成年大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的分离、培养与鉴定

目的　在嗅球成鞘细胞 (OECs)移植到脊髓可有助于损伤神经纤维再生的基础上 ,分别对嗅球和嗅粘膜的OECs进行培养 ,探索自体嗅粘膜作为OECs供体的可能性。　方法　根据OECs、成纤维细胞和星形胶质细胞贴壁时间的不同 ,采用差时贴壁方法分离出OECs,培养 14div后进行NGFRp75和GDNF的免疫细胞化学染色。　结果　按形态学和免疫组织化学特性 ,培养的嗅球和嗅粘膜OECs可分为 3类 :双极细胞、三级细胞和扁圆细胞 ,其中以双极细胞最多。嗅粘膜的双极成鞘细胞的突起更加细长。　结论　差时贴壁细胞分离法是一种简单、经济、实用的成鞘细胞分离方法。鼻腔嗅粘膜OECs的形态学和免疫细胞化学特性与嗅球OECs基本相同 ,本实验为临床开展自体嗅粘膜OECs修复脊髓损伤的研究提供参考     

成年大鼠嗅黏膜嗅成鞘细胞的纯化

嗅成鞘细胞(OECs)是一种独特的中枢神经胶质细胞,分布于嗅球和鼻腔嗅黏膜,可分泌多种生物活性物质,现已证明来自嗅球的OECs与来自鼻腔嗅黏膜的OECs形态学特征与免疫组织化学性质是一致的,且都具有促进中枢神经系统轴突再生的作用。目前用于移植的OECs多数取材于嗅球,由于嗅黏膜OECs在自体取材上有着方便、快捷和安全性的特点,     

大鼠嗅鞘细胞体外培养及免疫组化研究

目的：建立体外纯化培养嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的稳定方法并观察培养嗅鞘细胞（OECs）形态学特征。方法：原代培养成年雄性SD大鼠嗅球的嗅神经层和颗粒层中提取的OECs，利用差速贴壁和阿糖胞苷（Ara-c）抑制法除去混杂的成纤维细胞和星形胶质细胞以获得纯化的OECs。用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs，计算纯化度。结果：此方法获得的OECs纯度可达93％以上。OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主，或无突起呈“煎蛋样”，随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性。结论：此方法稳定易复制，可获得高纯度的OECs。     

嗅鞘细胞移植治疗脊髓损伤的研究进展

脊髓损伤是一种严重威胁人类健康的疾病，可致损伤平面以下的运动、感觉及植物神经功能障碍，其治疗一直是神经科学领域研究的难点与热点。众多研究表明，脊髓内细胞移植是具有里程碑意义的治疗策略，为严重脊髓损伤的治疗提供了新方法。其中，可用于移植的细胞主要有神经干细胞、雪旺细胞、少突胶质细胞、嗅鞘细胞等。所有这些细胞中嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的治疗效果最佳，它是一种特殊的大型神经胶质细胞，兼具中枢神经系统星形胶质细胞和外周雪旺细胞的双重特性，具有促进轴突再生和髓鞘化的能力，被许多学者认为是最理想的移植细胞，有可能在脊髓损伤的治疗上取得突破。本文就OECs移植治疗脊髓损伤的研究进展作综述如下。     

原代培养大鼠嗅球成鞘细胞Nogo(N-18)的共聚焦激光扫描显微镜观察

目的 观察原代培养的成年大鼠嗅球成鞘细胞(OECs)Nogo(N-18)蛋白的表达，探讨Nogo与成鞘细胞促进神经再生作用的关系。方法 原代培养嗅球OECs，采用免疫组织化学和双标免疫荧光细胞化学技术，结合激光共聚焦扫描显微镜观察。结果 原代培养的嗅球OECs的Nogo(N-18)免疫细胞化学反应呈阳性，Nogo(N-18)蛋白主要分布于胞浆，而在胞膜及突起分布较少。结论 嗅球(OECs)含有Nogo—A蛋白，提示Nogo-18蛋白在嗅神经系统可能没有决定抑制轴突再生的作用。     

