角膜缘干细胞。获得细胞单层并观察细胞形态学变化。利用间接免疫荧光组化检测人角膜缘组织HLA-DR抗原在培养前，后的变化，检测培养后细胞增殖核抗原和角膜上皮64KD角蛋白的表达。结果 原代细胞在培养1周形成单层细胞形态以圆柱状细胞为主，培养前角膜缘上皮下少星HLA-DR抗原分布，培养后单层细胞DR抗原表达阴性；单层细胞中多量，散在分布的增殖细胞核抗原阳性细胞，并且部分细胞表达64KD角蛋白，结论 角膜缘干细胞体外培养后分化为角膜上皮，不表达HLA-DR抗原，介仍保持较强的分裂增殖能力，可能是临床移植治疗干细胞缺乏眼表疾病患者的一种有效手段。     

DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞及鉴定

目的研究DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察其体外生长特性,并采用免疫组织化学染色鉴定培养的上皮细胞。方法 DispaseⅡ消化法原代培养兔结膜上皮细胞,观察不同时期细胞的生长情况、细胞形态,做广谱角蛋白、MUC5AC免疫荧光染色及PAS染色鉴定;并比较不同部位结膜上皮细胞增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达阳性情况。结果 DispaseⅡ消化法能够获得大量的较纯净的结膜上皮细胞,细胞生长增殖快,能传代4～5代;绝大多数细胞广谱角蛋白免疫荧光染色阳性,少数细胞MUC5AC表达阳性及PAS染色阳性。睑结膜、穹隆部结膜和球结膜细胞PCNA阳性率分别为:(32.14±1.69)%、(27.67±1.20)%、(22.76±1.73)%,兔睑结膜上皮细胞PCNA阳性率较穹隆部及球结膜上皮细胞的PCNA阳性率高,各部位PCNA阳性率间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DispaseⅡ消化法是进行体外结膜上皮细胞培养的理想方法,兔眼睑结膜处可能存在结膜干细胞。     

以不同性质羊膜为载体培养人角膜缘干细胞的生物学特性

目的:观察并比较在完整羊膜和去上皮层羊膜这两种不同性质的载体羊膜上培养的人角膜缘干细胞的生物学特性。方法:采用组织块培养法,将角膜缘组织块种植于完整羊膜(I组)和去上皮层羊膜(D组)上进行培养,并对细胞的生长特点,超微结构以及免疫荧光染色结果进行观察。结果:在这两种性质的羊膜上人角膜缘干细胞均可生长形成单层,扫描电镜观察见细胞之间存在细胞连接。免疫荧光细胞化学染色结果显示,I组细胞BrdU标记阳性率高于D组(I组vsD组,P<0.05),而对AE5和缝隙连接蛋白(Cx43)表达的阳性率低于D组(I组vsD组,P<0.05),对增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达两组均较高。结论:人角膜缘干细胞均可在这两种性质的羊膜上生长,在去上皮羊膜上生长的干细胞有不同程度的分化,而完整羊膜能更好的维持干细胞特性。     

一种培养原代小鼠角膜基质细胞的新方法

目的改良小鼠角膜基质细胞分离培养方法 ,为角膜基质细胞生物学和角膜组织工程等研究提供更好的种子细胞。方法采用Dispase酶消化法联合组织块贴壁法分离、培养原代小鼠角膜基质细胞,倒置显微镜下观察细胞生长情况,通过间接免疫荧光化学染色Vimentin表型和RT-PCR检测Vimentin、Lumican和CK12基因表达对培养的细胞进行鉴别。结果倒置显微镜下可见小鼠角膜基质细胞呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接;免疫荧光化学鉴定小鼠角膜基质细胞表达Vimentin阳性;RT-PCR显示Vimentin和Lumican基因表达阳性,CK12表达阴性。结论 Dispase酶消化法联合组织块贴壁法培养可获得具有角膜基质细胞特性的细胞,本方法为体外获得单纯小鼠角膜基质细胞提供了简单高效的途径。     