嗅成鞘细胞在新生大鼠嗅球的分布

中枢神经系统(CNS)内的胶质微环境是导致再生失败的重要因素。嗅觉神经元(olfactory sensory neurons,OSNs)具有终生再生的能力,因此嗅觉系统成为研究神经发生和轴突生长迁移的良好模型。嗅成鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)是决定OSNs轴突能够终生再生的关键因素。周长满等对成年大鼠嗅成鞘细胞的分布进行了研究。     

不同来源嗅鞘细胞的生长特性和生物学活性观察

目的探讨来源于乳鼠嗅球与成年大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞（OECs）生长特性和生物学活性的区别，为临床应用不同来源OECs提供理论支持。方法选取成年SD大鼠嗅粘膜和乳鼠嗅球的OECs，通过原代培养，在不同时间观察细胞形态和生长趋势，测定培养细胞上清中神经营养因子一Ⅲ（NT-3）的含量。结果培养出相应OECs，同时期源自乳鼠嗅球OECs细胞活性高于嗅粘膜OECs，进入平台期后二者生物学活性一致。结论不同来源的OECs生长特性有差别，但其生物学活性一致。     

嗅鞘细胞与神经细胞体外共培养的研究进展

嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)分布于嗅球和嗅上皮基底膜,同时具有中枢神经系统星形胶质细胞和周围神经系统雪旺细胞特性,其生物学功能极为广泛.近年研究证实OECs具有支持和促进多种神经元存活和轴突再生的作用,目前已被广泛应用于中枢神经系统损伤的修复[1,2].     

成人、成年狗鼻腔嗅黏膜成鞘细胞的纯化、培养与鉴定

目的研究成人和成年狗嗅黏膜成鞘细胞（OECs）的分离与培养的方法,为探索在人体和大型动物模型的自体嗅黏膜OECs移植修复脊髓损伤奠定基础。方法采用差速贴壁方法分别从成人和成年比格狗的嗅黏膜分离出OECs,分别培养25d,在第6d、10d和25d进行形态学观察,最后进行OECs特异标记物NGFRp75的免疫细胞化学染色,鉴定成鞘细胞。结果原代培养的成人和成年狗嗅黏膜OECs在培养10d后明显增多,25d的OECs成熟,具有很长的突起,其形态多为双极和三极,NGFRp75的免疫组织化学染色呈阳性。本实验条件下,狗嗅黏膜OECs的生长状态比成人的好。而未进行差速贴壁的培养细胞则几乎均呈成纤维样细胞。结论差速贴壁的方法可以分离出较为纯化的成人、成年狗鼻腔嗅黏膜OECs。     

人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞的原代培养和免疫组化观察

目的 建立人鼻腔嗅粘膜嗅鞘细胞（OECS）的体外培养方法。方法 利用鼻窦镜选取上鼻甲嗅区粘膜，原代培养嗅鞘细胞，进行形态学观察。结果 成功培养出人鼻腔嗅粘膜OECs，为扁平的双极、多极形态，对P75、GFAP呈阳性反应，纯度在50％左右。结论 人鼻腔嗅粘膜培养OECs的方法实用可行，但须在取材部位和纯化方面进一步探讨。     

嗅球成鞘细胞的移植能够促进中枢神经再生

嗅球成鞘细胞 (olfactoryensheathingcells,OECs)不同于星形胶质细胞 ,也不同于Schwann细胞 ,是性质独特的单独一类胶质细胞。实验证实 ,它的移植对中枢神经的再生有很好的促进作用 ,这使中枢神经的再生又有了一个新的研究思路。国外学者对它的特性、功能等方面做了一些探讨 ,并取得了一定的成绩 ,我们对此做了一个较全面的综述     

碱性成纤维细胞生长因子对成年大鼠嗅黏膜成鞘细胞增殖的影响

目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对于纯化后的嗅黏膜成鞘细胞(OECs)增殖的促进作用,探讨嗅黏膜OECs的增殖特性。方法 应用差速贴壁和酶消化法对原代培养的嗅黏膜OECs进行纯化,用BrdU掺入法观察bFGF对嗅黏膜OECs增殖率的影响。结果 在没有特定刺激因子作用时,嗅黏膜OECs本身有一定的增殖率,而加入10μg／L的bFGF对嗅黏膜OECs有一定的促增殖作用。结论 在体外培养条件下,bFGF能提高嗅黏膜OECs的增殖率。     