体外培养不同代角膜缘干细胞特性分析

目的比较不同代角膜缘干细胞的生物学特性,为角膜缘细胞移植在临床中的氉应用提供依据。方法组织块培养法体外培养角膜缘干细胞,光镜观察、HE染色和免疫荧光染色分析原代、第1代和第2代角膜缘细胞形态学特性;流式细胞技术定量检测原代、第1代和第2代角膜缘细胞ABCG2表达;MTT比色法测定体外培养原代、第1代和第2代角膜缘干细胞的增殖活性变化。结果倒置相差显微镜下可见原代细胞培养24h有单个细胞从组织块边缘迁出,48h细胞局部可见拉网样生长趋势,72h出现大片细胞,细胞呈现多边形或多角形,96h细胞几乎铺满整个培养板。随着传代次数的增加,细胞形态变得不规则,CK3单克隆抗体表达阳性率逐渐增强;p63单克隆抗体原代和第1代细胞间表达阳性率无明显差别,第2代细胞表达量明显减弱。流式细胞检测显示原代、第1代和第2代细胞ABCG2表达阳性率分别为13.41%、22.96%和4.43%。MTT结果显示随传代次数增加细胞增殖活性逐渐下降。结论原代和第1代角膜缘干细胞可以作为制备组织工程角膜上皮细胞膜片的较理想种子细胞。     

培养的兔角膜缘上皮细胞深低温保存后的生物学活性研究

目的探讨深低温保存角膜缘上皮细胞的可行性和效果。方法将兔角膜缘组织培养出的细胞,分别用两组冷冻保护液冻存,0.5、1、2个月后分批取出。将未冷冻的细胞和不同冻存时间、不同冻存保护液的冷冻复苏后细胞传代培养,采用免疫组化、电镜鉴定培养后细胞的性质。通过倒置显微镜、电镜、MTT比色法来比较传代培养的角膜缘上皮细胞深低温保存前后的形态结构和生物学活性。结果AE1和传代细胞鼠抗兔增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体染色呈阳性反应,AE5单克隆抗体染色偶见阳性反应;冻存后的传代细胞贴壁、生长均滞后,而且电镜检查均有不同程度细胞水肿,再培养7d后形态结构均恢复正常;MTT法检测复苏当天冻存后的细胞比未冻存的细胞增殖活性低,差异显著(P<0.05,但培养5d后无显著差异(P>0.05),甘油组和DMSO组间有显著性差异(P<0.05),不同冻存时间的各冻存组测得值无显著差异(P>0.05)。结论冻存的角膜缘上皮细胞传代培养仍保持上皮细胞特性并含有干细胞;DMSO保护液比甘油液低温保存效果好;角膜缘上皮细胞经阶段降温后深低温保存简单可行,选择适当的冷冻保护剂冻存后的细胞再培养,其细胞活性和结构与原代相似。     

低温冷冻对角膜缘干细胞生物学特性的影响

目的 评价低温冷冻保存对体外培养兔角膜缘干细胞生物学特性的影响.设计实验研究.研究对象新西兰白兔.方法 新西兰白兔20只（40眼）,制备2 mm周边角膜和2 mm球结膜的环形浅层角膜缘植片,待形成细胞单层后,将培养的细胞低温冻存1个月,然后复苏培养.将未冻存的细胞和冻存复苏后的细胞采用免疫细胞荧光染色、流式细胞仪检测,鉴定培养细胞的生物学特性,通过倒置显微镜、MTT比色法比较传代培养的角膜缘干细胞低温保存前后的形态结构和特性.主要指标角膜缘干细胞活性及生物学特性.结果 显微镜下观察冻存复苏后的细胞,与未冻存细胞相比,细胞状态差,贴壁时间晚,核浆比变小,形态不规则;免疫荧光细胞染色检测ABCG2单克隆抗体阳性率未冻存细胞为81.7%,低温冻存细胞降至46.9%,差异有统计学意义（P〈0.05）;流式细胞仪检测低温冻存细胞与未冻存细胞角膜缘干细胞占总细胞的比例分别为0.90%和2.43%,差异有统计学意义（P〈0.05）;MTT法检测低温冻存的细胞比未冻存细胞增殖活性降低,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 低温冻存后角膜缘干细胞的活性和生物学特性均受到严重影响,其冻存方法和复苏技术有待进一步改进.     

体外培养的晶状体上皮细胞株的确定及生长、分化规律

目的建立牛、兔、人晶状体上皮细胞的体外培养，进一步认识晶状体上皮细胞生长、分化规律。方法应用组织块培养方法进行３种晶状体上皮细胞的体外培养，经Ｇｉｍｓａ染色，在倒置显微镜下对培养的晶状体上皮细胞的生长、分化规律进行观察。结果培养至６ｗｋ的人胎儿晶状体上皮细胞中有特征性的“晶状体小体”形成；牛、兔晶状体上皮细胞去分化是发生在第３代，而人晶状体上皮细胞在第４代开始出现去分化；它们传代至第８代时生长都趋于停止，出现老化表现；来自人的晶状体上皮细胞生长增殖率与年龄呈负相关关系（ｒ＝－０．９９６）。结论“晶状体小体”的形成可作为确定晶状体上皮细胞株的一项特征性依据，而体外培养的人、牛、兔晶状体上皮细胞具有相同的有限生长潜能，在相同的条件下，牛、兔晶状体上皮细胞的生长增殖速度比人晶状体上皮细胞快，但易于发生去分化；此外，人晶状体上皮细胞的生长增殖率与年龄密切相关，年龄越小，晶状体上皮细胞的生长增殖速度越快。     

Cytotoxic effects of antiproliferative agents on human retinal glial cells in vitro

Purpose: Proliferative vitreoretinopathy (PVR) is characterizedby the formation of cellular membranes on the detached retina and also in the vitreous. Glial cellscan be found in epiretinal and subretinal membranes from eyes with PVR, proliferative diabeticretinopathy (PDR), idiopathic macular pucker, uveitis and other diseases affecting theretina. Proliferation and contraction of glial cells appears to play a role in the pathogenesisof PVR. This study is designed to inspect the effectiveness of harringtonine, as well as colchicine,daunomycin and fluorouracil, against cellular proliferation of cultured human retinal glial cellsthat might be involved in the retinal and/or vitreous proliferation. Methods: Cultures of human retinal glial cells were preparedusing the enzyme digesting method. Cells that had been in culture for 2–5 passages were usedin this study. Harringtonine (0.063 g/ml 2.0 g/ml), colchicines(0.5 g/ml 16.0 g/ml), daunomycin (0.1 g/ml 3.2 g/ml) and 5-fluorouracil(0.5 g/ml 16.0 g/ml) were added to cultures of human retinal glial cellsand the proliferation rates of the cells were measured by the MTT method. Results: Harringtonine at the dosage of 0.063 g/mlinduced suppression of cellular growth, but the changes were not statistically significant (p > 0.05).At a dosage ranging from 0.125 g/ml to 2.0 g/ml, harringtonine significantly suppressedcellular growth according to the test (p < 0.01). Likewise, other antiproliferativeagents inhibited cellular growth significantly at a dosage from 1.0 g/ml to 16.0 g/ml(colchicine), 0.2 g/ml to 3.2 g/ml (daunomycin) and 1.0 g/ml to 16.0 g/ml(5-fluorouracil), but not at 0.5 g/ml (colchicine), 0.1 g/ml (daunomycin) and0.5 g/ml (5-fluorouracil). The ID₅₀ were 0.33 g/ml (harringtonine), 3.11 g/ml (colchicine), 0.79 g/ml (daunomycin) and 5.23 g/ml (5-fluorouracil), respectively.Conclusions: Harringtonine was extremely effective ininhibiting human retinal glial cell proliferation, like other antiproliferative drugs such as colchicine,daunomycin and 5-fluorouracil. Harringtonine, therefore, may be a candidate for further studies regardingthe treatment of experimental PVR.     