一种新颖的神经胶质细胞-嗅鞘细胞

嗅鞘细胞(OECs)移植治疗脊髓损伤(SC I)已显示出良好的应用前景,不同来源的OECs体外培养时,在不同发育阶段和不同生长环境中具有不同的生物学特性。OECs具有特异性的标志蛋白,如S-100、p75NTR、GFAP等。体外培养的OECs分泌NGF、BDNF、NT-3/4、GDNF等多种促进神经细胞生长、分化和神经纤维再生的神经营养因子。将OECs植入脊髓损伤部位,该细胞能分裂增殖,并可抑制胶质瘢痕的形成,拮抗Nogo等神经再生抑制性因子的活性,包绕再生轴突形成髓鞘。由于OECs具有上述独特的生物学功能,被认为是继神经干细胞和雪旺氏细胞之后可用于移植治疗脊髓损伤的一种新颖的神经胶质细胞。     

大鼠嗅球和鼻腔嗅粘膜成鞘细胞的形态学研究

目的：观察大鼠嗅神经成鞘细胞在嗅球和嗅粘膜的分布及其形态学结构特征，研究其与中枢神经再生的关系。方法：Luxol固蓝染色、Mallory染色和NGFRp75免疫组织化学染色结合透射电镜观察。结果：在嗅球纤维层的成鞘细胞随神经纤维呈纵向排列，在嗅小球层的成鞘细胞则围绕着嗅小球环行排列。在嗅粘膜的成鞘细胞位于柱状上皮深方，沿基底膜分布。成鞘细胞的胞体为细长梭形，有较长的突起，细胞核呈圆形或椭圆形。在嗅小球周围或嗅粘膜内的成鞘细胞呈NGFRp75免疫反应阳性。在电镜下，嗅球成鞘细胞的纵断面上可见其胞体呈长梭形，细胞核为不规则形，核仁清晰。在胞体的周围有大量的平行神经纤维纵向排列，在放大的横断面上，可见在1个成鞘细胞的细胞核周围有数根神经纤维被胞质包裹在一起。结论：嗅成鞘细胞是一种特殊的胶质细胞，分布于嗅球的纤维层、嗅小球层和嗅粘膜内。嗅神经成鞘细胞的胞体细长，有较长突起，其轴系膜紧密包裹成束的无髓神经纤维。     

嗅鞘细胞移植实验性自身免疫性脑脊髓炎后髓鞘碱性蛋白的表达和小胶质细胞的捕获

目的:研究嗅鞘细胞(OECs)移植实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)后髓鞘碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)的表达及小胶质细胞捕获OECs情况。方法:用新生近交系Wistar大鼠嗅球培养出OECs,经荧光染料羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记后注入同系EAE Wistar大鼠侧脑室,免疫组化检测OECs髓鞘碱性蛋白(MBP)、单核巨噬细胞诱导分子1(ED1)和CFSE共表达情况。结果:培养OECs不表达MBP,经侧脑室移植后在EAE大鼠脑内出现多量MBP+CFSE+细胞,同时在大脑广泛区域及血管周围间隙出现多量ED1+CFSE+细胞,与对照组相比差异显著。结论:OECs在EAE环境下表达MBP分子,其抗原能被脑内小胶质细胞或巨噬细胞捕获。     

运用无胰酶植块法培养大鼠嗅鞘细胞的研究

目的:探讨无胰酶植块法进行大鼠嗅鞘细胞(OECs)培养对OECs形态特征的影响。方法:选用妊娠14 d左右的SD雌性大鼠,取出其胎鼠,剥离嗅球,剪碎组织,分别用常规培养法无胰酶植块法分离OECs,用含15%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基培养嗅鞘细胞,免疫荧光染色检测p75神经生长因子受体(p75 NGFR)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,同时测量OECs轴突的长度。结果:无胰酶消化的OECs克隆团处有大量的OECs向外延伸,分离单个OECs发现与常规培养法相比,其神经细胞轴突显著伸长;常规培养法可获取1.04×10⁷个细胞,无胰酶植块法可获取3.09×10⁷个细胞。结论:无胰酶植块法可获取大量的OECs,且OECs的轴突较长。     