曲尼司特对培养兔晶状体上皮细胞的作用

目的 观察曲尼司特(Tranilast)对培养兔晶状体上皮细胞增殖的作用及其对细胞周期的影响。方法 将传代的兔晶状体上皮细胞用含不同曲尼司特浓度的培养液培养，每天计数，绘制细胞生长曲线，收集细胞做流式细胞仪检查。空白培养液培养的细胞做阴性对照，含0．004％丝裂霉素C(MMC)培养液培养的细胞为阳性对照。结果 用180μmol／L的培养液培养细胞时细胞增殖明显受到抑制，随药物浓度增加，细胞增殖受抑制越明显，细胞生长曲线越低平，细胞形态变化不大。经流式细胞术进行细胞周期分析，随药物浓度增加G0／G1期细胞数增多(67．47％～79％)，而S期细胞数减少(21．19％～4．32％)。阳性对照组细胞于48h全部死亡。结论 曲尼司特具有抑制晶状体上皮细胞增殖的效果，且呈浓度依赖性。曲尼司特将细胞抑制在G1期的限制点内。     

Magnetic attraction of iron-endocytosed corneal endothelial cells to Descemet's membrane

PURPOSE: To evaluate the feasibility of a novel method of magnetic attraction of iron-endocytosed corneal endothelial cells to Descemet's membrane. METHODS: Cultured rabbit corneal endothelial cells (RCEC) were exposed to spherical iron powder at various concentration ranging 0-100 micro moll(-1). After 24hr, the cell density and morphology were evaluated. RCEC that had been exposed to spherical iron powder (RCEC-iron), were trypsinized and poured onto a culture dish where a neodium magnet was fixated paracentrally. After 24hr, the cell density was measured at the areas with and without a magnet. Rabbits' corneas were cryo-injuried to detach corneal endothelial cells and 1x10(5)/200 micro l RCEC-iron were injected into the anterior chamber. Neogium magnet was fixed on the lid for 24hr to attract RCEC to Descemet's membrane. Each operated eye was observed up to 2 months after the injury. RCEC group (rabbits with cryo-injury and injection of normal cultured RCEC) and cryo group (rabbits with cryo-injury but without injection of RCEC) served as controls. RESULTS: The RCEC-iron density on the dish decreased in the medium containing iron powder of 10 micro moll(-1) or more. When RCEC had been exposed to iron powder of between 5 and 10 micro moll(-1), the ratio of RCEC in the field with a magnet to RCEC in the field without a magnet increased. In the RCEC-iron group, the mean corneal thickness gradually decreased and was significantly less than in the other two groups at 2, 4, and 8 weeks after the cell injection. Fluorescein microscopic examination showed a monolayer of DiI-labelled cells on the Descemet's membrane. CONCLUSION: Magnetic attachment of iron-endocytosed corneal endothelial cells to Descemet's nembrane can be a method of choice for corneal endothelial decompensation.     

尾静脉注射碘酸钠对小鼠视网膜形态结构变化的影响

目的　探讨尾静脉注射碘酸钠（NaIO₃）对小鼠视网膜形态结构的影响。方法　36只昆明小鼠分为4组:对照组、损伤3 d组、损伤7 d组、损伤14 d组。对照组不作任何处理，各损伤组小鼠经尾静脉单剂量注射NaIO₃（35 mg?kg^-1）。在NaIO₃损伤3 d、7 d、14 d后取材，进行视网膜组织铺片和组织切片。利用HE染色、NeuN免疫组织化学染色及 Opn1mw、GFAP、Iba1免疫荧光染色，检测NaIO₃注射后不同时间小鼠视网膜形态结构的改变。结果　HE染色结果显示，损伤3 d后外核层每10 μm长度细胞数由正常水平（31.97±2.27）个下降至（26.21±0.83）个，差异有统计学意义（P<0.05）；损伤7 d后内核层每10 μm长度细胞数由正常水平（12.33±0.16）个下降至（11.39±0.43）个，差异有统计学意义（P<0.05）。NeuN染色结果显示，损伤14 d后视网膜神经节细胞层每100 μm长度视网膜神经节细胞数由正常水平（14.92±1.74）个下降至（11.25±0.09）个，差异有统计学意义（P<0.05）。GFAP染色结果显示，损伤3 d组每200 μm × 200 μm 范围内活化的Müller细胞数由对照组的（16.96±0.85）个增加至（20.42±1.64）个，差异也有统计学意义（P<0.05）。Opn1mw、Iba1染色结果显示，损伤后视网膜视锥细胞外节段变薄、小胶质细胞数增加。结论　尾静脉注射NaIO₃会引起小鼠视网膜形态结构不可逆的损伤，且该损伤具有时间依赖性。     

兔角膜内皮、上皮及基质细胞体外培养扩增的研究

目的 建立角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养扩增的简单稳定的方法，为组织工程化角膜的构建提供种子细胞。方法 内皮细胞与后弹力层在培养基中孵育后消化法获原代细胞，胰酶消化去除表层上皮后取角膜缘，组织块法培养角膜缘上皮细胞，基质细胞应用胶原酶消化法获原代培养，各细胞融合后胰酶消化依次传代培养。结果 原代内皮细胞4—5d融合成单层细胞，可连续传6—7代。上皮细胞1周左右生长融合，连续传3—4代后细胞形态改变。基质细胞接种6—7d后近融合，传代后增殖明显，可连续传10代。结论依据角膜组织特征选择合适的方法体外分离、培养角膜3种细胞成分，可获连续传代扩增的角膜细胞。     

Socioeconomic and Ethnic Disparities in Periocular Cutaneous Malignancies

ABSTRACT

Cutaneous malignancies make up the majority of periocular tumors diagnosed and treated by ophthalmologists. In this review, we examine literature regarding ethnic and socioeconomic disparities in incidence and clinical outcomes of the three most common cutaneous periocular tumors: basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma, and melanoma. In all three tumor types, the literature shows an increased incidence among two groups: those with lightly pigmented skin and those of higher socioeconomic status. While incidence is high in these groups, clinical outcomes for these patients tend to be good. Those with lower socioeconomic status and ethnic minorities, on the other hand, have a low incidence but are more likely to have poor clinical outcomes. These disparities are likely the result of both biologic and behavioral differences between patients and could provide opportunities for intervention to change risk perception and improve outcomes.     

正常人结膜杯状细胞的体外培养

目的体外建立人结膜杯状细胞系,观察其形态结构等生物学特征,并观察杯状细胞超微结构。设计实验性研究。研究对象体外培养的人结膜杯状细胞。方法外眼手术中取正常球结膜组织,放入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中,以组织块培养法进行培养。通过倒置相差显微镜下细胞形态、特殊组化染色和免疫组化方法鉴定杯状细胞。利用透射电镜观察其超微结构。主要指标细胞形态、结构。结果培养24小时后细胞从组织块向外长出,6￣10天后可形成细胞单层,并可传3￣5代。倒置相差显微镜下可见杯状细胞呈长椭圆形,胞浆中含有黏蛋白颗粒。对阿利新蓝/过碘酸-希夫试剂染色(AB-PAS染色)呈阳性;对杯状细胞特异性中间丝角蛋白-7(CK-7)和黏蛋白MUC5AC单克隆抗体均呈阳性反应,而对复层非角化上皮细胞特异性中间丝角蛋白-13(CK-13)呈阴性反应。透射电镜下可见离体杯状细胞体积较大,呈长椭圆形,核位于细胞一端,胞浆中充满圆形黏蛋白颗粒,大小不一。传三代后杯状细胞纯度可达80%左右。结论人结膜杯状细胞可在体外培养并传代,并保持在体细胞特性,为进一步研究杯状细胞相关的眼表疾病提供实验室基础。(眼科,2006,15:172-176)     

Amacrine and horizontal cell dysfunction in adult ceroid-lipofuscinosis (Kufs disease) and anatomical correlates in the ovine model

Psychophysical examination of the visual performance of a patient with Kufs disease suggests abnormal functioning of the amacrine and horizontal cell systems of lateral inhibition. The sheep model offers insight into early patho-physiology of these cell types.