经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞

目的:采用经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜嗅鞘细胞(OECs),以探求更加简单、高效的嗅黏膜OECs取材和培养纯化方法.方法:成年雄性SD大鼠6只,采用经改良的方法剥取嗅黏膜,然后用改良差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs.倒置相差显微镜下观察细胞生长情况以及形态并照相,培养7 d、14 d细胞行NGFRp75免疫细胞化学染色鉴定,并根据免疫细胞化学染色结果计算细胞纯度.结果:体外培养的嗅黏膜OECs形态主要有扁圆形或油煎蛋形、梭形或双极、多突起形.嗅黏膜OECs NGFRp75免疫细胞化学染色阳性.培养7 d嗅黏膜OECs纯度为90%,培养14 d嗅黏膜OECs纯度为85%.嗅黏膜OECs最长可以存活35 d.结论:经改良的取材和差速贴壁法培养纯化嗅黏膜OECs具有简单、高效的优点,培养的嗅黏膜OECs的纯度完全可以达到细胞移植的要求.     

成年大鼠嗅粘膜细胞原代培养及形态学研究

为了探讨大鼠嗅粘膜嗅鞘细胞(OECs)的分离与纯化培养方法并对其形态学进行研究,我们自鼻腔嗅粘膜取材后采用差速贴壁、机械刮除和阿糖胞苷(Arac)抑制相结合的纯化培养方法培养嗅粘膜细胞,并分不同阶段进行镜下观察及p75NGFR和GFAP免疫组化染色鉴定。结果显示,自嗅粘膜组织可以培养出四种细胞:梭形细胞、双极细胞、窝形细胞和大细胞。其中大部分梭形和双极细胞呈p75NGFR或GFAP免疫反应阳性,属于OECs。结果提示本文介绍的培养方法可以培养出嗅粘膜OECs;差速贴壁、机械刮除和Arac抑制相结合方法可纯化OECs。     

GDNF、GFAP和NGFRp75在成年大鼠和金黄地鼠嗅球成鞘细胞的免疫组织化学研究

目的　研究GDNF在成年大鼠和金黄地鼠嗅球成鞘细胞的表达 ,探索成鞘细胞在中枢神经再生中的作用。　方法　用免疫组织化学ABC法 ,显示GDNF在成年大鼠和金黄地鼠嗅球成鞘细胞的表达和分布 ,同时用NGFRp75和GFAP染色作为阳性对照。　结果　在成年大鼠和金黄地鼠嗅球的纤维层和小球层内均可见深棕色的GDNF免疫组织化学反应的成鞘细胞。在小球层与纤维层分界处和小球层与分子层分界处及嗅小球之间密集分布 ,在嗅小球之内较稀疏。同时在同一嗅球组织的另两组切片的相同部位 ,分别出现GFAP和NGFRp75免疫反应性细胞 ,间接说明GDNF免疫反应的结构是嗅球成鞘细胞。　结论　嗅球成鞘细胞含有胶质细胞源性神经营养因子     

嗅成鞘细胞移植与甲基强的松龙联合应用对急性脊髓损伤大鼠功能恢复和Nogo-A表达的影响

目的:探讨嗅成鞘细胞(OECs)移植联合应用甲基强的松龙(MP)对急性脊髓损伤大鼠神经功能恢复及Nogo-A表达的影响.方法:自新生SD大鼠嗅球取材,纯化培养嗅成鞘细胞;建立大鼠脊髓挫伤模型,术后1、 3、 7、 14d,参照BBB法进行各组神经功能检测,取脊髓组织,免疫组织化学及RT-PCR法检测Nogo-A表达.结果:OECs组和MP组在7、14d BBB评分高于SCI组,但低于OECs+MP组;免疫组织化学和RT-PCR显示:在3、7、14d,OECs组和MP组Nogo-A的表达量与SCI组相比,均呈明显下调;但其下调Nogo-A效应低于OECs+MP组.结论:OECs移植联合应用MP可明显改善大鼠急性脊髓损伤后神经功能恢复,其机制部分与下调Nogo-A表达有关;OECs移植与MP联合应用在促进SCI后神经功能恢复方面要优于单独使用OECs或MP,两者之间可能存在协同效应.